專利名稱：一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法。
背景技術(shù)：
植物雄性不育特性可由細(xì)胞質(zhì)基因引起，稱細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)，也可因核基因突變引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其雜種優(yōu)勢(shì)利用必須依賴于雄性不育性。在雜交水稻研究和應(yīng)用之初，使用的雄性不育系都是CMS類型。1973年石明松在湖北晚粳稻品種農(nóng)墾58群體中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)突變的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)株,后來定名為農(nóng)星 58S (石明松，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1985，2:44-48)，開啟了利用光溫敏雄性不育特性培育兩系法雜交水稻的序眷。經(jīng)過幾十年的研究，兩系不育系根據(jù)其對(duì)光照長(zhǎng)度和溫度的敏感性可分為光敏不育(PGMS)、溫敏不育(temperature-sensitive genic male sterility, TGMS)和光溫敏核不育(P/TGMS)三類(程式華，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，29 (4): 11-16)。PGMS水稻具有長(zhǎng)日照條件下抽穗雄性不育，短日照條件下抽穗雄性可育的基本特征，如農(nóng)墾58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高溫條件下抽穗雄性不育，低溫條件下抽穗雄性部分可育，如安農(nóng)S-1 (鄧華鳳等，雜交水稻，1999，14 (3): 1-3)，廣占63S (楊振玉等，雜交水稻，2002，17(4):4-6)，株 IS (楊遠(yuǎn)柱等，雜交水稻，2000，15(2):6-9)等。PGMS 和 TGMS 共同構(gòu)成了目前生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的兩系法雜交稻不育系基因的主要來源。有的水稻則對(duì)光照和溫度都有一定的敏感性，在長(zhǎng)日照、高溫下抽穗表現(xiàn)不育，短日照、低溫下表現(xiàn)部分可育，如培矮64S (羅孝和等，雜交水稻，1992，(I): 27-29)。系譜分析表明大多早期商業(yè)化應(yīng)用的P/TGMS系主要有3個(gè)起源:農(nóng)墾58S，安農(nóng)S-1和株IS (斯華敏等，作物學(xué)報(bào)，2012，38 (3): 394-407)。在農(nóng)墾58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S (趙海軍等，中國(guó)水稻科學(xué)，2004，18(6):515-521)，而有些則表現(xiàn)為溫敏特性如廣占63S (楊振玉等，雜交水稻，2002，17(4):4_6)。大量遺傳分析表明，PGMS 和 TGMS 都受單隱性基因控制，如安農(nóng) S-1 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)，株IS (楊遠(yuǎn)柱等，中國(guó)稻米，2007，(6): 17-22)。
為精細(xì)定位并最終克隆TGMS，許多研究者針對(duì)不同的溫敏不育材料已經(jīng)做了不少工作。安農(nóng)S-ι是很多目前在生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻TGMS不育系的不育基因(tms5)的供體，Yang等(Yang et al, 2007)已將tms5定位在染色體2上一個(gè)19kb的區(qū)域，在其5’和3’端分別由STS標(biāo)記4039-1和4039-2界定，并認(rèn)為其候選基因是NAC家族的一個(gè)成員(Yanget al.Planta，2007，225:321-330)。Peng 等(Peng et al，2010)將溫敏不育系秈 S 的不育基因同樣也定位于第2號(hào)染色體上，介于2個(gè)SSR標(biāo)記RMAN81和RMX21之間183kb的與安農(nóng)S-1定位區(qū)間相近的區(qū)域,但認(rèn)為有著不同于安農(nóng)S-1的候選基因(Peng et al.TheorAppl Genet, 2010，120:1013-1020)。
