專利名稱：以整合型重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是以整合型重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法，并將生產(chǎn)得到的海藻糖合成酶用于制造海藻糖的方法。
背景技術(shù)：
海藻糖是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成，在自然界中廣泛存在的天然性二糖。它自身性質(zhì)非常穩(wěn)定，并對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有保護(hù)作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)海藻糖能廣泛應(yīng)用于各類食品的鮮味保持及質(zhì)地改善。隨著社會(huì)的進(jìn)步和人們生活水平的提高，人們對(duì)食品的質(zhì)量和口感日趨重視，這加大了人們對(duì)海藻糖的需求。因此，大規(guī)模的廉價(jià)高效生產(chǎn)海藻糖具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)也將更能推廣和普及海藻糖在食品領(lǐng)域的使用。研究已發(fā)現(xiàn)自然界中有多種酶系能夠合成海藻糖。其中一種是在許多微生物中都能發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)。此酶能夠?qū)Ⅺ溠刻侵苯愚D(zhuǎn)化成為海藻糖，比較適宜應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖。研究已發(fā)現(xiàn)來源于脂肪桿菌(Pimelobacter species) ,彎曲高溫單抱菌(Thermomonospora curvata),谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum),耐放射性異常球菌(Deinococcus radiodurans)以及水棲嗜熱菌(Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶能夠高效的將麥芽糖轉(zhuǎn)化成為海藻糖。目前，已有的成功報(bào)道都是直接從原始菌株中培養(yǎng)分離，或者利用重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)。從原始菌株中培養(yǎng)分離往往因?yàn)樵季瓯磉_(dá)的酶活不高而影響大規(guī)模生產(chǎn)，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也存在一些缺陷，如含有內(nèi)毒素、腸毒素、難以分泌表達(dá)，產(chǎn)物需要破胞提取等，而且為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，在生產(chǎn)過程中一般需要使用抗生素。為了避免重組微生物發(fā)酵過程中殘留的抗生素類物質(zhì)對(duì)于食品安全的影響，國際上對(duì)微生物來源的酶制劑的抗菌活性有嚴(yán)格限制，中國在食品工業(yè)用酶制劑的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 25594— 2010)中也明確規(guī)定微生物來源的酶制劑不得檢出抗菌活性，這對(duì)食品用酶制劑提出了更高的要求?？莶菅挎邨U菌有長期制備發(fā)酵食品的歷史，是非致病的，不產(chǎn)內(nèi)毒素和致熱致敏蛋白質(zhì)，是一種食品安全的菌種。另外，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)還具有以下優(yōu)點(diǎn):1、具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌功能，不需要破碎細(xì)胞來提取蛋白質(zhì)，只需要較簡(jiǎn)單地處理發(fā)酵上清液即可得到較純的目標(biāo)蛋白質(zhì)。2、沒有明顯的密碼子偏愛性，同時(shí)表達(dá)產(chǎn)物也不容易形成包函體。3、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單。因此，開發(fā)利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)食品添加劑具有深遠(yuǎn)的意義和廣闊的市場(chǎng)前景。根據(jù)所采用載體類型不同，枯草芽孢桿菌表達(dá)模式可分為可復(fù)制質(zhì)粒表達(dá)和染色體整合表達(dá)。復(fù)制質(zhì)粒通常在枯草芽孢桿菌中不很穩(wěn)定，這限制了外源基因的高效表達(dá)。同時(shí)也存在著在生產(chǎn)過程中需要使用抗生素的問題。目前還沒有發(fā)現(xiàn)利用整合型枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)海藻糖合成酶，進(jìn)而利用獲得的海藻糖合成酶制造海藻糖的研究報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產(chǎn)海藻糖合成酶并利用獲得的海藻糖合成酶制造海藻糖的方法。利用整合質(zhì)粒將海藻糖合成酶表達(dá)元件整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組中，構(gòu)建整合型重組枯草芽孢桿菌，利用該菌在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到海藻糖合成酶。經(jīng)過簡(jiǎn)單分離，發(fā)酵液中的海藻糖合成酶能夠直接用于海藻糖的制造.
