專利名稱：一種用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于水稻光敏雄性核不育基因IncR分型的引物及其應用。
背景技術(shù)：
植物雄性不育特性可由細胞質(zhì)基因引起，稱細胞質(zhì)雄性不育(CMS)，也可因核基因突變引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其雜種優(yōu)勢利用必須依賴于雄性不育性。在雜交水稻研究和應用之初，使用的雄性不育系都是CMS類型。1973年石明松在湖北晚粳稻品種農(nóng)墾58群體中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)突變的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)株,后來定名為農(nóng)星 58S (石明松，中國農(nóng)業(yè)科學，1985，2:44-48)，開啟了利用光溫敏雄性不育特性培育兩系法雜交水稻的序眷。經(jīng)過幾十年的研究，兩系不育系根據(jù)其對光照長度和溫度的敏感性可分為光敏不育(PGMS)、溫敏不育(temperature-sensitive genic male sterility, TGMS)和光溫敏核不育(P/TGMS)三類(程式華，中國農(nóng)業(yè)科學，1996，29 (4): 11-16)。PGMS水稻具有長日照條件下抽穗雄性不育，短日照條件下抽穗雄性可育的基本特征，如農(nóng)墾58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高溫條件下抽穗雄性不育，低溫條件下抽穗雄性部分可育，如安農(nóng)S-1(鄧華鳳等，雜交水稻，1999，14(3): 1-3)，株IS (楊遠柱等，雜交水稻，2000，15 (2): 6_9)等。PGMS和TGMS共同構(gòu)成了目前生產(chǎn)上大面積應用的兩系法雜交稻不育系基因的主要來源。有的水稻則對光照和溫度都有一定的敏感性，在長日照、高溫下抽穗表現(xiàn)不育，短日照、低溫下表現(xiàn)部分可育，如培矮64S (羅孝和等，雜交水稻，1992，(1):27-29)。系譜分析表明大多早期商業(yè)化應`用的P/TGMS系主要有3個起源:農(nóng)墾58S，安農(nóng)S-1和株IS (斯華敏等，作物學報，2012，38 (3): 394-407)。在農(nóng)墾58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S (趙海軍等，中國水稻科學，2004，18(6):515-521)，而有些則表現(xiàn)為溫敏特性如廣占63S (楊振玉等，雜交水稻，2002，17(4):4_6)。大量遺傳分析表明，PGMS 和 TGMS 都受單隱性基因控制，如安農(nóng) S-1 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)，株IS (楊遠柱等，中國稻米，2007，(6): 17-22)。為精細定位并最終克隆PGMS，Ding 等(PNAS, 2012，109:2654-2659)和 Zhou 等(Cell Research, 2012，22:649-660)分別以農(nóng)墾58S和培矮64S為PGMS基因供體，通過和可育材料雜交建立分離群體，在精細定位確定控制農(nóng)墾58S (pms3)和培矮64S (p/tgmsl2-l)雄性不育候選基因的基礎(chǔ)上，采用遺傳互補試驗確定了一個位于第12號染色體上編碼長鏈非編碼RNA基因(IncR)為該不育系的PGMS基因，其在第789位堿基由C — G的轉(zhuǎn)換是造成PGMS的原因。雖然在先前的研究中開發(fā)了與光敏不育基因相連鎖的分子標記(Luet al.MolGen Genomics, 2005，273:507-511),但在 Ding 等(Ding et al, 2012)和 Zhou 等(Zhou etal，2012)研究中開發(fā)的與PGMS連鎖的分子標記最為緊密。Ding等(Ding et al, 2012)分別在距該基因5’和3’端約5kb和5.8kb處找到了在農(nóng)墾58S和DH80之間存在多態(tài)性的插入/缺失標記M4和M1，而Zhou等(Zhou et al, 2012)則在培矮64S和培矮64之間設(shè)計了標記PA301和PAIDL2，分別于突變位點的5，和3，端相距約5kb和Ikb0除上述提及的兩系水稻不育系外，不同研究所還報道了不少獨立發(fā)現(xiàn)的P/TGMS不育水稻材料，有的已經(jīng)育成商用不育系在兩系雜交水稻生產(chǎn)中應用，如瓊香is (郭國強等，雜交水稻，2009，24 (I): 399-400)，綿9S(王志等，西南農(nóng)業(yè)學報，1999，12 (4): 11-14)，雁農(nóng)S (陽花秋等，雜交水稻，1996(1):9-10)等，但均未見有這些不育基因的分子標記的公開報道。