天然花青素活性苷元的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然花青素活性苷元的提取方法。它屬生物工程【技術領域】。它是由下列步驟組成的：含花青素植物的分類粉碎、吸水、冰凍、加熱解凍、壓榨、過濾制汁，以裂解花色苷糖苷鍵的糖苷酶對花色苷進行生物降解，以陰離子表面活性劑進行化合反應沉淀/懸浮，再到細菌微生物對沉淀/懸浮物進行降解，花青素水溶液殺菌、過濾酶和細菌，冷凍干燥。本發(fā)明技術可得到真實含量在95％以上的陽離子花青素而非花色苷。本發(fā)明制得的陽離子花青素不需人體腸道微生物降解，而直接被人體吸收利用或直接進入人體血液。用于醫(yī)療、保健。
【專利說明】天然花青素活性苷元的提取方法 所屬【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】的一種植物陽離子花青素的提取方法，尤其是天然 花青素活性苷元的提取方法。

【背景技術】：
[0002] 隨著人們生活水平的提高和對天然植物性來源的無毒無害的有利于保護人們身 體健康、防病治病的天然有機物質的追求，同時也由于人工合成色素對人體有較大的毒副 作用，已被世界衛(wèi)生組織所禁止使用，又由于花青素工業(yè)合成技術投資大、技術復雜不穩(wěn) 定、產(chǎn)品質量差，而無法為人類服務。因此高效無毒的天然陽離子花青素活性苷元及其提取 方法已成為21世紀新興前沿研究課題。
[0003] 但是現(xiàn)有的"花青素"分離提取技術（除中國專利申請200910185829. 2外）只 是得到含花青素的花色苷，且含量太低，雜質太多，因此其大多用在食品染色和化妝品的著 色，醫(yī)療保健價值低?，F(xiàn)有的超聲波、微生物降解破壞植物組織細胞壁，萃取等分離純化技 術提取得到的花色苷與真正對人體有保健、防病治病作用的陽離子花青素有著本質的區(qū) 另IJ。花色苷是植物體內陽離子花青素即花色基元與各種單糖通過糖苷鍵結合形成的糖苷。 這是一種中性物質，生物活性低，在人體內只有通過人體腸道菌降解脫糖形成陽離子花青 素即花青素活性苷元才能被人體吸收利用，消除人體內有害的自由基，防病治病，但這種中 性的花色苷在人體中降解、代謝率很低，生物利用率低，因而人體對其吸收率也很低。
[0004] 再加上人的個體生物轉化功能差異很大，特別是中老年人和病人的腸道對花色苷 的降解吸收程度更低。因而人體外工業(yè)化植物花色苷的降解和陽離子花青素的分離提取就 顯得特別重要。這對于從根本上保護人們的身體健康、防病治病具有重大的現(xiàn)實意義。
[0005] 花色苷較花青素活性苷元穩(wěn)定，但那是以犧牲花青素活性苷元的生物活性為代價 的?；ㄉ张c花青素是本質上完全不同的概念。即使花色苷能進入人體血液，但人體血液 (弱堿性）不可能提供酸性環(huán)境使花色苷的糖苷鍵得到降解而得到花青素，花青素中的在 人體血液中可解離出氫離子的活性羥基在花色苷中是不存在的。天然植物中游離的花青素 極少見。
[0006] 現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)技術，只有中國專利申請，申請?zhí)枺?00910185829. 2、申請日： 2009.12.07、公開（公告）日：2010.06.30、公開（公告）號<附017604974、主分類號 ： C12P39/00 (2006. 01) I、發(fā)明創(chuàng)造名稱：植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法，是花 青素即活性苷元的工業(yè)化提取技術。但由于花青素生物活性強，化學結構不穩(wěn)定，只有在低 溫/酸性或干燥條件下才穩(wěn)定，在酸性加熱條件下易分解，而成為水不溶性物質喪失其生 物活性，所以上述專利申請對微生物降解產(chǎn)物（包括微生物、酶和花青素）用70°C -KKTC 的溫度進行加熱殺菌，這必將使10% -50%的花青素分解變性成為水不溶性物質喪失其生 物活性，浪費了極為寶貴的花青素生物資源，增加了花青素生產(chǎn)成本。


