專利名稱：新城疫病毒rNDV-H₅2AH₉及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，拯救一株以新城疫病毒為載體共表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9，用于研制疫苗。
背景技術(shù)：
反向遺傳操作技術(shù)(Reversegenetics manipulation technique)是指通過(guò)在體外構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來(lái)組裝新的RNA病毒的一項(xiàng)研究技術(shù)[Rdmer-Oberddrfer A, Mundt E, Mebatsion T, Buchholz UJ, MettenleiterTC.Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J GenVirol 1999.80(11):2987— 95.]，也叫“病毒拯救”。由于最終“拯救”出的RNA病毒來(lái)源于cDNA克隆，因此，可通過(guò)中間過(guò)程中人為加入的DNA環(huán)節(jié)，在DNA水平上對(duì)RNA病毒基因組進(jìn)行各種體外人工改造，解決了 RNA病毒基因組難以操作這一難題，同時(shí)為新型疫苗的研制和開(kāi)發(fā)提供了新的思路[Nakaya T, et a1.Recombinant Newcastle disease virus as avaccine vector.Journal of Virology, 2001.75 (23):p.11868-73.] 新城疫(ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一，新城疫病毒(NDV)基因組全長(zhǎng)約15kb，其結(jié)構(gòu)為3 ' -NP-P-M-F-HN-L-5丨，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein, NP)、憐蛋白(Phosphoprotein, P)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein, HN)和大分子蛋白(Large protein, L)。從近十年來(lái)的ND流行特點(diǎn)來(lái)看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數(shù)屬于基因VII型強(qiáng)毒株[LiuXF, Wan HQ, Ni XX, et al.Pathotypical and genotypical characterization of strainof Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in someregions of China duringl985-2001.Archives of Virology, 2003, 148(7):1387-1403.],而常規(guī)的ND疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、LaSota等)，在遺傳距離上與當(dāng)前分離株相差較遠(yuǎn)。禽流感病毒(AvianInfluenza Virus,AIV)屬于正粘病毒科(Orthomyxovoridae)中的A型流感病毒屬，病毒基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單股RNA片段組成。該病毒感染禽類的癥狀從輕度上呼吸道感染、產(chǎn)蛋量降低，直至急性全身致死性疾病?；蚪M分為8個(gè)片段，是負(fù)義的單股RNA，片段I 8由大到小依次命名為PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。根據(jù)表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同劃分亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)了 16種HA和9種NA亞型，HA蛋白是禽流感病毒的主要保護(hù)性抗原，它不僅誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，而且誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。目前H5N1亞型禽流感 病毒在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失，呈現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)也威脅著人類的健康，是重要的人畜共患病病原。H9亞型禽流感病毒長(zhǎng)期以來(lái)困擾養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，H9N2是目前亞洲的流行主型之一，廣泛存在于家禽中，雖然表現(xiàn)低致病性，但由于傳播廣泛、能造成免疫抑制使宿主易發(fā)生繼發(fā)感染、產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋下降、發(fā)病率高，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，并具有重要的公共衛(wèi)生意義。疫苗接種是防制這兩種疾病的主要有效手段。常規(guī)疫苗具有耗時(shí)費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。重組活載體疫苗能達(dá)到一針?lè)蓝嗖〉男Ч?，且?jié)約成本，省時(shí)省力，適合于大規(guī)模免疫。載體病毒最重要的一個(gè)特點(diǎn)是能被用來(lái)迅速研制出針對(duì)新發(fā)高致病性傳染病的基因工程疫苗。NDV除具備這一特點(diǎn)外，還具有遺傳穩(wěn)定性好、不存在與細(xì)胞基因組整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，可作為疫苗載體[Bukreyev A, Skiadopoulos MH, Murphy B R, et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology, 2006, 80 (21): 10293-10306.] 