在水稻兩系不育系選育中，通常需要在田間自然條件下鑒定不育單株。但是，光溫條件在各地及同一地點的不同季節(jié)存在很大差異，這對兩系不育系的選育十分不利。如:(I)海南是我國水稻冬 、春季節(jié)水稻加代繁育的重要場所，但是由于日照較短，PGMS水稻一般不表現(xiàn)雄性不育，因此，在海南PGMS基本不能表達，從而制約了兩系不育系的選育。(2)在廣東等南方地區(qū)早季播種時，由于日照也較短，因此也較難開展PGMS水稻的選育工作；
(3)在長江流域及北方水稻區(qū)，PGMS水稻在正常水稻生產(chǎn)季節(jié)都表現(xiàn)為不育，一旦選到不育株，需要在割茬再生后才有可能結(jié)實；并需要將稻樁帶海南、讓其再生分蘗才能獲得種子，不但費時費力，而且嚴重制約可選擇群體的大小。分子標記輔助選擇是目前作物育種中的一種先進育種方法。對PGMS這樣的性狀，基于如上所說的原因，利用分子標記輔助選擇育種尤為重要。因為，即使生長環(huán)境無法使其PGMS特性得以展現(xiàn)，利用分子標記仍然可以確定其基因型。此外，一旦確定其基因型，還可以通過調(diào)節(jié)播期有意讓其在可育環(huán)境下開花結(jié)實，避免需要采用割茬再生、冷水灌溉等費力但效果欠佳的方法。但是，可能是由于沒有特別適宜的分子標記，迄今尚未見基于分子標記輔助選擇PGMS水稻的報道。同時，由于尚無PGMS基因特異性分子標記，迄今尚未能將PGMS基因像其他基因一樣如抗稻瘟病基因(董巍等，分子植物育種，2010,8(5):853-860)和白葉枯病抗性基因(蘭艷榮等，中國水稻科學，2011，25(2): 169-174)聚合在一個不育系中，提聞不育系對環(huán)境的穩(wěn)定性。目前用于輔助選擇育種的分子標記主要有微衛(wèi)星標記或SSR標記，INDEL標記，RFLP標記，RAPD標記，AFLP標記，STS標記和基于PCR擴增的限制性酶切的CAPS或dCAPS標記(馮建成，中國農(nóng)學通報，2006，22(2):43-47)。最近，利用有序列變化的擴增子之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段溶解曲線的差異進行突變檢測的原理，還發(fā)展起了區(qū)分SNP的 HRM 分析方法(Reed et al.Pharmacogenomics, 2007, 8:597-608),以及基于 DNA 分子雜交的SNP芯片技術(shù)。與其他性狀一樣，在其基因被克隆之前，可以獲得與目標性狀基因無限接近、在不同品種之間具有多態(tài)性的的分子標記。根據(jù)與光敏不育緊密連鎖的Ml，M4和PA301, PAIDL2 (Ding et al.2012, PNAS, 109(7):2654-2659 ；Zhou et al.2012, Cellresearch, 22:649-660)開發(fā)的分子標記只與研究的表型存在遺傳上的連鎖關(guān)系，在生物學上不存在因果關(guān)系，即不是功能性分子標記。這樣，在實際應用中，首先要確定在研究的不育系和野生型材料之間是否存在多樣性，只有在存在多樣性的前提下，才能進一步用于分子標記輔助選擇等。在很多情況下，特別是品種之間雜交時往往不存在多態(tài)性；同時，即使存在多態(tài)性，由于只是連鎖關(guān)系，而減數(shù)分裂時的基因重組會打破這種連鎖關(guān)系，從而影響選擇效果。功能性分子標記是指根據(jù)在基因水平上決定某一性狀差異的核苷酸序列而開發(fā)的分子標記，其特征是用該標記表示的不同等位基因直接代表一種表型性狀，標記與性狀之間不像其他標記只是連鎖關(guān)系(連鎖關(guān)系意味著標記與性狀之間存在多種可能的相斥或相向關(guān)系；同時，在育種過程中這種連鎖關(guān)系可能被打破)。迄今，尚無公開報道開發(fā)出了水稻PGMS基因的功能性分子標記，因此也未見有這類標記在PGMS水稻育種中的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種引物，特異性強。一種引物，堿基序列為:上游引物:5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’ ；下游引物:5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3，。本發(fā)明還提供了所述引物在水稻光敏雄性核不育基因IncR分型中的應用。