【發(fā)明內容】
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[0007] 為有效地克服目前現(xiàn)有花青素分離提取技術的缺陷，充分和有效利用資源，降低 生產(chǎn)成本，本發(fā)明提供一種更簡單可靠、技術可操作性強、生產(chǎn)成本更低、效果好的天然花 青素活性苷元的提取方法。本發(fā)明的陽離子花青素活性苷元、陽離子花青素、陽離子花青 素苷元、花青素活性苷元、花青素，其概念意義相同。對含花青素的黑米原材料，用水直接浸 泡，不需粉碎，以代替技術方案的第一步驟。
[0008] 本發(fā)明利用陽離子花青素和陰離子表面活性劑的鹽在常溫及其以下溫度條件下 難以在水中電離而呈水不溶性的沉淀物或懸浮物這一性質，實現(xiàn)花青素與水及其其中的雜 質的高選擇定向分離。陰離子表面活性劑中的親油基C鏈越長，其親油性越強、親水性越 差，越容易與陽離子物質（包括陽離子花青素）化合沉淀或懸浮，同時水的溫度越低，其沉 淀或懸浮效果越好；親油基碳（C)鏈較短的陰離子表面活性劑的鹽的沉淀或懸浮溫度較 低，親油基碳（C)鏈較長的陰離子表面活性劑的鹽的沉淀或懸浮溫度較高。
[0009] 硅藻土不親水，在水溶液中完全沉淀，并可吸收微生物（酶）共沉淀，但不能吸收 水溶性的花青素。微生物絮凝劑可吸附水不溶性的物質（包括死亡微生物和失活生物酶）， 但不能吸附水溶性的花青素，其功效與硅藻土相同。
[0010] 本發(fā)明專性好氧細菌微生物對陰離子表面活性劑的降解是根據(jù)《環(huán)境污染物生物 降解》[夏北成編著，化學工業(yè)出版社、環(huán)境科學與工程出版中心出版發(fā)行，2002年3月第1 版，2002年3月北京第1次印刷，ISBN7-5025-3710-4/X · 147,（京）新登字039號，中國 版本圖書館CIP數(shù)據(jù)核字（2002)第004930號，186頁、179頁、54頁、43頁、42頁、35頁、34 頁]，但細菌不產(chǎn)生多酚氧化酶，所以其只能降解陰離子表面活性劑，而不能降解酚類物質 陽離子花青素。中國專利申請200910185829. 2已授權。
[0011] 本發(fā)明所述陰離子表面活性劑都能被本發(fā)明所述的專性好氧細菌完全降解；陰離 子表面活性劑中的親水基-so廣和-C0CT都能夠被好氧細菌通過細胞膜吸收降解；C元素為 細菌提供必要的C源和能量而被降解；0元素支撐好氧細菌的無分子氧的無氧呼吸而被降 解；S元素在好氧細菌體內轉化為H2S并排出體外而被降解，含H 2S的水溶液干燥后，H2S氣 體被回收；c元素在10-22之間的直鏈烷烴及與之相連的苯環(huán)都是易被本發(fā)明好氧細菌完 全降解的。
[0012] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0013] 1、本發(fā)明提取方法包括以下步驟：
[0014] 一、原材料預處理：新鮮含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡蘿卜、藍靛果，進行 分類一粉碎一食用軟水浸泡吸水一冰凍破壞植物組織細胞壁一加熱解凍一壓榨一過濾制 汁備用（1)-殘渣適當加水一浸泡攪拌一壓榨一過濾制汁備用（2);
[0015] 二、將上述壓榨過濾水溶液（1)和（2)合在一起，并將其水溫調節(jié)到下述降解生物 酶的最適范圍；