除上述提及的兩系水稻不育系外，不同研究所還報(bào)道了不少獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的P/TGMS不育水稻材料，有的已經(jīng)育成商用不育系在兩系雜交水稻生產(chǎn)中應(yīng)用，如瓊香is (郭國(guó)強(qiáng)等，雜交水稻，2009，24 (I): 399-400)，綿9S(王志等，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，12 (4): 11-14)，雁農(nóng)S (陽花秋等，雜交水稻，1996(1):9-10)等，但均未見有與這些不育基因相連鎖的分子標(biāo)記的公開報(bào)道。在水稻兩系不育系選育中，通常需要在田間自然條件下鑒定不育單株。但是，光溫條件在各地及同一地點(diǎn)的不同季節(jié)存在很大差異，這對(duì)兩系不育系的選育十分不利。如:(O海南是我國(guó)水稻冬、春季節(jié)水稻加代繁育的重要場(chǎng)所，在3月前抽穗時(shí)，由于氣溫相對(duì)也較低，因此多數(shù)TGMS水稻也表現(xiàn)可育。因此，在海南TGMS基本不能表達(dá)，從而制約了兩系不育系的選育。(2)在長(zhǎng)江流域及北方水稻區(qū)，TGMS水稻在正常水稻生產(chǎn)季節(jié)都表現(xiàn)為不育，一旦選到不育株，需要在割茬再生后才有可能結(jié)實(shí)；由于后期氣溫一般較高，即使再生分蘗也往往高度不育，很難使收獲種子，因此需要將稻樁帶海南、讓其再生分蘗才能獲得種子，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且嚴(yán)重制約可選擇群體的大小。利用分子標(biāo)記輔助選擇是目前作物育種中的一種先進(jìn)育種方法。對(duì)TGMS這樣的性狀，基于如上所說的原因，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種尤為重要。因?yàn)椋词股L(zhǎng)環(huán)境無法使其TGMS特性得以展現(xiàn)，利用分子標(biāo)記仍然可以確定其基因型。此外，一旦確定其基因型，還可以通過調(diào)節(jié)播期有意讓其在可育環(huán)境下開花結(jié)實(shí)，避免需要采用割茬再生、冷水灌溉等 費(fèi)力但效果欠佳的方法。但是，可能是由于沒有特別適宜的分子標(biāo)記，迄今尚未見基于分子標(biāo)記輔助選擇TGMS水稻的報(bào)道。同時(shí)，由于尚無TGMS基因特異性分子標(biāo)記，迄今尚未能將TGMS基因像其他基因一樣如抗稻瘟病基因(董巍等，分子植物育種，2010，8 (5):853-860)和白葉枯病抗性基因(蘭艷榮等，中國(guó)水稻科學(xué)，2011, 25(2): 169-174)聚合在一個(gè)不育系中，提高不育系對(duì)環(huán)境的穩(wěn)定性。目前用于輔助選擇育種的分子標(biāo)記主要有微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR標(biāo)記)，INDEL標(biāo)記，RFLP標(biāo)記，RAPD標(biāo)記，AFLP標(biāo)記，STS標(biāo)記和基于PCR擴(kuò)增的限制性酶切的CAPS或dCAPS標(biāo)記(馮建成，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(2):43-47)。最近，利用有序列變化的擴(kuò)增子之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段溶解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)的原理，還發(fā)展起來區(qū)分SNP的 HRM 分析方法(Reed et al.Pharmacogenomics, 2007, 8:597-608),以及基于 DNA 分子雜交的SNP芯片技術(shù)。與其他性狀一樣，在控制每個(gè)性狀的基因被克隆之前，可以獲得與目標(biāo)性狀基因無限接近、在不同品種之間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記。傳統(tǒng)利用與溫敏不育緊密連鎖的4039-1 和 4039-2 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)以及 RMAN81 和 RMX21 (Penget al.Theor Appl Genet, 2010，120:1013-1020)開發(fā)了大量的分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記的多態(tài)性只與研究的表型存在連鎖關(guān)系，在生物學(xué)上不存在因果關(guān)系，并不是功能性分子標(biāo)記。在這些分子標(biāo)記的實(shí)際應(yīng)用中，首先要確定在研究的不育系和野生型材料之間是否存在多樣性，只有在存在多樣性的前提下，才能進(jìn)一步用分子標(biāo)記輔助選擇等。在很多情況下，特別是品種之間雜交時(shí)往往不存在多態(tài)性；同時(shí)，即使存在多態(tài)性，由于只是連鎖關(guān)系，減數(shù)分裂時(shí)的基因重組，也會(huì)打破這種連鎖關(guān)系，從而影響選擇效果。功能性分子標(biāo)記是指根據(jù)在基因水平上決定某一性狀差異的核苷酸序列而開發(fā)的分子標(biāo)記，其特征是用該分子標(biāo)記表示的不同等位基因直接代表一種表型性狀，分子標(biāo)記與性狀之間不像其他分子標(biāo)記只是連鎖關(guān)系(連鎖關(guān)系意味著分子標(biāo)記與性狀之間存在多種可能的相斥或相向關(guān)系；同時(shí)，在育種過程中這種連鎖關(guān)系可能被打破)。