采用CAPS標記方法，利用上述引物，可以用來對水稻光敏雄性核不育基因IncR進行分型，具體包括:(I)提取水稻樣品的DNA ；(2)以DNA為模板，采用所述的引物，進行PCR擴增；(3)用限制性 內(nèi)切酶Rsa I對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，成像；(4)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型:如果只出現(xiàn)414bp的特征帶，則該水稻樣品為攜帶IncR基因的純合非光敏不育材料；如果只出現(xiàn)329bp和85bp兩條特征帶,則該水稻樣品為攜帶突變型IncR基因的純合光敏雄性不育材料；如果出現(xiàn)414bp、329bp和85bp三條特征帶,則該水稻樣品為攜帶IncR基因和突變型IncR基因的雜合材料。造成水稻光敏雄性不育的IncR基因內(nèi)的C — G的變化產(chǎn)生了一個Rsa I的酶切位點，因此圍繞包含該變異位置設(shè)計特異性PCR引物，擴增DNA片段，用Rsa I酶切后，根據(jù)切出的片段大小即可判斷水稻樣品的基因型。所述的水稻樣品可以為秈稻、粳稻或非洲栽培稻，也可以為不同類型水稻雜交產(chǎn)生的非典型的秈稻、粳稻、非洲栽培稻等。按品種劃分，所述的水稻樣品可以為水稻常規(guī)品種、雜交品種、育種中間材料等，當然，所述水稻樣品也可以為采用雜交以外的方法得到的新品系。提取水稻DNA時，可以采用水稻的種子、葉片、根、花器等組織。對水稻DNA的提取方法也沒有特殊要求，可以為CTAB法、SDS提取法、ROSE —管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用試劑盒進行DNA的提取。所述PCR 擴增的體系為:2XPCR Master Mix，10 μ L ; 10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L的DNA, I μ L ;補充無菌水至20 μ L。
所述PCR擴增的程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-45個循環(huán)；72°C延伸7min。所述酶切的反應體系為:10XTBuffer, I μ L ；0.1%BSA, I μ L ；Rsa I ,0.3μ L ；PCR擴增產(chǎn)物，5 μ L ;無菌水補足至10 μ L。所述酶切的反應條件為:37°C水浴4_12h。采用HRM標記方法,利用上述引物,可以用來對水稻光敏雄性核不育基因IncR進行分型，具體包括:(I)提取水稻樣品的DNA ；(2)以DNA為模板，采用探針引物和所述的引物，進行PCR擴增；其中，所述探針引物的喊基序列為:5’ -GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’ ；(3)獲取PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線，判斷水稻樣品的基因型:如果只在62 64°C出現(xiàn)特征峰，則該水稻樣品為攜帶IncR基因的純合非光敏不育材料；如果只在67 69°C出現(xiàn)特征峰，則該水稻樣品為攜帶突變型IncR基因的純合光敏雄性不育材料；如果在62 64和67 69°C均出現(xiàn)特征峰，則該水稻樣品為攜帶IncR基因和突變型IncR基因的雜合材料。`
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所述PCR擴增的體系為:2XPCRMaster Mix，10 μ L ; 10 μ M 的上游引物，0.02 μ L ;10 μ M 的下游引物,0.2 μ L ;10 μ M 的探針引物，I μ L ;10XLC green-Plus, I μ L ；25ng/y L的DNA，I μ L ;補充無菌水至6.78 μ L ;礦物油10-20 μ L。所述PCR擴增的程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-45個循環(huán)；72°C延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線可由HRM分析儀分析得到。本發(fā)明又提供了一種所述弓I物在選育光敏雄性核不育水稻中的應用。該應用具體為:采用光敏不育水稻和其它水稻材料雜交,獲得雜種F1，進一步采用雜交育種、回交育種或單倍體育種方法獲得后代材料，利用上述引物，采用CAPS或HRM分子標記對水稻光敏雄性核不育基因IncR進行分型，確定后代材料的基因型，進而育成穩(wěn)定的光敏不育系。所述光敏不育水稻是指任何攜帶突變型IncR基因的水稻，包括攜帶突變型IncR等位基因的純合型光敏不育水稻和只攜帶一個突變型IncR等位基因的雜合水稻材料；所述其它水稻材料包括攜帶一個突變型IncR等位基因的雜合水稻材料和不攜帶突變型IncR等位基因的純合型非光敏水稻材料。所述雜交育種是指攜帶突變型IncR等位基因的雜交水稻材料通過自花授粉產(chǎn)生后代，如F2代水稻材料自交獲得F3群體；雜合F3代水稻材料自交獲得F4群體等。所述回交育種是指攜帶突變型IncR等位基因的水稻材料與其他水稻材料雜交產(chǎn)生的雜種進一步與光敏不育系雜交，獲得BC1代材料，并繼續(xù)回交或自交產(chǎn)生后代，如BC2或BC1F2 等。所述單倍體育種方法是指采用花藥培養(yǎng)等手段獲得純合水稻群體。