在 NDV 基因組內(nèi)插入禽流感病毒HA基因后的重組病毒，可在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)HA蛋白，用此重組病毒作為疫苗，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)Al和ND的雙重免疫保護(hù)力[Veits J, Wiesner D, FuchsWj et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protectschickens against Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad SciU S A, 2006, 103(21):8197-8202.Schroer Dj Veits Jj Grund C，et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7 avian influenza virus[J].Avian Dis，2009，53 (2):190-197.]2007年，葛金英等報(bào)道了以NDV LaSota株為載體，將一株H5N1 HPAIV的HA基因插入NDV基因組的P、M基因之間，重組病毒接種雞能夠同時(shí)抵抗速發(fā)型新城疫病毒以及同源和異源高致病性禽流感病毒的攻擊，接種BALB/c小鼠也能夠激發(fā)抗流感保護(hù)性免疫[Ge J, Deng G, Wen Z, et al.Newcastle disease virus-based live attenuatedvaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge ofhomologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses [J].Journal ofVirology, 2007，81 (I): 150-158.]。該重組疫苗已于2005年12月23日在中國(guó)正式批準(zhǔn)生產(chǎn)，對(duì)中國(guó)乃至世界禽流感和新城疫防控起到積極推動(dòng)作用，對(duì)人用新型禽流感疫苗的研制也具有重要的借鑒意義。但目前尚無(wú)同時(shí)插入兩個(gè)HA基因的相關(guān)報(bào)道。HA基因在NDV基因組的插入位置一般選擇在P、M之間或者F、HN基因之間[Nakaya Tj Cros Jj Park M S，et al.RecombinantNewcastle disease virus as a vaccine vector[J].Journal of Virology, 2001, 75(23):11868-11873.Ramp K，Skiba M，Karger A，et al.1nfluence of insertion site of theavian influenza virus haemagglutinin(HA) gene within the Newcastle disease virusgenome on HA expression [J].J Gen Virol，2011，92 (Pt2): 355-360.]。Ramp K 等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明NDV基因組可以同時(shí)容納總長(zhǎng)度超過(guò)3500bp的兩個(gè)外源基因，對(duì)復(fù)制無(wú)明顯不利影口向[Ramp K, Veits J，Deckers Dj et al.Coexpression of Avian Influenza Virus H5and NI by Recombinant Newcastle Disease Virus and the Impact on Immune Responsein Chickens[J].Avian Diseases，2011，55 (3):413-421.]。連接肽可以同時(shí)連接多個(gè)基因并且保證多基因的協(xié)同表達(dá)?？谔阋卟《?Footand mouth disease virus ，F(xiàn)MDV) 2A是自剪切多肽的典型代表。在兩個(gè)HA基因之間引入口蹄疫病毒具有自剪切功能的多肽2A序列(Self-cleaving 2A peptide)，使兩個(gè)HA蛋白同步表達(dá)，且蛋白性質(zhì)基本不發(fā)生改變，避免了融合基因中兩基因由于空間的障礙而影響某個(gè)基因活性的可能，是構(gòu)建單載體表達(dá)多蛋白的理想工具之一 [de Felipe P,Luke G A，Hughes L E, et al.Co-translational, intraribosomal cleavage of polypeptides bythe foot-and-mouth disease virus 2A peptide [J].J.Biol.Chem., 2003, 278:11441 —11448.]。2011年胡增壘等經(jīng)反向遺傳技術(shù)獲得了基因vn型新城疫病毒致弱毒株NDV/AI4，效價(jià)高達(dá) IOlog2 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al.Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis 2011，55 (3): 391-397.]。含有H5亞型禽流感病毒流行株1117株HA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PHW_HA[張妍等.clade2.3.2 H5N1亞型禽流感疫苗候選株的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).2012, 43 (6):915-921.]及H9N2亞型禽流感病毒流行株SD12E均由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存。因此，本專利以新城疫病毒致弱株AI4為載體，構(gòu)建可同時(shí)表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，以預(yù)防當(dāng)前禽流感和新城疫流行株的感染。

發(fā)明內(nèi)容