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:1.一種能夠以整合型的方式表達(dá)海藻糖合成酶的重組枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于，其獲得方法為:將海藻糖合成酶表達(dá)元件克隆到枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒上，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主枯草芽孢桿菌，挑選外源基因通過雙交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組枯草芽孢桿菌；所述的海藻糖合成酶表達(dá)元件包含如下組分:能夠在枯草芽孢桿菌中高效啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，能在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)蛋白的信號(hào)肽DNA片斷和海藻糖合成酶基因；所述的能夠在枯草芽孢桿菌中高效啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子為來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動(dòng)子P43,或來源于地衣芽孢桿菌(BaclicusIincheniformis)麥芽糖淀粉酶基因amyM的啟動(dòng)子；所述的能在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)蛋白的信號(hào)肽DNA片斷為來源于高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信號(hào)肽DNA片斷，或來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因信號(hào)肽DNA片斷；所述的海藻糖合成酶基因?yàn)閬碓从诠劝彼岚魲U菌(Corynebacteriumglutamicum)的海藻糖合成酶基因，來源于彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因，或來源于水棲嗜熱菌(Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶基因。所述的枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒為整合質(zhì)粒pMLK83及其衍生質(zhì)粒；所述的宿主枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌168衍生菌株，包括1A751，WB600,和WB800。2.一種利用以整合型的方式表達(dá)海藻糖合成酶的重組枯草芽孢桿菌菌株來生產(chǎn)海藻糖合成酶及制備海藻糖的方法，其特征在于，工藝步驟如下:I) 一級(jí)種的制備:從含新霉素20ug/ml的LB平板上接上述枯草芽孢桿菌基因工程菌株單菌落在4ml LB 液體培養(yǎng)基37°C、220rpm培養(yǎng)過夜，所得的菌種為一級(jí)種；2) 二級(jí)種的制備:一級(jí)種接種于800ml LB液體培養(yǎng)基，于37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600為0.6左右(約4 5小時(shí))；3)三級(jí)種的制備:將二級(jí)種接種到80L LB液體發(fā)酵罐中，37°C，以檸檬酸、NaOH控pH 7.0左右，通風(fēng)攪拌，溶氧控制在20 30%，培養(yǎng)至0D600為0.6左右(約5 6小時(shí))；4)生產(chǎn)罐發(fā)酵:將三級(jí)種接種到3T發(fā)酵罐中，LB液體培養(yǎng)基，36 38°C，通風(fēng)攪拌，溶氧控制在20 30%，以檸檬酸、NaOH控pH 6 8，培養(yǎng)約26小時(shí)，IOOOOg離心力離心除菌，用截留分子量5000 10000超濾膜濃縮上清液后，即得海藻糖合成酶濃縮原液；
5)以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，通過常規(guī)酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖的方法利用上述重組海藻糖合成酶溶液制造海藻糖。本發(fā)明首次將海藻糖合成酶表達(dá)元件整合到枯草芽孢桿菌染色體中，以該菌作為菌種，常規(guī)的生產(chǎn)工藝，發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶。生產(chǎn)的海藻糖合成酶經(jīng)過簡(jiǎn)單分離純化可直接用于制造海藻糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明利用食品安全的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)海藻糖合成酶，整合型表達(dá)的菌株所含的外源基因能夠穩(wěn)定傳代和表達(dá)，表達(dá)的海藻糖合成酶分泌到胞外，無抗菌活性，達(dá)到食品應(yīng)用酶制劑要求，有利于下一步海藻糖的制造。
具體實(shí)施例方式避免表達(dá)系統(tǒng)中質(zhì)粒不穩(wěn)定的最有效途徑是使用枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒，將外源基因整合到枯草芽孢桿菌染色體中，外源基因隨染色體的復(fù)制而復(fù)制和表達(dá)，這樣外源基因在宿主中可保持較好的穩(wěn)定性。本發(fā)明用到的整合質(zhì)粒PMLK83購自美國俄亥俄州立大學(xué)Bacillus遺傳保藏中心(BGSC, http://www.bgsc.0rg),該質(zhì)粒有兩段與枯草芽孢桿菌淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在這兩段同源臂中有新霉素抗性基因；另外該質(zhì)粒有大腸桿菌復(fù)制子而無枯草芽孢桿菌復(fù)制子，因此能在大腸桿菌中復(fù)制而不能在枯草芽孢桿菌中復(fù)制。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌時(shí)，通過新霉素抗性選擇，只有整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組菌才能生長，這樣就篩選出重組子。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。但需要說明的是，實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1本實(shí)例將包含來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動(dòng)子P43啟動(dòng)子，來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因信號(hào)肽DNA片斷和來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合成酶基因單順反子的海藻糖合成酶表達(dá)元件克隆到整合質(zhì)粒PMLK83。