所述穩(wěn)定的光敏不育系是指IncR位點已經(jīng)純合，均為突變型IncR等位基因，同時基因組的其他位點也已經(jīng)純合在表型上不再有明顯分離，可以用做光敏不育系生產(chǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:(I)本發(fā)明的引物特異性好，將其運用到CAPS (酶切擴增多態(tài)性序列)或HRM (高分辨率溶解曲線)分子標記中，對水稻光敏雄性核不育基因IncR進行分型，簡單，有效，準確率高，同時費用也較低。(2)本發(fā)明針對光敏不育基因IncR的序列特點，設(shè)計引物，開發(fā)了 CAPS或HRM分子標記。

本發(fā)明開發(fā)的分子標記是根據(jù)造成水稻光敏雄性不育性狀變異的遺傳基礎(chǔ)，即在確定造成水稻光敏雄性不育生物學機制的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，因此屬于功能性分子標記。這樣，本發(fā)明開發(fā)的分子標記在育種中不但適用于任何組合，而且也不會因遺傳重組而發(fā)生變化，具有通用性和廣適性。(3) HRM分子標記易于高通量操作。采用HRM分子標記時，由于在PCR結(jié)束后，擴增產(chǎn)物可以在儀器上如LightScanner上直接分型，因此較其他類型的分子標記更加適用于高通量分析。(4)利用本發(fā)明的引物輔助育種，方便、準確，節(jié)約成本，能大大提高品種選擇效率，加快光敏不育水稻品種育種進程，而且可以避免環(huán)境因素對于表型的影響。


圖1為利用CAPS分子標記檢測水稻光敏雄性核不育基因IncR的基因型的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA分子量標準，由上到下依次為600bp，500bp，400bp，300bp，200bp ;泳道1:日本晴(WT);泳道2:華201S(光敏不育);泳道3:華201S/日本晴F1 ;泳道4-24分別為檢測樣本:玉兔 S ;華 201S ；DS403 ；GS48 ；GS79 ；DS550 ；DS551 ；DS552 ;蜀光 612S/ 云 R58F!；廣湘 24S 5N422S/R8272F!；W6154S ；ZhulS ;廣占 63S ；Y58S ;海豐 IS ；1892S ;桂科-1S ;桂科-2S ；X07S ；圖2a為水稻光敏不育基因IncR的高分辨溶解曲線(HRM)基因分型中不同基因型隨溫度變化的溶解曲線圖；圖2b為水稻光敏不育基因IncR的高分辨溶解曲線(HRM)基因分型中對不同基因型分型的峰圖；其中，圖2a-圖2b中，灰色為日本晴(WT)，紅色為華201S(光敏不育)，藍色為日本晴與華201S的混合型，橫坐標為溫度(°C)；圖3為利用CAPS分子標記對花培得到的不育系進行鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M =DNA分子量標準；泳道1:株IS ;泳道2:日本晴；泳道3 華201S ;泳道4:玉兔S ;泳道5和6:花培得到的不育單株。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。實施例1水稻光敏不育基因功能性分子標記的開發(fā)
1、區(qū)分光敏不育和野生型等位基因的功能性CAPS分子標記Ding 等(Ding et al.PNAS, 2012，109:2654-2659)和 Zhou 等(Zhou et al.CellResearch, 2012, 22:649-660)的研究顯示，光敏核雄性不育水稻農(nóng)墾58S和培矮64S的光敏核雄性不育(PGMS)是由一個編碼長鏈非編碼RNA (IncR)基因的第789位堿基C — G的突變引起。將衍生自農(nóng)墾58S的光敏不育水稻攜帶的IncR等位基因定名為IncRg，而非光敏水稻的等位基因定名為lncRe。據(jù)此,在Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.0rg/)下載相應的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示,利用Primer Premier5.0軟件在突變位點區(qū)域附近設(shè)計一對PCR引物擴增片段包含C — G的突變位點。