新城疫和禽流感是當(dāng)前困擾我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的兩大重要疫病。H5N1亞型禽流感是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的高度致死性疾??；H9亞型禽流感雖然表現(xiàn)為低致病性，但發(fā)病率高，常呈混合感染，引起免疫抑制，減少產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種以新城疫病毒為載體共表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，從而解決當(dāng)前基因Vn型新城疫病毒、H5和Η9亞型禽流感病毒流行情況復(fù)雜、所用疫苗多而雜等問(wèn)題，起到一針?lè)蓝嗖〉男Ч?。一株新城疫病?Newcastle Disease Virus) rNDV_H52AH9,它的保藏號(hào) CGMCC No:6654。所述新城疫病毒rNDV-H52AH9用于同時(shí)等量表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒的HA蛋白。新城疫病毒致弱株AI4為基因VII型，與我國(guó)當(dāng)前NDV流行株的基因型一致；所插入的兩個(gè)HA基因在遺傳進(jìn)化上均來(lái)源于H5和H9亞型AIV的流行毒株。因此，重組疫苗株rNDV-H52AH9在控制當(dāng)前禽流感和新城疫的發(fā)病、流行方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種以新城疫病毒為載體共表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9的構(gòu)建方法:是利用已建立的致弱的鵝源新城疫病毒AI4株的反向遺傳操作平臺(tái)，將H5N1亞型禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/1117/2011 株的 HA 基因與 H9N2 亞型禽流感病毒 A/Chicken/Shandong/12E/2010株的HA基因通過(guò)FMDV的2A序列串聯(lián)在一起后插入轉(zhuǎn)錄載體pNDV/AI4的P、M的基因間隔區(qū)，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pNDV/AI4-H52AH9，轉(zhuǎn)染后，獲得了具有較高繁殖性能的共表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒HA蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9。具體包括以下步驟:1)H9亞型AIV流行株SD12E株HA基因與NDV AI4株M基因融合克隆的構(gòu)建分別以SD12E株基因組cDNA和pNDV/AI4為模板PCR擴(kuò)增H9 HA基因ORF和AI4株基因組3148 3804nt及3727 4735nt，通過(guò)Overlap PCR和分子克隆得到陽(yáng)性質(zhì)粒pH9M。
2)H5N1亞型AIV流行株1117株HA基因與NDV AI4株P(guān)基因融合克隆的構(gòu)建分別以含有1117株HA基因的質(zhì)粒PHW-HA和AI4株基因組cDNA為模板擴(kuò)增HA基因(不含終止子)以及AI4株基因組部分P基因2714-3141nt。通過(guò)分子生物學(xué)方法將兩者融合在一起并克隆入pGEMT-easy載體,得到質(zhì)粒pPH5。3)全長(zhǎng)克隆 pNDV/AI4_H52AH9 的獲得質(zhì)粒pPH5與pH9M同時(shí)用Aar I和Spe I進(jìn)行雙酶切，回收目的片段并連接，構(gòu)建質(zhì)粒PPH5H9M ;然后用Age I和Bstzl7 I對(duì)pPH5H9M進(jìn)行雙酶切后替換pNDV/AI4的對(duì)應(yīng)序列，構(gòu)建出重組NDV基因組全長(zhǎng)克隆pNDV/AI4-H52AH9。4)重組病毒rNDV_H52AH9株的拯救將pC1-NP、pC1-P和pCI_L三個(gè)輔助質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄載體pNDV/AI4_H52AH9共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18h后加入終濃度為10%的SPF雞胚尿囊液，60h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞輕輕刮下，與細(xì)胞上清充分混合后接種9 11日齡SPF雞胚，即獲得重組病毒rNDV-H52AH9。


圖1重組質(zhì)粒pNDV/AI4_H52AH9構(gòu)建模式圖。圖2重組質(zhì)粒pNDV/AI4_H52AH9的EcoR I酶切鑒定圖；M:500bp DNA ladder marker ；1:pNDV/AI4_H52AH9。圖3 重組病毒 rNDV_H52AH9 的 RT-PCR 鑒定；1、2:H5S、H5R 引物擴(kuò)增產(chǎn)物；M:200bp DNA ladder marker ;3、4:H9mS、H9mR 引物
擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4重組病毒感染CHO細(xì)胞外源基因表達(dá)的檢測(cè)；A-D為AI4感染組，E-H為rNDV_H52AH9感染組。A、E組以抗NDV HN的單克隆抗體為一抗，B、F組以H5N1亞型AIV高免血清為一抗，C、G組以H9N2亞型AIV高免血清為一抗，D、H組以SPF雞陰性血清為一抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以新城疫病毒為載體構(gòu)建的共表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9于2012年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；其保藏號(hào)CGMCC No:6654，分類命名為:新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)其長(zhǎng)度為:18648bp。