專利名稱：高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領域，更具體地，涉及一種高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
乳酸菌是動物腸道內(nèi)常見的一類益生菌，它能夠改善動物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡、抑制病原菌的生長、促進消化、提高人體免疫力等功效。目前以其作為有效成分的產(chǎn)品也是琳瑯滿目，因此也刺激了乳酸菌發(fā)酵工業(yè)的興起。但目前的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝所生產(chǎn)的乳酸菌，存在菌濃度低，發(fā)酵時間長，工藝復雜，存活率低等缺點，使得發(fā)酵出來的乳酸菌成本偏高，也使得乳酸菌類產(chǎn)品的成本一直居高不下，成為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的瓶頸問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對乳酸菌發(fā)酵中的技術(shù)不足，提供一種高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):提供一種高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，包括以下步驟:S1.構(gòu)建纖維床反應器；S2.準備培養(yǎng)基 :將配制好的乳酸菌培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，在121°C滅菌15 20min后備用；S3.往培養(yǎng)基中接入活化后的乳酸菌種子液，接種量為培養(yǎng)基總體積的5 10% ；S4.調(diào)節(jié)溫度為30 40°C，調(diào)節(jié)pH值為6.0 6.5，進行發(fā)酵培養(yǎng)，并定時取樣檢測菌數(shù)；S5.當菌數(shù)達到101Qcfu/ml以上時停止發(fā)酵。其中，S1.所述的纖維床反應器主要包括反應器主體，反應器主體上設置有進料口、出料口、采樣口、加熱系統(tǒng)、pH電極、溫度電極，在反應器內(nèi)設攪拌裝置，以及固定在反應器內(nèi)的纖維材料，還可以包括控制溫度和PH值的控制系統(tǒng)。所述纖維材料作為固定化乳酸菌細胞的載體，能夠在液體發(fā)酵時大幅度提高乳酸菌細胞數(shù)量。針對乳酸菌，本發(fā)明采用植物纖維或合成纖維的一種或兩種作為本發(fā)明反應器中纖維床材料，優(yōu)選地，所述植物纖維包括:棉纖維、竹纖維、秸桿纖維。優(yōu)選地，所述合成纖維包括:聚酯纖維、聚酰胺纖維和聚丙烯腈纖維。S2所述培養(yǎng)基為:3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2.5%的葡萄糖(g/L)、0.5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L),蒸懼水定容至1L。本發(fā)明如單獨使用進行序批式發(fā)酵，即可從反應器的出料口將發(fā)酵液全部排出收集進行下游處理，同時準備下一批次發(fā)酵；如單獨使用進行連續(xù)式發(fā)酵，一邊從反應器的出料口排出發(fā)酵液一邊從反應器的進料口流加新鮮培養(yǎng)基，使其在保證菌數(shù)的前提下達到動態(tài)平衡，持續(xù)發(fā)酵，同時將排出來的發(fā)酵液進行下游處理。
