一種用于生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora?spinosa)發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、低級醇、植物油、氨基酸和水，其中按培養(yǎng)基的總重量計，其組分及含量為：碳源5.0～9.0％、氮源3.0～6.0％、低級醇0.1～0.5％、植物油0.2～2.5％、氨基酸0.1～0.5％。所述發(fā)酵培養(yǎng)基能夠提高多殺菌素的發(fā)酵單位，提高生產(chǎn)效率，并降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種用于生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002]多殺菌素(Spinosad)是由放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，活性最高的兩個組分是spinosyn A和spinosynD。多殺菌素的作用機制新穎、獨特:作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)及Y-氨基丁酸受體，對昆蟲具有快速觸殺和胃毒活性(攝食毒性)。此外，多殺菌素活性選擇性較高，對鱗翅目、雙翅目和纓翅目等害蟲表現(xiàn)出極高的毒性，而對哺乳動物、鳥類和大多數(shù)益蟲毒性較低。在哺乳動物的慢性毒性試驗中，多殺菌素?zé)o致癌、致畸及致突變作用，也沒有神經(jīng)毒性。與氯氰菊酯相比，多殺菌素對某些重要益蟲的毒性低,而對鱗翅目害蟲的活性與之相當(dāng),對水生生物具有中低毒性。
[0003]多殺菌素最初是美國陶氏農(nóng)業(yè)科學(xué)公司生產(chǎn)的，因其具有生物農(nóng)藥的安全性、化學(xué)合成農(nóng)藥的速效性且殺蟲譜廣、殺蟲活性高、低殘留，被美國環(huán)保局歸類為降低風(fēng)險殺蟲劑產(chǎn)品。1999年，多殺菌素獲得美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎”，2005年美國環(huán)保局批準(zhǔn)其作為儲糧防護劑，2008年歐盟批準(zhǔn)其在有機作物上使用。至2003年，多殺菌素已經(jīng)在24個國家，超過250種作物上進行注冊登記。在我國，1999年多殺菌素的注冊商品名為催殺(Tracer48%懸浮液)和菜喜(Success2.5%懸浮液)。可以看出，目前多殺菌素已成為最具有發(fā)展前景的生物殺蟲劑，對其進行研究開發(fā)具有良好的經(jīng)濟與社會效益。
[0004]Z.H.Jin&B.Xu&S.Z.Lin&Q.C.Jin&P.L.Cen ；Enhanced Product1n ofSpinosadin Saccharopolyspora spinosa by Genome Shuffling ；Appl B1chemB1technol (2009) 159:655-663公開了一種多殺菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵用培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及含量為:葡萄糖6%、淀粉2%、黃豆粉2%、魚粉I %、玉米漿I %、谷氨酸鹽0.3%、大豆油I %、CaC030.3%。該培養(yǎng)基的發(fā)酵單位最高為547mg/L。鑒于此發(fā)酵配方的發(fā)酵單位偏低，不利于產(chǎn)業(yè)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有的利用刺糖多孢菌發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵單位較低，產(chǎn)率低等缺陷，本發(fā)明提供了一種新的用于刺糖多孢菌發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，該發(fā)酵培養(yǎng)基能夠提高多殺菌素的發(fā)酵單位，提高生產(chǎn)效率，并降低生產(chǎn)成本。
[0006]因此，本發(fā)明旨在提供一種用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、低級醇、植物油、氨基酸和水，其中按培養(yǎng)基的總重量計，其組分及含量為:碳源5.0~9.0 %、氮源3.0~6.0 %、低級醇0.1~
0.5%、植物油0.2~2.5%、氨基酸0.1~0.5%。
[0007]本發(fā)明中的百分比單位是重量體積百分比單位g/100mL，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。
[0008]根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述的碳源選自葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、燕麥粉、玉米淀粉、玉米粉和糊精中的一種或多種；優(yōu)選地，所述的碳源為3.0~6.0%的葡萄糖和2.0~3.0 %的玉米粉的組合。
[0009]天然淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其直鏈淀粉與支鏈淀粉之比一般約為15-28%比72-85%。直鏈淀粉是D-葡萄糖基以a-(I，4)糖苷鍵連接的多糖鏈，分子中有200個左右葡萄糖基，支鏈淀粉分子中除有a-(l，4)糖苷鍵的糖鏈外，還有a-(l，6)糖苷鍵連接的分支，分子中含300~400個葡萄糖基。淀粉與碘呈顏色反應(yīng)，直鏈淀粉為藍色，支鏈淀粉為紫色。不同來源可溶性淀粉之間并無明顯差異。本發(fā)明所述的玉米淀粉是從玉米中直接提取所得的天然淀粉，含有直鏈淀粉及支鏈淀粉，其成分約為27 %直鏈淀粉、73 %支鏈淀粉，具有國家標(biāo)準(zhǔn)，市售可得。
[0010]Saccharopolyspora spinosa NRRL18395 的基因中含有可以表達為 ct-淀粉酶(alpha-amylase)的基因，即刺糖多孢菌能產(chǎn)生α -淀粉酶(EC3.2.1.1)，水解α-(1，4)_糖苷鍵:既作用于直鏈淀粉，亦作用于支鏈淀粉，無差別地隨機切斷糖鏈內(nèi)部的α-(1，4)_ 鏈。
[0011]本發(fā)明所述的可溶性淀粉是由淀粉經(jīng)過氧化劑、酸、甘油、酶或其他方法處理而成的淀粉衍生物，其成分為100 %直鏈淀粉。是一種白色或淡黃色粉末，無味無臭，溶于沸水形成膠體溶液，不溶于冷水、醇和醚。其產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)，市售可得。