構(gòu)建步驟一:以致弱的新城疫病毒AI4為載體共表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的全長(zhǎng)表達(dá)克隆的構(gòu)建生物材料準(zhǔn)備:新城疫病毒JS/5/05/Go株的致弱全長(zhǎng)表達(dá)克隆pNDV/AI4 [Hu Z, Hu S，Meng C，etal.Generation of a genotype VII Newcastle disease virus vaccine candidatewith high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis 2011，55 (3):391-397.]，含有H5N1亞型禽流感病毒流行株A/Chicken/Yangzhou/1117/2011株HA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PHW-HA[張妍等.clade2.3.2 H5N1亞型禽流感疫苗候選株的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).2012,43(6):915-921.]，由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存；H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/12E/2010株由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離、保存。pGEMT-easy 載體:購(gòu)自 Promega 公司。1、融合克隆pH9M的構(gòu)建1)H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列分析與基因突變提取H9N2亞型禽流感病毒SD12E株的總RNA，并用12nt隨機(jī)引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3’，SEQ ID N0.1)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到cDNA。序列分析發(fā)現(xiàn)需要對(duì)其ORF的31和1063位兩個(gè)Spe I酶切位點(diǎn)進(jìn)行沉默突變。設(shè)計(jì)2對(duì)突變引物，分別用于擴(kuò)增 HA 基因 ORF 的 I 1076nt、1050 1683nt。兩對(duì)突變引物分別是:TBlS:5' ATGGAAGTAGTATCACTAATAACTATACT G CT GTAGT 3’ (SEQ ID N0.2)TBlR:5’ CAACCAGCAAC (I AG O CCTGACCAACCTCCCTCTAT 3’ (SEQ ID N0.3)TB2S:5' AGGTTGGTCAGG Q CT O GTTGCTGGTTGGTATGGATT 3’ (SEQ ID N0.4)TB2R:5’TTATATACAAATGTTGCATC 3' (SEQ ID N0.5)突變堿基以斜體標(biāo)注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。用引物TBlS和TBlR擴(kuò)增HA基因ORF的I 1076nt區(qū)域，得到片段TBl ;用引物TB2S和TB2R擴(kuò)增其1050 1683nt區(qū)域，得到片段TB2。PCR反應(yīng):以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板配制如下PCR反應(yīng)體系:
權(quán)利要求
1.一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rNDV_H52AH9,它的保藏號(hào) CGMCC No:6654。
2.權(quán)利要求1所述新城疫病毒rNDV-H52AH9用于同時(shí)等量表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒的HA蛋白。
3.權(quán)利要求1所述新城疫病毒rNDV-H52AH9的構(gòu)建方法，其特征在于:以VIId亞型新城疫致弱株AI4的基因組全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體pNDV/AI4為骨架，同時(shí)表達(dá)兩株流行AIV毒株H5亞型 AIV A/Chicken/Yangzhou/1117/2011 和 H9 亞型 AIV A/Chicken/Shandong/12E/2010的HA基因；即將H5和H9亞型AIV的HA基因通過(guò)口蹄疫病毒2A基因串聯(lián)在一起后，插入轉(zhuǎn)錄載體PNDV/AI4的P、M基因之間，獲得重組新城疫病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆pNDV/AI4-H52AH9 ;該質(zhì) 粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞后獲得重組病毒rNDV_H52AH9。
全文摘要
本發(fā)明涉及新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rNDV-H52AH9，保藏號(hào)CGMCC No6654。本發(fā)明以新城疫病毒致弱株AI4為載體，將H5和H9亞型禽流感病毒的HA基因通過(guò)口蹄疫病毒2A基因串聯(lián)在一起后插入到含有AI4基因組全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄載體pNDV/AI4中，獲得重組NDV基因組全長(zhǎng)克隆pNDV/AI4-H52AH9。經(jīng)反向遺傳操作獲得了重組病毒rNDV-H52AH9，該重組病毒在雞胚上具有較高的繁殖滴度，且能同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)H5和H9亞型禽流感病毒的HA蛋白，為AI和ND的多聯(lián)重組基因工程活載體疫苗的研制與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N7/01GK103074306SQ20131004427
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者劉秀梵, 丁平云, 宋慶慶, 王曉泉, 劉曉文, 胡順林 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)