所述生物反應器可以單獨使用，也可以作為種子罐與普通生物發(fā)酵罐聯(lián)合使用；如將本發(fā)明纖維床反應器作為種子罐與常規(guī)乳酸菌生產(chǎn)發(fā)酵用的普通發(fā)酵罐并聯(lián)，發(fā)酵結(jié)束時，關(guān)閉循環(huán)泵，切斷相互聯(lián)通管，全部放出或部分放出生產(chǎn)發(fā)酵罐的菌液作下游處理；之后再填加新的發(fā)酵培養(yǎng)基，聯(lián)通纖維床種子罐，開啟循環(huán)，進行第二批發(fā)酵。所述生物反應器優(yōu)選設有自控pH、溫度的控制系統(tǒng)系統(tǒng)實現(xiàn)自控發(fā)酵。本發(fā)明所述的乳酸菌優(yōu)選嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、屎腸球菌或嗜熱鏈球菌中的一種或多種，采用多菌種時，混合的比例不做嚴格要求。采用傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵方法，菌數(shù)濃度低，發(fā)酵時間長，工藝復雜，存活率低。纖維床反應器雖然已有報道，但都只能應用于發(fā)酵生產(chǎn)乙酸或丙酸，未見應用于乳酸菌發(fā)酵，主要的原因是:乳酸菌容易退化和失活，而且產(chǎn)生的乳酸一旦積累到一定的濃度就會反饋抑制乳酸菌菌體細胞的生長繁殖，從而使得菌體細胞數(shù)量很難提高，這些技術(shù)難題沒有找到有效合理的方法解決。高質(zhì)量、高效率的有益菌生產(chǎn)離不開高性能的發(fā)酵罐支持。本發(fā)明成功將纖維床反應器技術(shù)應用于乳酸菌發(fā)酵，主要是從這幾個方面進行了改進和優(yōu)化:第一，本發(fā)明通過不斷分析總結(jié)，針對乳酸菌提供了特定的纖維床材料，主要包括植物纖維或合成纖維，植物纖維包括棉纖維、竹纖維、秸桿纖維三種。合成纖維包括聚酯纖維、聚酰胺纖維和聚丙烯腈纖維三種；第二，優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，現(xiàn)有技術(shù)通常采用脫脂復原乳作為培養(yǎng)基組分，本發(fā)明采用水解乳清蛋白和玉米汁作為培養(yǎng)基主要組分，并精確限定各組分之間的合理比例，在新的纖維床和培養(yǎng)基結(jié)合條件下，為乳酸菌提供適宜的發(fā)酵環(huán)境；第三，本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件，選擇30 40°C為發(fā)酵溫度、選擇pH值為
6.0-6.5為發(fā)酵pH值，在本發(fā)明提供的上述條件下，菌體細胞產(chǎn)量提高了 5-10倍左右，為乳酸菌類產(chǎn)品提供高產(chǎn)量的菌體細胞，產(chǎn)品具有活菌數(shù)多、穩(wěn)定性高、制備簡單和使用方便等特點，克服目前我國工業(yè)化生產(chǎn)中的不足，提升乳酸菌制品的產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明成功將纖維材料作為固定化乳酸菌細胞的載體安裝于反應器內(nèi)部，并總結(jié)得到在纖維床和特定的發(fā)酵條件下，實現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵時大幅度提高乳酸菌細胞數(shù)量。本發(fā)明生物反應器可單獨使用，也可以進一步將纖維床反應器作為種子發(fā)酵罐與普通反應器并聯(lián)使用進行批次序列發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，具有生產(chǎn)效率高，批次生產(chǎn)穩(wěn)定，縮短發(fā)酵周期，細胞密度高等特點，所使用的纖維材料廉價，裝置簡單，操作方便，生產(chǎn)成本低，能很好地應用于嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌等乳酸菌細胞的工業(yè)化生產(chǎn)，對推動我國發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。