[0016] 三、將上述產(chǎn)物以可裂解花色苷糖苷鍵的β-葡萄糖苷酶（β-糖苷酶）進行生物 降解，先低速攪拌，轉速50轉/分-100轉/分，后靜置，使花色苷中的糖苷鍵被降解而得到 陽離子花青素活性苷元；裂解和降解時間10小時-24小時，溫度25°C -50°C、PH4. 5-ΡΗ5 ;
[0017] 四、將上述產(chǎn)物再加入相對于陽離子花青素稍微過量的陰離子表面活性劑，如 十六烷基硫酸銨（C 16H330S03NH4)、十八烷基硫酸鈉、脂肪酸鈉鹽（RCOONa，R = C12-C22烷基） 或脂肪酸鉀鹽、直鏈烷基苯磺酸鈉（ClcrC 22)，上述陰離子表面活性劑的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽在 本發(fā)明的應用功能/效果相同；以中速攪拌，轉速600轉/分-1400轉/分，其化合反應溫 度為30°C -50°C，使之充分反應后靜置，再降溫，使水溶液溫度為1°C -25°C，使陽離子花青 素大多被化合沉淀或懸浮為止；這有利于反應物的快速完全沉淀或懸??；
[0018] 五、取出上述含水化合物，選擇專性好氧細菌，在密封容器內輸入氧氣進行微生物 降解，可加入少量無菌飲用水，在先低速攪拌后靜置中進行，攪拌速度30轉/分-50轉/分 左右，使所加入的陰離子表面活性劑被細菌微生物降解，恢復花青素的陽離子活性和水溶 性；
[0019] 具體可用節(jié)桿菌屬、微球菌屬、諾卡氏菌屬、不動桿菌屬、短桿菌屬、黃桿菌屬這些 微生物中的一種或幾種的組合進行生物降解；
[0020] 降解時間10小時-24小時，降解溫度20°C -30°c，PH5-PH7 ;用檸檬酸等有機酸調 節(jié)PH值；假單孢菌屬中的不產(chǎn)生水溶性色素的菌株也可使用；
[0021] 六、將上述好氧細菌微生物降解產(chǎn)物進行殺菌和去除細菌及生物酶處理，溫度 1°C -30°C，得陽離子花青素水溶液產(chǎn)品：
[0022] ( -將上述細菌降解產(chǎn)物密封，并停止供應氧氣，保持時間24小時-72小時； 或抽真空排除氧氣，壓強不大于25pa，保持時間24小時-72小時；使好氧細菌因缺少氧氣 或/和缺少C營養(yǎng)源而死亡成疏水的細菌殘體；
[0023] (二）必要時需攪拌，使花青素充分溶于水而與細菌殘體分離，攪拌速度300轉/ 分-3000轉/分，時間10分鐘-60分鐘，過濾，清除細菌殘體；
[0024] (三）·用高剪切攪拌，轉速1000轉/分-3000轉/分，時間30分鐘-60分鐘，使 花青素水溶液中的生物酶失去活性和失去親水性；
[0025] (四）.用陶瓷膜過濾；或用硅藻土 /微生物絮凝劑在攪拌中吸附失去活性的生物 酶殘體，靜置，使硅藻土 /微生物絮凝劑和生物酶殘體沉淀析出，再用陶瓷膜過濾殘留的生 物酶殘體；徹底清除生物酶和殘留的好氧細菌殘體；
[0026] (五）.得到只含花青素的弱酸性水溶液，用食品級鹽酸（HCL)調節(jié)PH值， PH5-PH6. 9 ;上述（二）中，是用陶瓷膜或硅藻土或微生物絮凝劑過濾；
[0027] 七、將上述只含花青素的弱酸性水溶液進行真空冷凍干燥，并回收過量的HCL氣 體，溫度_40°C -1°C，壓強不大于25pa，時間24小時；得花青素活性苷元干品。
[0028] 2、所述提取方法優(yōu)選為：
[0029] 它是由下列步驟組成的：
[0030] 一、原材料預處理：新鮮含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡蘿卜、藍靛果，進行 分類一粉碎一食用軟水浸泡吸水一冰凍破壞植物組織細胞壁一加熱解凍一壓榨一過濾制 汁備用（1)-殘渣適當加水一浸泡攪拌一壓榨一過濾制汁備用（2);
[0031] 二、將上述壓榨過濾水溶液（1)和（2)合在一起，并將其水溫調節(jié)到下述降解生物 酶的最適范圍；