迄今，尚無公開報(bào)道開發(fā)出了水稻TGMS基因的功能性分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，通用性廣，簡(jiǎn)單有效，準(zhǔn)確率高且成本低廉。一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括:(I)提取水稻樣品DNA ；(2)根據(jù)RNaseZ基因的第70 71位核苷酸的多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特性分析，確定水稻樣品的基因型。其中，RNaseZ基因的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。溫敏雄性不育水稻的RNaseZ基因第70 71位核苷酸為+7°TA，而正常可育的水稻或光敏不育水稻在該位點(diǎn)為+7tlTC或+7°gc，因此可針對(duì)包含該位點(diǎn)的核苷酸多態(tài)性，對(duì)水稻樣品進(jìn)行基因分型。所述的水稻樣品可以為秈稻、粳稻或非洲栽培稻，也可以為不同類型水稻雜交產(chǎn)生的非典型的秈稻、粳稻、非洲栽培稻等。按品種劃分，所述的水稻樣品可以為水稻常規(guī)品種、雜交品種、育種中間材料等，當(dāng)然，所述水稻樣品也可以為采用雜交以外的方法得到的新品系。提取水稻DNA 時(shí)，可以采用水稻的種子、葉片、根、花器等組織。對(duì)水稻DNA的提取方法也沒有特殊要求，可以為CTAB法、SDS提取法、ROSE —管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用試劑盒進(jìn)行DNA的提取。所述特性分析為高分辨率溶解曲線分析或擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性分析。若進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析，步驟(2)中，所述引物的堿基序列為:上游引物RNZ-F3:5’ -ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’ ；下游引物RNZ-Rl: 5，-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3 ’。步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的體系為:2XPCR Master Mix，5 μ L ;10 μ M的上游弓丨物 RNZ-F3，0.2μ L ;10 μ M 的下游引物 RNZ-R1，0.2 μ L ； 10 X LC green-Plus, I μ L ；25ng/y L的 DNA, I μ L ;無菌水 2.6 μ L ;礦物油 10-20 μ L。所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。若進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性分析，步驟(2)中，所述引物為兩對(duì)，其中，第一對(duì)引物的堿基序列為:上游引物RNZ-Fl:5，-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3，；下游引物 RNZ-Rl: 5 ’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3 ’ ；第二對(duì)引物的堿基序列為:上游引物RNZ-F2:5，-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3，；下游引物RNZ-Rl: 5，-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3，。步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的體系為:2XPCR Master Mix，10 μ L ; 10 μ M的上游引物，0.4 μ L ; 10 μ M的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L的DNA，I μ L ;補(bǔ)充無菌水至20 μ L0所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性分析時(shí)，第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物采用Hinf I進(jìn)行酶切，第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物采用Sty I進(jìn)行酶切。酶切的反應(yīng)體系為:10XH Buffer, I μ L ；0.1%BSA, I μ L ;限制性內(nèi)切酶，0.3 μ L ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2 μ L ;無菌水補(bǔ)足至10 μ Lo酶切的反應(yīng)條件為:37°C水浴4_12h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:(I)本發(fā)明水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法簡(jiǎn)單，有效，準(zhǔn)確率高，且成本低廉。