圖1本發(fā)明乳酸菌的纖維床反應器結(jié)構(gòu)示意圖；圖2本發(fā)明實施例4發(fā)酵系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所 使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從常規(guī)商業(yè)途徑獲得的試劑和材料。實施例1S1.構(gòu)建纖維床反應器；如附圖1所示。附圖1提供了一種纖維床反應器的結(jié)構(gòu)示意圖，包括反應器主體3，反應器主體3外部設有加熱裝置9，在反應器主體3上端設有進料口 1、采樣口 2和酸堿補料系統(tǒng)6，反應器主體3下端設置出料口 11，反應器主體3內(nèi)固定設置有纖維材料10，反應器主體3內(nèi)設置攪拌裝置4、pH電極7、溫度電極8，酸堿補料系統(tǒng)6、pH電極7和溫度電極8與控制系統(tǒng)5相連接，可以實時地將pH和溫度反饋到控制系統(tǒng)5，通過酸堿補料系統(tǒng)6和加熱系統(tǒng)9實現(xiàn)自動化控制。S2所述培養(yǎng)基為:3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2.5%的葡萄糖(g/L)、
0.5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L)，蒸懼水定容至IL配制成培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，121°C滅菌15 20min后備用；S3.往培養(yǎng)基中接入經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基活化后的嗜酸乳桿菌種子液，接種量為培養(yǎng)基總體積的5 10% ；S4.調(diào)節(jié)溫度為35°C，調(diào)節(jié)pH值為6.0，進行發(fā)酵培養(yǎng)，并定時取樣檢測菌數(shù)；S5.當菌數(shù)達到101(lCfu/ml以上時停止發(fā)酵。從出料口將發(fā)酵液全部排出收集進行下游處理，同時準備下一批次發(fā)酵。也可以如單獨使用反應器進行連續(xù)式發(fā)酵，邊從出料口 11排出發(fā)酵液邊從進料口 I流加新鮮培養(yǎng)基，使其在保證菌數(shù)的前提下達到動態(tài)平衡，持續(xù)發(fā)酵，同時排出來的發(fā)酵液進行下游處理。本實施例采用的纖維床材料為棉纖維。發(fā)酵完成后菌數(shù)可達到8.5X1010cfu/ml,且通過發(fā)酵罐可以高穩(wěn)定持續(xù)的·生產(chǎn)菌體，不需要重新接種。而采用相同的菌種、發(fā)酵溫度和PH值以及相同培養(yǎng)基常規(guī)液體發(fā)酵相同時間后，菌數(shù)只有3.4X109cfu/mL.
實施例2S1.構(gòu)建纖維床反應器；同實施例1 ;S2所述培養(yǎng)基為:3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2.5%的葡萄糖(g/L)、
0.5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L)，蒸懼水定容至IL配制成培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，121°C滅菌15 20min后備用；S3.往培養(yǎng)基中接入經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基活化后的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌種子液，接種量分別為培養(yǎng)基總體積的3%和3% ；S4.調(diào)節(jié)溫度為37°C，調(diào)節(jié)pH值為6.5，進行發(fā)酵培養(yǎng)，并定時取樣檢測菌數(shù)；S5.當菌數(shù)達到101(lCfu/ml以上時停止發(fā)酵。從出料口將發(fā)酵液全部排出收集進行下游處理，同時準備下一批次發(fā)酵。也可以如單獨使用反應器進行連續(xù)式發(fā)酵，邊從出料口 11排出發(fā)酵液邊從進料口 I流加新鮮培養(yǎng)基，使其在保證菌數(shù)的前提下達到動態(tài)平衡，持續(xù)發(fā)酵，同時排出來的發(fā)酵液進行下游處理。本實施例采用的纖維床材料為竹纖維。發(fā)酵完成后菌數(shù)可達到2.4X1010cfu/ml,且通過發(fā)酵罐可以高穩(wěn)定持續(xù)的生產(chǎn)菌體，不需要重新接種。而采用相同的菌種、發(fā)酵溫度和PH值以及相同培養(yǎng)基常規(guī)液體發(fā)酵相同時間后，菌數(shù)只有5.4X109cfu/mL.