[0032] 三、將上述產(chǎn)物以可裂解花色苷糖苷鍵的葡萄糖苷酶糖苷酶）進行生物 降解，先低速攪拌，50轉/分，后靜置，使花色苷中的糖苷鍵被降解而得到陽離子花青素活 性苷元；
[0033] 裂解和降解時間24小時，溫度50°C、ΡΗ5 ;
[0034] 四、將上述產(chǎn)物再加入相對于陽離子花青素稍微過量的陰離子表面活性劑十六烷 基硫酸銨（C16H330S03NH4)，以中速攪拌，600轉/分，化合反應溫度50°C，使之充分反應后靜 置，再降溫，使水溶液溫度為5°C，使陽離子花青素大多被化合沉淀或懸浮為止；這有利于 反應物的快速完全沉淀或懸?。?br> [0035] 五、取出上述含水化合物，選擇專性好氧細菌，進行微生物降解，可加入少量無菌 飲用水，在先低速攪拌后靜置中進行，攪拌速度30轉/分左右，使所加入的陰離子表面活性 劑被微生物降解，恢復花青素的陽離子活性和水溶性；
[0036] 具體可用諾卡氏菌屬、不動桿菌屬這些微生物中的一種或幾種的組合進行生物降 解；
[0037] 降解時間24小時，降解溫度25°C，PH6 ;用檸檬酸調節(jié)PH值；
[0038] 六、將上述細菌微生物降解產(chǎn)物進行殺菌和去除細菌及生物酶處理，溫度 1°C -30°C，得陽離子花青素水溶液產(chǎn)品：
[0039] ( -將上述細菌降解產(chǎn)物密封，并停止供應氧氣和排除容器內殘留的氧氣，保 持時間72小時；使好氧細菌因缺少氧氣或/和缺少C營養(yǎng)源而死亡成疏水的細菌殘體；
[0040] (二）.必要時需攪拌，使花青素充分溶于水而與細菌殘體分離，攪拌速度3000轉 /分，時間10分鐘，用硅藻土過濾，清除細菌微生物殘體；
[0041] (三）.用高剪切攪拌，轉速3000轉/分，時間30分鐘，使花青素水溶液中的生物 酶失去活性和失去親水性；
[0042](四）.用陶瓷膜過濾；徹底清除生物酶和殘留的好氧細菌殘體；
[0043] (五）.得到只含花青素的弱酸性水溶液，用食品級鹽酸（HCL)調節(jié)PH值，PH6 ;陶 瓷膜是非極性無機膜，很容易將疏水的細菌和酶與花青素分離；
[0044] 七、將上述只含花青素的弱酸性水溶液進行真空冷凍干燥，并回收過量的HCL氣 體，溫度_40°C，壓強15pa，時間24小時；得花青素活性苷元干品。
[0045] 本發(fā)明的有益效果是：
[0046] 1、本發(fā)明最大限度地避免了殺菌生產(chǎn)過程中對花青素活性苷元的破壞，大幅度提 高花青素活性苷元的產(chǎn)出率，大幅度提高了資源的利用效率，節(jié)約了原材料，杜絕了花青素 變性廢棄物的排放，也節(jié)約了能源，大幅度降低了花青素生產(chǎn)成本。這是花青素生產(chǎn)中極為 重要的和關鍵的技術要求。
[0047] 2、本發(fā)明能夠得到真實含量在95%以上的陽離子花青素產(chǎn)品，并不含有細菌厭氧 降解的產(chǎn)物（可能還含有少量的未充分干燥的水分）。
[0048] 3、本發(fā)明的生物酶降解產(chǎn)物陽離子花青素以陰離子表面活性劑化合反應沉淀/ 懸浮步驟及其與陽離子花青素和陰離子表面活性劑的化合物的好氧細菌微生物降解步驟、 和殺菌去除生物酶及細菌步驟的有序組合是本發(fā)明的核心技術即創(chuàng)新必要技術特征。
[0049] 4、本發(fā)明需在無有害微生物的環(huán)境中進行。
[0050] 5、本發(fā)明所采用的陰離子表面活性劑的選擇要求：
[0051] (一）對微生物無毒或低毒；（二）碳鏈較短（C1Q-C22)，含直鏈親油基；（三）生物 降解性好，降解比較迅速、徹底；（四）只含C、H、0、S、N、P這些可轉化為氣態(tài)物質和水的元 素或維持微生物生命活動所必需的元素；（五）對陽離子物質或陽離子化學基團敏感； 【具體實施方式】：
【權利要求】