[0012]根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方式，所述的氮源選自棉籽餅粉、酵母浸粉、魚粉蛋白胨、黃豆餅粉、豆柏和牛肉浸膏中的一種或多種；優(yōu)選地，所述的氮源為2.0~4.0%的棉籽粉和1.0~2.0%的酵母浸粉的組合。
[0013]根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述的低級醇選自乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或異丁醇；優(yōu)選為正丁醇0.1~0.5%，最優(yōu)選為0.2~0.3%。
[0014]根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方式，所述的植物油選自大豆油、玉米油、葵花油或花生油；優(yōu)選為葵花油0.2~2.5%，最優(yōu)選為2.0%。
[0015]根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述的氨基酸選自甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或天冬氨酸；優(yōu)選為賴氨酸0.1~0.5%，最優(yōu)選為0.2~0.3%。
[0016]上述最優(yōu)選配方的培養(yǎng)基的發(fā)酵單位最高可達1559mg/L,是原有發(fā)酵水平的2.8倍。
[0017]根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方式，所述刺糖多孢菌可以是現(xiàn)有的各種刺糖多抱菌菌株，如 Saccharopolyspora spinosa NRRL18395、Saccharopolyspora spinosaATCC49460。
[0018]本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0019]本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
[0020]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的有益效果如下:本發(fā)明提供了一種有利于刺糖多孢菌高效發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基。通過優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比，從而大大提高多殺菌素的產(chǎn)量。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)方法大幅提高了多殺菌素的發(fā)酵單位，適用于多殺菌素的規(guī)?；a(chǎn)。

【具體實施方式】
[0021]下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]所使用的刺糖多抱菌為:Saccharopolysporaspinosa NRRL18395 或Saccharopolyspora spinosa ATCC49460。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)方法:
[0024]裝量100mL/750mL，接種量10%，置于28°C恒溫室中旋轉(zhuǎn)搖床240rpm搖瓶發(fā)酵9天。
[0025]發(fā)酵液中多殺菌素含量測定:
[0026]取發(fā)酵液2mL置于1mL離心管，加入6mL甲醇溶液，充分振蕩，混合超聲15min，避光室溫浸提12小時，離心(4000rpm，20min)，取上清液經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾后用于高壓液相色譜檢測。
[0027]色譜條件:色譜柱:C18,4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流動相:甲醇-乙腈-0.05mol/L乙酸銨(45: 45: 10);流速:1.0mL/min ;檢測波長:250nm ;柱溫:40°C ;進樣量:5μ L。
[0028]實施例1
[0029]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0030]葡萄糖6.0g、可溶性淀粉3.0g、棉籽粉5.0g、乙醇0.2g、葵花油2.0g、甘氨酸
0.3g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為783mg/L。
[0031]實施例2
[0032]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0033]葡萄糖6.0g、面粉3.0g、棉籽粉3.0g、豆柏2.0g、正丙醇0.2g、大豆油2.0g、谷氨酸0.3g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為736mg/L。
[0034]實施例3
[0035]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0036]葡萄糖6.0g、燕麥粉3.0g、棉籽粉3.0g、魚粉蛋白胨2.0g、異丙醇0.2g、玉米油2.0g、脯氨酸0.3g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為641mg/L。
[0037]實施例4
[0038]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0039]葡萄糖6.0g、玉米淀粉3.0g、棉籽粉3.0g、黃豆餅粉2.0g、正丁醇0.2g、花生油
2.0g、甲硫氨酸0.3g,體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為974mg/L。
[0040]實施例5
[0041]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0042]葡萄糖6.0g、玉米粉3.0g、棉籽粉3.0g、酵母浸粉2.0g、正丁醇0.2g、葵花油
2.0g、賴氨酸0.3g，體積lOOmL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為1327mg/L。