引物的堿基序列為:上游引物(LR-F):5’ -ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’ ；下游引物(LR-R):5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’ ；由于該突變產(chǎn)生了一個內(nèi)切酶的酶切位點Rsa I，因此任何包含該突變位點的擴增片段均可以被Rsa I酶切成329bp和85bp兩段，而其他水稻材料不能被酶切，從而開發(fā)了一個區(qū)別IncRg和IncIT等位基因的CAPS分子標記。如圖1所示，該CAPS分子標記能將只攜帶IncRg等位基因的純合光敏不育材料和只攜帶IndT等位基因的純合野生型材料以及攜帶這2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料加以區(qū)分。2、區(qū)分光敏不育和野生型等位基因的功能性HRM分子標記直接利用PCR引物LR-F/LR-R進行HRM的Scanning分型時，不能夠很好的將不同類型的材料進行區(qū)分，因此針對突變位點設(shè)計了 3’末端封閉的探針引物，堿基序列為:5’ -GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’ ；利用PCR引物LR-F/LR-R和探針引物根據(jù)HRM分析要求進行不對稱PCR擴增，積累與探針序列相互互補配對的那條引物的擴增產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物直接在HRM分析儀(如LightScanner)分析。如圖2a所示，擴增產(chǎn)物在HRM分析儀可以獲得每個樣本的溶解曲線，這些溶解曲線在60 70°C區(qū)段釋放的熒光信號強度明顯不同，因此擴增產(chǎn)物隨著溫度的變化具有的不同的溶解曲線，表明屬于不同的基因類型。通過軟件Grouping分組分析,可以看到與探針序列完全互補配對的純合光敏不育類型IncRg在較高溫度(68°C附近)出現(xiàn)溶解峰，而不與探針序列完全互補配對的純合可育類型IndT在較低溫度(63°C附近)出現(xiàn)溶解峰，含有兩種基因型的雜合可育類型則在這兩個溫度處均出現(xiàn)峰值，因此可以直觀清楚地將不同樣本分為純合IncIT (只攜帶IncIT等位基因)、純合IncRg (只攜帶IncRg等位基因)和雜合基因型三類(圖2b)。可見只攜帶IncRg等位基因的純合光敏材料和只攜帶IndT等位基因的純合野生型材料以及攜帶2種等位基因的雜合(但雄性可育)材料根據(jù)溫度的變化具有不同的溶解曲線，通過分組操作，三種基因型可以直觀地加以區(qū)分。實施例2利用CAPS分子標記區(qū)分光敏不育和非光敏不育水稻品種2012年收集不同的水稻材料，包括純合的光敏不育系和含光敏不育基因的雜合型材料以及非光敏不育的材料。這些材料于2012年夏季種植于浙江大學實驗農(nóng)場，自田間處于營養(yǎng)生長期的植株取葉片備用。1、水稻基因組DNA的提取(I)將水稻葉片剪碎后置于2.0mL離心管中，同時放入一粒鋼珠，用組織碾磨儀磨碎；(2)加入 800 μ L CTAB 提取緩沖液(Tris-HCl, IOOmM, ρΗ8.0 ；EDTA, 20mM, ρΗ8.0 ；NaCl,500mM ；CTAB, 2%)，65°C水浴 40min,期間搖動 3-4 次；(3)加入等體積的氯仿:異戊醇(24:l,v/v)混合液，上下顛倒混勻，10000r/min離心 IOmin ；(4)轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，加入等體積_20°C預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置 _20°C下沉淀 30min, 10000r/min 離心 IOmin ；(5)棄上清液,70%乙醇洗漆I次，IOOOOrpm離心IOmin;(6)棄上清液，無水乙醇洗滌I次，自然風干，溶于適量(100-200 μ L) TE溶液中，-20°C保存。2、包含C — G變異的DNA片段的PCR擴增、酶切和分析以提取的水稻DNA為模板，采用實施例1中設(shè)計的特異性引物LR-F和LR-R，進行PCR擴增，PCR擴增的反應體系見表I。表I用于CAPS分子標記的PCR反應體系
權(quán)利要求
1.一種引物，其特征在于，堿基序列為: 上游引物:5 ’ -ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3，； 下游引物:5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。