實施例3S1.構(gòu)建纖維床反應器；同實施例1 ;S2所述培養(yǎng)基為:3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2.5%的葡萄糖(g/L)、0.5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L)，蒸懼水定容至IL配制成培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，121°C滅菌15 20min后備用；S3.往培養(yǎng)基中接入經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基活化后的嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌種子液，接種量分別為培養(yǎng)基總體積的2%、2%和2% ；S4.調(diào)節(jié)溫度為37°C，調(diào)節(jié)pH值為6.4，進行發(fā)酵培養(yǎng)，并定時取樣檢測菌數(shù)；S5.當菌數(shù)達到101(lCfu/ml以上時停止發(fā)酵。從出料口將發(fā)酵液全部排出收集進行下游處理，同時準備下一批次發(fā)酵。也可以如單獨使用反應器進行連續(xù)式發(fā)酵，邊從出料口 11排出發(fā)酵液邊從進料口 I流加新鮮培養(yǎng)基，使其在保證菌數(shù)的前提下達到動態(tài)平衡，持續(xù)發(fā)酵，同時排出來的發(fā)酵液進行下游處理。本實施例采用的纖維床材料為聚酯纖維，發(fā)酵完成后三種菌總菌數(shù)可達到6.2X101(lCfU/ml，且通過發(fā)酵罐可以高穩(wěn)定持續(xù)的生產(chǎn)菌體，不需要重新接種。而采用相同的菌種、發(fā)酵溫度和PH值以及相同培養(yǎng)基常規(guī)液體發(fā)酵相同時間后，三種菌總菌數(shù)只有
2.9X109cfu/ml。實施例4S1.構(gòu)建纖維床反應器作為種子罐，結(jié)構(gòu)同實施例1 ;將常規(guī)的發(fā)酵罐13作為生產(chǎn)發(fā)酵罐，將纖維生物反應器的種子發(fā)酵罐和生產(chǎn)發(fā)酵罐和循環(huán)裝置12組裝起來滅菌備大規(guī)模連續(xù)式發(fā)酵生產(chǎn)用。循環(huán)裝置12維持纖維床生物反應器與普通發(fā)酵罐(13)之間培養(yǎng)液的循環(huán)。組裝后的系統(tǒng)如附圖2所示。S2所述培養(yǎng)基為·:3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2.5%的葡萄糖(g/L)、
0.5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L)，蒸懼水定容至IL配制成培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，121°C滅菌15 20min后備用；S3.將雙歧桿菌在37°C活化21h后接種到種子發(fā)酵罐中，開啟蠕動泵開始循環(huán)培養(yǎng)，培養(yǎng)21h后，當菌數(shù)達到lO'fu/ml以上時停止發(fā)酵，關(guān)閉循環(huán)泵12，切斷相互聯(lián)通管，全部放出或部分放出生產(chǎn)發(fā)酵罐的菌液作下游處理，補充新的培養(yǎng)基循環(huán)發(fā)酵，種子罐不變，達到高細胞密度發(fā)酵的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)；本實施例采用的纖維床材料為聚酰胺纖維。發(fā)酵完成后菌數(shù)可達到2.4 X IO10Cfu/ml，且通過發(fā)酵罐可以高穩(wěn)定持續(xù)的生產(chǎn)菌體，不需要重新接種。而采用相同的菌種、發(fā)酵溫度和PH值以及相同培養(yǎng)基常規(guī)液體發(fā)酵相同時間后，菌數(shù)只有5.4X109cfu/mL.
實施例5S1.發(fā)酵系統(tǒng)的組裝同實施例4。S2所述培養(yǎng)基為:3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2.5%的葡萄糖(g/L)、
0.5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L)，蒸懼水定容至IL配制成培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，121°C滅菌15 20min后備用；S3.往培養(yǎng)基中接入經(jīng)BS培養(yǎng)基活化后的雙歧桿菌種子液，接種量為培養(yǎng)基總體積的5 10% ；S4.發(fā)酵培養(yǎng):在控制系統(tǒng)5上將溫度和pH值設置到37°C，初始pH值為6.2，進行自控發(fā)酵，并定時取樣檢測菌數(shù)；S5.繼續(xù)擴大發(fā)酵:培養(yǎng)12h后，當生物反應器菌數(shù)達到101(lCfU/ml以上時，打開與普通發(fā)酵罐(普通發(fā)酵罐內(nèi)有滅菌后的新鮮培養(yǎng)基)的閥門，同時啟動循環(huán)泵，繼續(xù)發(fā)酵；S6.收集:培養(yǎng)24h時間后，當普通發(fā)酵罐內(nèi)菌數(shù)達到101Qcfu/ml以上時停止發(fā)酵，從出料口將發(fā)酵液全部排出收集進行下游處理，同時準備下一批次發(fā)酵。關(guān)閉循環(huán)泵，切斷相互聯(lián)通管，全部放出或部分放出生產(chǎn)發(fā)酵罐的菌液作下游處理；之后再填加新的發(fā)酵培養(yǎng)基，聯(lián)通纖維床種子罐，開啟循環(huán)，進行第二批發(fā)酵。本實施例采用的纖維床材料為竹纖維。發(fā)酵完成后菌數(shù)可達到2.4X1010cfu/ml,且通過發(fā)酵罐可以高穩(wěn)定持續(xù)的生產(chǎn)菌體，不需要重新接種。而采用相同的菌種、發(fā)酵溫度和PH值以及相同培養(yǎng) 基常規(guī)液體發(fā)酵相同時間后，菌數(shù)只有5.4X109cfu/mL.
