專利名稱：長(zhǎng)鏈非編碼rna基因linc00312的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因LINC00312的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
鼻咽癌是一種上皮源性的多基因遺傳性腫瘤，具有明顯的種族和地域差異，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，治療效果也不理想，五年生存率仍徘徊在50%左右。如何揭示鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)其預(yù)后的特異性分子標(biāo)志物、預(yù)測(cè)鼻咽癌患者的預(yù)后，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌患者的預(yù)后判定，采用不同的針對(duì)性治療方案，實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌患者的個(gè)體化治療，最終提高五年生存率、降低死亡率，是目前值得臨床科研工作者們研究的重要課題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)很多IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要調(diào)節(jié)作用，它具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)作用。IncRNA根據(jù)其基因位置可分為五種類型:正義 IncRNA(sense IncRNA)、反義 IncRNA(antisense IncRNA)、雙向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因內(nèi) IncRNA(intronic IncRNA)及基因間 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”的IncRNA，因在基因調(diào)節(jié)中的重要功能，目前已成為繼miRNA之后非編碼RNA領(lǐng)域又一研究熱點(diǎn)。近年的研究已表明，IncRNA參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。IncRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后新的標(biāo)志物，同時(shí)也為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。LINC00312是一個(gè)長(zhǎng)的基因間非編碼RNA，位于染色體3ρ25.3，3p25.3-26.3是一個(gè)與鼻咽癌發(fā)生密切相關(guān)的 染色體等位基因共同缺失區(qū)域。我們利用顯微切割技術(shù)獲得純凈的鼻咽癌組織樣本，抽提RNA 后通過逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)了 LINC00312在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LINC00312在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)(Ρ〈0.001)。我們隨后又利用鼻咽癌組織微陣列技術(shù)，通過原位雜交的方法，在大樣本中驗(yàn)證了 LINC00312在鼻咽癌中表達(dá)顯著下調(diào)(Ρ〈0.001)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)LINC00312表達(dá)能很好區(qū)分鼻咽癌患者和非癌患者，因此LINC00312的檢測(cè)制劑可用于鼻咽癌的輔助診斷。且LINC00312表達(dá)與臨床進(jìn)展及腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，生存曲線分析發(fā)現(xiàn)在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中LINC00312陽(yáng)性表達(dá)的患者其總生存率和無病生存率高于LINC00312陰性表達(dá)的患者，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽(yáng)性表達(dá)的患者其總生存率和無病生存率低于LINC00312陰性表達(dá)的患者。多因素分析則證實(shí)LINC00312是鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立判斷因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供LINC00312基因的應(yīng)用方法，利用該基因可以制備用于鼻咽癌輔助診斷或者預(yù)后預(yù)測(cè)的制劑。
所述的用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑包括原位雜交檢測(cè)試劑和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑。根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針，具體序列如下:5' -ctactataaggaaaagcactatcttctccc-3'5'-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3'5' -agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3'。根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)并合成出用于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)引物，具體序列如下:用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的上、下游引物分別為5 ’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3 ’和5， -CAAATCCCTGAAACTCTG-3，。

申請(qǐng)人利用顯微切割技術(shù)獲得純凈的鼻咽癌或正常鼻咽上皮組織樣本，抽提RNA后逆轉(zhuǎn)錄，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了 LINC00312表達(dá)，結(jié)果顯示LINC00312在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)(P〈0.001)。并通過原位雜交也發(fā)現(xiàn)LINC00312在鼻咽癌中表達(dá)顯著下調(diào)，與臨床進(jìn)展及腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，LINC00312表達(dá)能很好區(qū)分鼻咽癌患者和非癌患者，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，LINC00312的表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)，多因素分析發(fā)現(xiàn)LINC00312可作為預(yù)測(cè)鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。提示LINC00312可作為鼻咽癌預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志。本發(fā)明為鼻咽癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖1為正常鼻咽上皮組織和鼻咽癌組織顯微切割圖片；a正常鼻咽上皮組織；b正常鼻咽上皮組織顯微切割后；c鼻咽癌組織；d鼻咽癌組織顯微切割后；圖2為L(zhǎng)INC00312在經(jīng)顯微切割后的40例正常鼻咽上皮組織和100例鼻咽癌組織中實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果；圖3為兩個(gè)各含448個(gè)不同組織點(diǎn)的鼻咽癌發(fā)病不同階段組織微陣列；圖4為組織微陣列各組織點(diǎn)對(duì)應(yīng)標(biāo)本的臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)；圖5為原位雜交檢測(cè)LINC00312在鼻咽癌(a)及非癌鼻咽上皮組織中的表達(dá)(b);圖6為ROC分析結(jié)果；顯示LINC00312的表達(dá)可用于區(qū)分鼻咽癌和正常鼻咽上皮，從而可以用于鼻咽癌的輔助診斷，具有較高的靈敏度和特異性圖7根據(jù)有無轉(zhuǎn)移及LINC00312表達(dá)水平將鼻咽癌患者分組，不同分組病人的預(yù)后曲線。A無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽(yáng)性表達(dá)(+ )的患者其無病生存率高于LINC00312陰性表達(dá)(_)的患者；B無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽(yáng)性表達(dá)(+ )的患者其總生存率高于LINC00312陰性表達(dá)(_)的患者；C有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽(yáng)性表達(dá)(+ )的患者其無病生存率低于LINC00312陰性表達(dá)(-)的患者；D有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽(yáng)性表達(dá)(+ )的患者其總生存率低于LINC00312陰性表達(dá)(_)的患者。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