(2)本發(fā)明確定了水稻RNaseZ基因控制水稻的溫敏雄性不育性狀，為水稻的溫敏雄性不育基因，并針對(duì)該溫敏不育基因RNaseZ的序列特點(diǎn)，開發(fā)了分子標(biāo)記。本發(fā)明開發(fā)的分子標(biāo)記是根據(jù)造成水稻溫敏雄性不育性狀變異的遺傳基礎(chǔ)，即在確定造成水稻溫敏雄性不育生物學(xué)機(jī)制的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，因此屬于功能性分子標(biāo)記。這樣，本發(fā)明開發(fā)的分子標(biāo)記在育種中不但適用于任何組合，而且也不會(huì)因遺傳重組而發(fā)生變化，具有通用性和廣適性。(3) HRM分子標(biāo)記易于高通量操作。采用HRM分子標(biāo)記時(shí)，由于在PCR結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物可以在儀器上如LightScanner上直接分型，因此較其他類型的分子標(biāo)記更加適用于高通量分析。(4)利用本發(fā)明的方法輔助育種，方便、準(zhǔn)確，節(jié)約成本，能大大提高品種選擇效率，加快溫敏不育水稻品種育種進(jìn)程，而且可以避免環(huán)境因素對(duì)于表型的影響。


圖1為溫敏不育候選基因RNaseZ結(jié)構(gòu)及dCAPS分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)示意圖；其中，黑色方框代表外顯子，直線代表內(nèi)含子；溫敏不育突變位點(diǎn)用白色三角標(biāo)出；箭頭代表所設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記引物位置；并在圖下方方框中列出了所修改的堿基位置和類型，以及所形成的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)；圖2a為dCAPS分子標(biāo)記(引物為RNZ-F1/RNZ-R1)對(duì)株IS和08EZ01兩個(gè)親本及其F2代中不育單株進(jìn)行檢測(cè)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為株IS ;泳道2為08EZ01 ;泳道3為F1 ;泳道4-27為F2代不育單株；圖2b為是dCAPS分子標(biāo)記(引物為RNZ-F1/RNZ-R1)對(duì)株IS和08EZ01兩個(gè)親本及其F2代中可育單株進(jìn)行檢測(cè)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為株IS ;泳道2為08EZ01 ;泳道3為F1 ;泳道4-30為F2代可育單株； 圖3a為dCAPS分子標(biāo)記(引物為RNZ-F2/RNZ-R1)對(duì)Y58S和ZlO兩個(gè)親本及其F2代中不育單株進(jìn)行檢測(cè)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為Y58S ;泳道2為ZlO ;泳道3為F1 ;泳道4-36為F2代不育單株；圖3b為dCAPS分子標(biāo)記(引物為RNZ-F2/RNZ-R1)對(duì)Y58S和ZlO兩個(gè)親本及其F2中可育單株進(jìn)行檢測(cè)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為Y58S ;泳道2為ZlO ;泳道3為F1 ;泳道4-23為F2代可育單株；圖4a為水稻溫敏不育基因RNaseZ的HRM分子標(biāo)記中不同基因型隨溫度變化的溶解曲線圖；其中，沿著箭頭方向，曲線依次代表的基因型為TC、TA、TA/TC、TA/GC和GC ；圖4b為HRM分子標(biāo)記對(duì)溫敏不育候選基因位點(diǎn)不同基因型進(jìn)行分型的峰圖；圖5a為利用dCAPS分子標(biāo)記(Hinf I酶切)檢測(cè)不同類型的光溫敏不育系的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖5b為利用dCAPS分子標(biāo)記(Sty I酶切)檢測(cè)不同類型的光溫敏不育系的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖； 其中，圖5a_圖5b中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；前6個(gè)泳道為酶切前的PCR產(chǎn)物對(duì)照；泳道I為株IS ;泳道2為08EZ01 ;泳道3為日本晴；泳道4為株IS和08EZ01的混合；泳道5為株IS和日本晴的混合；泳道6為08EZ01和日本晴的混合；泳道7_25分別為GS138 ；廣占 63S ；Y58S ;廣湘 24S ;N422S/R8272 (F1);雙 8S/0293 (F1) ；W6154S ;龍 S ；Z9S ;海豐 IS ；1892S ;桂科-1S ;桂科-2S ；X07S ;雁農(nóng) S ；GS2011-20 ;安 7S-1II ;綿 9S ;943S。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。