[0043]實施例6
[0044]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0045]葡萄糖6.0g、糊精3.0g、棉籽粉3.0g、牛肉浸膏2.0g、異丁醇0.2g、葵花油2.0g、天冬氨酸0.3g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為842mg/L。
[0046]實施例7
[0047]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0048]葡萄糖8.0g、玉米粉1.0g、棉籽粉1.0g、酵母浸粉4.0g、正丁醇0.2g、葵花油
0.5g、賴氨酸0.5g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為856mg/L。
[0049]實施例8
[0050]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0051]葡萄糖7.0g 、玉米粉2.0g、棉籽粉2.0g、酵母浸粉3.0g、正丁醇0.3g、葵花油
1.5g、賴氨酸0.2g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為921mg/L。
[0052]實施例9
[0053]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0054]葡萄糖6.0g、玉米粉3.0g、棉籽粉3.0g、酵母浸粉2.0g、正丁醇0.lg、葵花油
1.0g、賴氨酸0.3g,體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為937mg/L。
[0055]實施例10
[0056]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa ATCX49460發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0057]葡萄糖7.0g、玉米粉2.0g、棉籽粉4.0g、酵母浸粉1.0g、正丁醇0.4g、葵花油
2.0g、賴氨酸0.lg，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為821mg/L。
[0058]實施例11
[0059]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0060]葡萄糖6.0g、玉米粉3.0g、棉籽粉5.0g、正丁醇0.5g、葵花油2.5g、賴氨酸0.4g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為832mg/L。
[0061]實施例12
[0062]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基按照下表所列數(shù)據(jù)(重量體積百分比)進行配置:
[0063]葡萄糖9.0g、棉籽粉3.0g、酵母浸粉2.0g、正丁醇0.2g、葵花油2.0g、賴氨酸
0.3g，體積100mL。發(fā)酵后測得發(fā)酵單位為711mg/L。
[0064]對比實施例1
[0065]利用多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa NRRL18395發(fā)酵,按【背景技術(shù)】中所提及的Jin等人文獻所述，使用其發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖6 %、淀粉2 %、黃豆粉2 %、魚粉I %、玉米漿I %、谷氨酸鹽0.3%、大豆油I %、CaCO30.3%。多殺菌素的產(chǎn)量為523mg/L。
【權(quán)利要求】
1.一種用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、低級醇、植物油、氨基酸和水，其中按培養(yǎng)基的總重量計，其組分及含量為:碳源5.0~9.0%、氮源3.0~6.0%、低級醇0.1~0.5%、植物油0.2~2.5%、氨基酸0.1~0.5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的碳源選自葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、燕麥粉、玉米淀粉、玉米粉和糊精中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的碳源為3.0~6.0%的葡萄糖和2.0~3.0 %的玉米粉的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的氮源選自棉籽餅粉、酵母浸粉、魚粉蛋白胨、黃豆餅粉、豆柏和牛肉浸膏中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的氮源為2.0~4.0%的棉籽粉和 .1.0~2.0 %的酵母浸粉的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的低級醇選自乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或異丁醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的低級醇為正丁醇，含量為0.2~.0.3%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的植物油選自大豆油、玉米油、葵花油或花生油。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的植物油為葵花油，含量為2.0%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的氨基酸選自甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或天冬氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的氨基酸為賴氨酸，含量為0.2~.0.3%。
【文檔編號】C12R1/645GK104046672SQ201310080681
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】李繼安, 鐘京諭, 林惠敏, 藍鴻, 石煊雯, 李亞軍 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院