一、熒光實(shí)時(shí)定量PCR1.材料與方法:40例正常鼻咽上皮組織和100例鼻咽癌組織經(jīng)Leica ASLMD (Leica MicrosystemsLtd.;ffetzlar, Germany)顯微切割純化后(圖1 )，抽提總RNA, 2 μ g RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。GAPDH引物為5' -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'(見序列表第9條序列)和5' -AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'(見序列表第10條序列)，LINC00312引物為5’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3’(見序列表第 7 條序列)和 5’ -CAAATCCCTGAAACTCTG-3’。(見序列表第8條序列)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系
SYBR Premix Ex Taq (2x)10μ1
PCR Forward Primer (ΙΟμιη)0.4μ1
PCR Reverse Primer (IOpm)0.4μ1
cDNA lift2.0μ1
dii^O7.2μΙ
Total20μ1熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)步驟I 94 0C5min2 95 °CIOsec3 58 °C30sec4 72 °C20sec5 Plate read6 82 °C30sec7 Plate read8 Go to step 2 for more 39 times9 Perform melting curve from55.0°C to 95.0°C , read every0.2°C , hold forI sec反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根據(jù) CT 值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標(biāo)化后,采用 group t_test 檢驗(yàn)計(jì)算P值。2.結(jié)果與正常鼻咽上皮相比，LINC00312基因在鼻咽癌組織表達(dá)下調(diào)，P〈0.001 (圖2)二、原位雜交1.材料方法I)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)打開網(wǎng)址NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入目的基因名稱LINC00312，查找基因序列，利用DNAClub軟件將各基因cDNA序列轉(zhuǎn)換為其互補(bǔ)序列。利用Primer3軟件(http://frod0.w1.mit.edu/cg1-bin/primer3/primer3.cgi/)的探針設(shè)計(jì)功能，以每一個(gè)基因的互補(bǔ)序列為模板，在其閱讀框架內(nèi)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，探針參數(shù)設(shè)定基本一致，GC含量為40-60%，Tm為65-70°C。根椐基因序列長(zhǎng)度，以200或300個(gè)堿基的間隔，在同一條件下設(shè)計(jì)5_6條30個(gè)堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸探針。使用BLAST軟件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/Blast, cgi)對(duì)所設(shè)計(jì)探針進(jìn)行精確匹配，篩選出雜交參數(shù)最佳特異性的3條寡核苷酸探針。2)用于組織微陣列原位雜交的寡核苷酸探針LINC00312及用作對(duì)照的看家基因GAPDH對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針長(zhǎng)度為30個(gè)堿基，寡核苷酸探針5’端為磷酸基團(tuán)，3’端為羥基，探針序列均為這些基因cDNA的互補(bǔ)序列?；蚬押塑账崽结樀脑敿?xì)序列，GC含量，Tm值見表I。寡核苷酸探針采用化學(xué)合成方法合成。表I用于原位雜交的基因的寡核苷酸探針序列
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因LINC00312的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該基因序列制備用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑包括原位雜交檢測(cè)試劑和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，用于原位雜交的寡核苷酸探針序列包括:5' -ctactataaggaaa agcactatcttctccc-3'5’-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3’5’-agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3’ 。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)并合成出用于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征在于，用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的上、下游引物分別為 5’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3’ 和 5’ -CAAATCCCTGAAACTCTG-3 ’。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因LINC00312的應(yīng)用方法，根據(jù)該基因序列，設(shè)計(jì)并合成實(shí)時(shí)定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。利用該制劑，在鼻咽癌臨床病例標(biāo)本中檢測(cè)LINC00312的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LINC00312在鼻咽癌中表達(dá)顯著下調(diào)，但有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌樣品中LINC00312的表達(dá)較高。將臨床病理參數(shù)中的年齡、性別、組織學(xué)類型、臨床分期、腫瘤大小及浸潤(rùn)范圍、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LINC00312表達(dá)情況進(jìn)行多變量分析(Cox’s proportional hazards model)，分析這些參數(shù)與鼻咽癌病人預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示LINC00312表達(dá)能作為鼻咽癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子，在沒有侵襲轉(zhuǎn)移的患者中LINC00312表達(dá)高預(yù)后較好，而有侵襲轉(zhuǎn)移的患者中LINC00312表達(dá)高反而預(yù)后差。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103074441SQ201310044009
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者李桂源, 張文玲, 黃琛, 曾朝陽(yáng), 熊煒, 李小玲, 李夏雨, 范松青, 石磊, 譚琛, 黃東海, 趙艷華 申請(qǐng)人:中南大學(xué)