實(shí)施例1水稻溫敏不育功能性分子標(biāo)記的開發(fā)于2011年，構(gòu)建溫敏不育系株IS和野生型08EZ01的雜交F2后代群體，并于田間調(diào)查分離比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1260個(gè)F2單株中有286株完全不育單株，表型分離比符合3:1，說明溫敏性狀為單隱性基因控制。在開花期鏡檢觀察取樣完全不育的單株549株，用于定位控制株IS溫敏不育性狀的基因，并構(gòu)建基因池，利用348對(duì)均勻分布于各條染色體上的SSR標(biāo)記進(jìn)行初步定位，將溫敏不育基因定位于第2號(hào)染色體上。之后在該條染色體上發(fā)展更多的標(biāo)記，并利用這549株完全不育的單株進(jìn)行更加精細(xì)的定位，最后將該基因定位于第2號(hào)染色體RM12721和RM12735 之間。在定位區(qū)間內(nèi)尋找有可能的候選基因，測(cè)序發(fā)現(xiàn)位于第2染色體上的RNaseZ(RNZ)水稻同源基因RNZ (L0C_0s02gl2290)在不育系和野生型品種中存在差異，溫敏不育品種在該基因第I外顯子中存在的一個(gè)提前終止的突變+7°TAG，并且該突變與水稻溫敏雄性不育(TGMS)性狀完全一致，所有檢測(cè)的TGMS水稻在該位點(diǎn)均為+7°TAG，而正?？捎乃酒贩N或光敏不育水稻在此位點(diǎn)上要么為+7°TCG，要么為+7°GCG。據(jù)此，我們認(rèn)為該基因?yàn)榭刂茰孛舨挥幕?，并開發(fā)了一組特異性區(qū)別上述變異的分子標(biāo)記。以下將上述三種RNZ等位基因分別記為RNZta，RNZtc和RNAee。1、水稻溫敏不育功能性dCAPS(擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性)分子標(biāo)記的開發(fā)(I)區(qū)分RNZta和RNZTe等位基因的功能性dCAPS分子標(biāo)記
在Gramene 網(wǎng)站(http://www.gramene.0rg/)下載 L0C_0s02gl2290 的核苷酸序列(如SEQ N0.1)，并利用Primer Premier5.0軟件在+70TAG區(qū)域附近設(shè)計(jì)PCR引物，堿基序列為:上游引物(RNZ-Fl):5， -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3，；下游引物(RNZ-Rl):5， -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3，；由于突變位點(diǎn)處沒有任何限制性酶切位點(diǎn)可用，因此在引物RNZ-Fl的3’末端引入了一個(gè)錯(cuò)配堿基從而形成一個(gè)限制性內(nèi)切酶Hinf I的識(shí)別位點(diǎn)(如圖1)。在引入這一錯(cuò)配堿基后擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，等位基因RNZta不能被HinfI酶切，等位基因RNZtg含有Hinf I的識(shí)別位點(diǎn)，可以被Hinf I酶切成153bp和25bp 二段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，攜帶不同等位基因的水稻材料可以容易地加以區(qū)分，擴(kuò)增片段經(jīng)HinfI酶切后，只攜帶RNZta等位基因的純合材料只顯示178bp的條帶；而只攜帶RNZTe等位基因的純合材料顯示153bp和25bp的條帶；而同時(shí)攜帶RNZta和RNZrc等位基因的雜合材料顯示178bp、153bp和25bp三個(gè)條帶(如圖2a、圖2b)。該dCAPS分子標(biāo)記能將只攜帶RNZta等位基因的純合溫敏材料和只攜帶RNZTe等位基因的純合野生型材料以及攜帶2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料加以區(qū)分。(2)區(qū)分RNZta和RNZee等位基因的功能性dCAPS標(biāo)記采用相似的原理利用Primer Premier5.0軟件在+7ciTAG區(qū)域附近設(shè)計(jì)PCR引物，堿基序列為:`
上游引物(RNZ-F2):5， -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3，；下游引物(RNZ-Rl):5， -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3，；引物RNZ-F2是根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，同樣由于突變位點(diǎn)處沒有任何限制性酶切位點(diǎn)可用，因此在引物RNZ-F2的3’末端引入一個(gè)錯(cuò)配堿基從而形成一個(gè)限制性內(nèi)切酶StyI的識(shí)別位點(diǎn)(如圖1)。