2.如權(quán)利要求1所述的引物在水稻光敏雄性核不育基因IncR分型中的應用。
3.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，包括: (1)提取水稻樣品的DNA； (2)以DNA為模板，采用如權(quán)利要求1所述的引物，進行PCR擴增； (3 )用限制性內(nèi)切酶Rsa I對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，成像； (4)根據(jù)成像結(jié)果，判斷水稻樣品的基因型: 如果只出現(xiàn)414bp的特征帶，則該水稻樣品為攜帶IncR基因的純合非光敏不育材料；如果只出現(xiàn)329bp和85bp兩條特征帶，則該水稻樣品為攜帶突變型IncR基因的純合光敏雄性不育材料； 如果出現(xiàn)414bp、329bp和85bp三條特征帶，則該水稻樣品為攜帶IncR基因和突變型IncR基因的雜合材料。
4.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述PCR擴增的體系可以為:2XPCRMasterMix, 10 μ L ;10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M 的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L 的 DNA, IyL ；補充無菌水至20 μ L0
5.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述PCR擴增的程序為:94°C預變性5min；94°C變性 30s，50-60。。退火 30s，72。。延伸 30s，共 35-45 個循環(huán)；72°C延伸 7min。
6.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，包括: (1)提取水稻樣品的DNA； (2)以DNA為模板，采用探針引物和如權(quán)利要求1所述的引物，進行PCR擴增；其中，所述探針引物的喊基序列為:5’ -GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’ ； (3 )獲取PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線，判斷水稻樣品的基因型: 如果只在62 64°C出現(xiàn)特征峰，則該水稻樣品為攜帶IncR基因的純合非光敏不育材料； 如果只在67 69°C出現(xiàn)特征峰，則該水稻樣品為攜帶突變型IncR基因的純合光敏雄性不育材料； 如果在62 64°C和67 69 °C均出現(xiàn)特征峰，則該水稻樣品為攜帶IncR基因和突變型IncR基因的雜合材料。
7.如權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述PCR擴增的體系為:2XPCRMasterMix, 10 μ L ; 10 μ M的上游引物，0.02 μ L ; 10 μ M的下游引物，0.2 μ L ; 10 μ M的探針引物，I μ L ;10XLC green-Plus, I μ L ；25ng/y L 的 DNA, I μ L ;補充無菌水至 6.78 μ L ;礦物油10_20u L0
8.如權(quán)利要求1所述的引物在選育光敏雄性核不育水稻中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物及其應用，其中所述引物的堿基序列為上游引物5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’；下游引物5’-CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。本發(fā)明還提供了所述引物在水稻光敏雄性核不育基因lncR分型中的應用，以及在光敏雄性核不育水稻選育中的應用。本發(fā)明用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物特異性好，將其運用到CAPS或HRM分子標記中，對水稻光敏雄性核不育基因lncR進行分型，簡單，有效，準確率高。
文檔編號C12Q1/68GK103146696SQ20131009697
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者舒慶堯, 張華麗, 黃建中 申請人:浙江大學, 浙江之豇種業(yè)有限責任公司, 無錫求是生物農(nóng)業(yè)有限公司