權(quán)利要求
1.一種高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟 S1.構(gòu)建纖維床反應器； S2.準備培養(yǎng)基將配制好的乳酸菌培養(yǎng)基加入到纖維床反應器內(nèi)，121°C滅菌15 20min后備用； S3.往培養(yǎng)基中接入活化后的乳酸菌種子液，接種量為培養(yǎng)基總體積的5 10%； S4.調(diào)節(jié)溫度為30 40°C，調(diào)節(jié)pH值為6.O 6. 5，進行發(fā)酵培養(yǎng)，并定時取樣檢測菌數(shù)； S5.當菌數(shù)達到101(lCfu/ml以上時停止發(fā)酵； 其中，SI.所述的纖維床反應器主要包括反應器主體，反應器主體上設置有進料口、出料口、采樣口、加熱系統(tǒng)、PH電極、溫度電極，在反應器內(nèi)設攪拌裝置，以及固定在反應器內(nèi)的纖維材料； 所述纖維材料為植物纖維或合成纖維的一種或兩種； S2.所述培養(yǎng)基為3%的水解乳清蛋白(g/L)(食品級)、2 2. 5%的葡萄糖(g/L)、.O. 5 1%的七水合硫酸鎂(g/L)、10%的玉米衆(zhòng)(ml/L),蒸懼水定容至1L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，所述生物反應器設有控制系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，所述的乳酸菌優(yōu)選嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、屎腸球菌或嗜熱鏈球菌中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，所述植物纖維為棉纖維、竹纖維和秸桿纖維中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，所述合成纖維為聚酯纖維、聚酰胺纖維和聚丙烯腈纖維的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，SI.還包括將纖維床反應器作為種子發(fā)酵罐和生產(chǎn)發(fā)酵罐、循環(huán)裝置組裝得到連續(xù)式發(fā)酵生產(chǎn)用系統(tǒng)；所述循環(huán)裝置維持纖維床生物反應器與生產(chǎn)發(fā)酵罐之間培養(yǎng)液的循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領域，公開了一種高細胞密度的乳酸菌發(fā)酵方法。包括構(gòu)建纖維床反應器、準備培養(yǎng)基、接種、發(fā)酵培養(yǎng)、檢測菌數(shù)、收集發(fā)酵液等步驟。本發(fā)明成功將纖維材料作為固定化乳酸菌細胞的載體安裝于反應器內(nèi)部，并總結(jié)得到在纖維床和特定的發(fā)酵條件下，實現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵時大幅度提高乳酸菌細胞數(shù)量。本發(fā)明生物反應器可單獨使用，也可以進一步將纖維床反應器作為種子發(fā)酵罐與普通反應器并聯(lián)使用進行批次序列發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，具有生產(chǎn)效率高，批次生產(chǎn)穩(wěn)定，縮短發(fā)酵周期，細胞密度高等特點，所使用的纖維材料廉價，裝置簡單，操作方便，生產(chǎn)成本低，能很好地應用于嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌等乳酸菌細胞的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK103255083SQ20131013142
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者胡文鋒, 龐旭, 韓笑, 劉小陽, 楊虹坤, 劉秉杰, 楊益衡 申請人:胡文鋒