在引入這一錯(cuò)配堿基后擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，等位基因RNZta不能被Sty I酶切，而等位基因RNZgg含有Sty I的識(shí)別位點(diǎn)，可以被Sty I酶切成155bp和23bp 二段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，攜帶不同等位基因的水稻材料可以容易地加以區(qū)分，擴(kuò)增片段經(jīng)StyI酶切后，只攜帶等位基因RNZta的純合材料只顯示178bp的條帶；而野生型可育等位基因RNZgc的純合材料只顯示155bp和23bp的條帶；而同時(shí)攜帶兩種等位基因的雜合材料顯示178bp、155bp和23bp三個(gè)條帶(如圖3a、圖3b)。因此，該dCAPS標(biāo)記能將攜帶RNZta等位基因的純合溫敏材料和只攜帶RNZee等位基因的純合野生型材料以及攜帶2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料加以區(qū)分。2、水稻溫敏不育功能性HRM(高分辨率溶解曲線)分子標(biāo)記的開發(fā)采用相似的原理利用Primer Premier5.0軟件在+7ciTAG區(qū)域附近設(shè)計(jì)HRM引物，堿基序列為:上游引物(RNZ-F3): 5，-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3，；
下游引物(RNZ-Rl):5 ’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3 ’ ；引物位置如圖1所示，根據(jù)HRM分析要求進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在HRM分析儀(如LightScanner)分析，可以直觀地將等位基因RNZTA與其他兩種等位基因加以區(qū)別。如圖4a、圖4b所示，不同基因型的溶解曲線在93 96°C區(qū)段釋放的熒光信號(hào)明顯不同，熒光染料特異的與DNA雙鏈結(jié)合，隨溶解溫度的上升，與DNA雙鏈相結(jié)合的熒光信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)變化。由于，不同類型的基因型所形成的PCR產(chǎn)物有著不同的Tm值，有不同的熒光隨溫度上升的變化值，根據(jù)高分辨率溶解曲線基因分型的原理，如果兩條曲線的AF值(相對(duì)熒光強(qiáng)度)大于0.05，則可以認(rèn)為二者屬于不同的基因型。如圖4b所示，以只攜帶等位基因RNZta的純合溫敏材料為基準(zhǔn)線，只攜帶RNZrc等位基因的純合野生型材料，只攜帶等位基因RNZre的純合野生型材料，攜帶RNZta和RNZrc兩種等位基因的雜合(但雄性可育)材料以及攜帶RNZta和RNZee2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料，這五種基因型都能夠被明顯的相互區(qū)分開。因此，可以將上述已知基因型的溶解曲線作為對(duì)照，將待檢測(cè)水稻材料的溶解曲線與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，如果兩條曲線的Λ F值小于0.05，則認(rèn)為基因型相同，由此確定待檢測(cè)水稻材料的基因型。實(shí)施例2利用dCAPS分子標(biāo)記區(qū)分雙親基因型為RNZta和RNZrc的雜交后代植株利用溫敏不育材料株IS和可育材料08EZ01配制其雜交組合F2代，其中經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，株IS和08EZ01在溫敏不育候選基因突變位點(diǎn)基因型分別為RNZta和RNZtg,因此針對(duì)該親本所配制雜交后代作為試驗(yàn)材料，這些試驗(yàn)材料于2012年夏季種植于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，自田間開花期觀察并鏡檢花粉育性，共取549株表現(xiàn)為完全不育的單株和27株可育單株。另外，采集這些試驗(yàn)材料的葉片，利用dCAPS分子標(biāo)記對(duì)RNZ基因進(jìn)行檢測(cè)。1、水稻基因組DNA的提取(I)將水稻葉片剪碎后置于2.0mL離心管中，同時(shí)放入一粒鋼珠，用組織碾磨儀磨碎；(2)加入 800 μ L CTAB 提取緩沖液(Tris-HCl, IOOmM, ρΗ8.0 ；EDTA, 20mM, ρΗ8.0 ；NaCl,500mM ；CTAB, 2%)，65°C水浴 40min,期間搖動(dòng) 3-4 次；(3)加入等體積的氯仿:異戊醇(24:l,v/v)混合液，上下顛倒混勻，10000r/min離心 IOmin ；(4)轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，加入等體積_20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置 _20°C下沉淀 30min, 10000r/min 離心 IOmin ；(5)棄上清液,70%乙醇洗漆I次，IOOOOrpm離心IOmin ；(6)棄上清液，無水乙醇洗滌I次，自然風(fēng)干，溶于適量(100-200 μ L) TE溶液中，-20°C保存。2、包含突變位點(diǎn)DNA片段的PCR擴(kuò)增、酶切和分析以提取的水稻DNA為模板，采用實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的特異性引物RNZ-Fl和RNZ-R1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系見表I。