1.天然花青素活性苷元的提取方法，其特征在于： 一、 原材料預處理：新鮮含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡蘿卜、藍靛果，進行分類 -粉碎一食用軟水浸泡吸水一冰凍破壞植物組織細胞壁一加熱解凍一壓榨一過濾制汁備 用（1)-殘渣適當加水一浸泡攪拌一壓榨一過濾制汁備用（2); 二、 將上述壓榨過濾水溶液（1)和（2)合在一起，并將其水的溫度調節(jié)到下述第三步降 解生物酶的最適范圍； 三、 將上述第二步產(chǎn)物以可裂解花色苷糖苷鍵的β-葡萄糖苷酶即β-糖苷酶進行生 物降解，先低速攪拌，50轉/分-100轉/分，后靜置，使花色苷中的糖苷鍵被降解而得到陽 離子花青素活性苷元；裂解和降解時間10小時-24小時，溫度25°C -50°C、PH4. 5-ΡΗ5 ; 四、 將上述第三步產(chǎn)物再加入相對于陽離子花青素稍微過量的十六烷基硫酸銨 (C16H330S0 3NH4)、或十八燒基硫酸鈉、或脂肪酸鈉鹽或脂肪酸鉀鹽、或直鏈燒基苯磺酸鈉，上 述陰離子表面活性劑的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽在本發(fā)明的應用功能/效果相同，以中速攪拌， 600轉/分-1400轉/分，化合反應溫度30°C -50°C，使之充分反應后靜置，再降溫，使水溶 液溫度為1°C -25°C ;使陽離子花青素大多被化合反應沉淀或懸浮為止；這有利于反應物的 快速完全沉淀或懸浮； 五、 取出上述第四步含水化合物，選擇專性好氧細菌，進行微生物降解，可加入少量無 菌飲用水，在先低速攪拌后靜置中進行，攪拌速度30轉/分-50轉/分，使所加入的陰離子 表面活性劑被專性好氧細菌降解；恢復花青素的陽離子活性和水溶性；所述專性好氧細菌 為節(jié)桿菌屬、微球菌屬、諾卡氏菌屬、不動桿菌屬、短桿菌屬、黃桿菌屬這些微生物中的一種 或幾種的組合； 所述專性好氧細菌還包括假單孢菌屬中的不產(chǎn)生水溶性色素的菌株； 降解時間10小時-24小時，降解溫度20°C -30°C，PH5-PH7 ; 六、 將上述第五步好氧細菌微生物降解產(chǎn)物進行殺菌和去除細菌及生物酶處理，溫度 1°C -30°C，得陽離子花青素水溶液產(chǎn)品： (一） .將上述第五步好氧細菌微生物降解產(chǎn)物密封，并停止供應氧氣，保持時間24小 時-72小時；或抽真空排除氧氣，壓強不大于25pa，保持時間24小時-72小時；使好氧細菌 微生物因缺少氧氣或/和缺少C營養(yǎng)源而死亡成疏水的細菌殘體； (二） .必要時需攪拌，使花青素充分溶于水而與好氧細菌微生物殘體分離，攪拌速度 300轉/分-3000轉/分，時間10分鐘-60分鐘，用硅藻土 /微生物絮凝劑過濾；清除好氧 細菌微生物殘體； (三） .用高剪切攪拌，轉速1〇〇〇轉/分-3000轉/分，時間30分鐘-60分鐘；使花青 素水溶液中的生物酶失去活性和失去親水性； (四） .用陶瓷膜過濾；或用硅藻土 /微生物絮凝劑在攪拌中吸附失去活性的生物酶殘 體，靜置，使硅藻土 /微生物絮凝劑和生物酶殘體沉淀析出，再用陶瓷膜過濾殘留的生物酶 殘體；徹底清除生物酶和殘留的好氧細菌殘體； (五） .得到只含花青素的弱酸性水溶液，用食品級鹽酸（HCL)調節(jié)PH值，PH5-PH6.9 ; 上述（二）中還可以用陶瓷膜過濾； 七、 將上述第六步只含花青素的弱酸性水溶液進行真空冷凍干燥，并回收過量的HCL 氣體，溫度_40°C -1°C，壓強不大于25pa，時間24小時；得花青素活性苷元干品。
【文檔編號】C12P17/06GK104059951SQ201310112792
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權日:2013年3月18日
【發(fā)明者】耿兆翔 申請人:耿兆翔