表I用于dCAPS分子標(biāo)記的PCR 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括: (1)提取水稻樣品DNA； (2)根據(jù)RNaseZ基因的第70 71位核苷酸的多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特性分析，確定水稻樣品的基因型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特性分析為高分辨率溶解曲線分析或擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性分析。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，若進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析，步驟(2)中，所述引物的喊基序列為:上游引物 RNZ-F3:5’ -ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’ ；下游引物 RNZ-Rl:5’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的體系為:2XPCRMaster Μ χ,δμ L ;10μΜ 的 上游引物 RNZ_F3，0.2μ L ;10μΜ 的下游引物 RNZ-R1,0.2μ L ；10XLC green-Plus, I μ L ；25ng/y L 的 DNA，I μ L ;無菌水 2.6 μ L ;礦物油 10-20 μ L。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，50-60°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35-40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，若進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性分析，步驟(2)中，所述引物為兩對(duì)，其中， 第一對(duì)引物的堿基序列為:上游引物 RNZ-Fl:5’ -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’ ；下游引物 RNZ-Rl:5’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’ ； 第二對(duì)引物的堿基序列為:上游引物 RNZ-F2:5’ -ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’ ；下游引物 RNZ-Rl:5’ -TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的體系為:2XPCRMaster Mix，10 μ L ; 10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M 的下游引物，0.4 μ L ；25ng/y L 的DNA, I μ L ;補(bǔ)充無菌水至20 μ L。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，50-60°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35-40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物采用HinfI進(jìn)行酶切，第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物采用Sty I進(jìn)行酶切。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻溫敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括提取水稻樣品DNA；根據(jù)RNaseZ基因的第70～71位核苷酸的多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特性分析，確定水稻樣品的基因型；其中，RNaseZ基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。本發(fā)明水稻溫敏雄性核不育基因分型的方法簡(jiǎn)單，有效，準(zhǔn)確率高，且成本低廉。本發(fā)明確定了水稻RNaseZ基因控制水稻的溫敏雄性不育性狀，為水稻的溫敏雄性不育基因，并針對(duì)該溫敏不育基因RNaseZ的序列特點(diǎn)，開發(fā)了功能性的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103160583SQ20131009650
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者舒慶堯, 張華麗, 黃建中 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 無錫求是生物農(nóng)業(yè)有限公司, 浙江之豇種業(yè)有限責(zé)任公司