1.構(gòu)建重組質(zhì)粒pMLK83-P43根據(jù)Genbank中注釋的啟動(dòng)子P43序列，設(shè)計(jì)上游引物為5’attgctggacgcttatggac 3’和下游弓I物為 S’cgggatccattcctctcttacctataat 3’。PCR 反應(yīng)體系 IOOul:DNA模板(枯草芽孢桿菌 1A751 總 DNA)lulG4 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚合酶 lul，添加 ddH20 至 100ul。PCR 反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin,30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。PCR片段和質(zhì)粒pMLK83用限制性內(nèi)切酶BamH 1、HindIII分別進(jìn)行雙酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，經(jīng)篩選鑒定獲得重組質(zhì)粒 PMLK83-P43。2.構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMLK83-P43_cgTreS人工合成如下DNA片斷:I GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGTG CTGCAAACCT101 CCTGGCATTT CTCTATCCTG GCAGGCATGA CTGATACCTC TCCGTTTGAA
151 TTCTCAGCCG AGTGCAGATC ACCACCCTGA TCACGCGGCT CGCCCAGTTC201 TTGATGCCCA CGGCTTGATC GTTGAGCACG AATCGGAAGA GTTTCCAGTC251 CCCGCACCCG CTCCCGGTGA ACAGCCCTGG GAGAAGAAAA ACCGCGAGTG301 GTACAAAGAC GCCGTTTTCT ACGAAGTGCT GGTTCGTGCC TTCTACGATC351 CAGAAGGCAA CGGAGTCGGA TCGTTGAAAG GCCTGACCGA AAAACTGGAT401 TACATCCAGT GGCTCGGCGT GGATTGCATT TAGATCCCAC CGTTTTATGA451 TTCCCCACTG CGCGACGGCG GTTACGATAT CCGCAACTTC CGTGAAATCC501 TGCCCGAATT CGGCACCGTC GATGACTTCG TGGAACTCGT TGACCACGCC551 CACCGCCGTG GCCTGCGTGT TATCACCGAC TTGGTCATGA ATCACACCTC601 CGACCAGCAC GCATGGTTCC AAGAATCCCG GCGCGACCCA ACCGGCCCCT651 ACGGAGATTT CTATGTGTGG AGCGATGATC CCACCCTGTA CAACGAAGCC701 CGCATCATCT TTGTAGATAC AGAAGAATCC AACTGGACCT ATGATCCGGT751 GCGTGGCCAG TACTTCTGGC ACCGCTTCTT CTCCCACCAA CCAGACCTCA801 ACTACGACAA CCCCGCAGTC CAAGAGGCCA TGCTAGATGT CTTGCGTTTC851 TGGCTGGACC TGGGACTTGA TGGTTTCCGA CTAGATGCCG TTCCTTATCT901 TTTTGAACGC GAAGGCACCA ACGGCGAAAA CCTCAAAGAA ACCCACGATT951 TCCTCAAACT GTGTCGCTCT GTCATTGAGA AGGAATACCC CGGCCGAATC1001 CTGCTCGCAG AAGCCAACCA ATGGCCCCAA GATGTGGTCG AATACTTCGG1051 TGAAAAAGAC AAAGGCGATG AATGCCACAT GGCCTTCCAC TTCCCTTTGA1101 TGCCGCGCAT CTTCATGGGA GTTCGCCAAG GTTCACGCAC CCCGATCAGT1151 GAGATCCTGG CCAACACCCC GGAGATTCCC AAGACTGCCC AATGGGGTAT1201 TTTCCTGCGT AATCATGATG AGCTCACCCT TGAAATGGTC TCCGATGAGG1251 AACGCAGCTA CATGTACTCC CAATTCGCCT CCGAACCTCG CATGCGCGCC1301 AACGTAGGAA TCCGCAGGCG CCTTTCCCCA CTGCTTGAAG GCGACCGCAA1351 CCAGCTGGAA CTCCTTCACG GTTTGTTGCT GTCTCTACCT GGCTCACCCG1401 TGTTGTATTA CGGTGATGAA ATTGGCATGG GCGACAATAT CTGGCTCCAC1451 GACCGCGACG GAGTGCGCAC CCCCATGCAG TGGTCCAACG ACCGCAACGG1501 TGGTTTCTCC AAAGCTGATC CTGAACGCCT GTACCTTCCA GCGATCCAAA1551 ATGATCAATA CGGCTACGCC CAAGTAAACG TGGAAAGCCA ACTCAACCGC1601 GAAAACTCCC TGCTGCGCTG GCTCCGAAAC CAAATCCTTA TCCGCAAGCA1651 GTACCGCGCA TTTGGTGCCG GAACCTACCG TGAAGTGTCC TCCACCAATG1701 AGTCAGTGTT GACATTTTTA CGAGAACACA AGGGCCAAAC CATTTTGTGT1751 GTCAACAACA TGAGCAAATA TCCTCAGGCA GTCTCGCTTG ATTTGCGTGA1801 ATTTGCAGGA CACACCCCTC GAGAGATGTC GGGCGGGCAG CTGTTCCCTA1851 CCATTGCTGA ACGGGAGTGG ATTGTCACTT TAGCCCCTCA CGGATTCTTC1901 TGGTTTGATC TCACCGCCGA TGAAAAGGAC GATATGGAAT GACCGCGG
將合成的DNA片段和質(zhì)粒pMLK83_P43用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac II進(jìn)行雙酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選鑒定獲得重組質(zhì)粒 pMLK83-p43-cgTreS.
實(shí)施例2本實(shí)例將包含來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動(dòng)子P43啟動(dòng)子，來源于高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信號(hào)肽DNA片斷和來源于彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因單順反子的海藻糖合成酶表達(dá)元件克隆到整合質(zhì)粒PMLK83。人工合成如下DNA片斷:I GGATCCATGA TTGGAGCTTT TAAAAGGTTG GGTCAAAAAT TGTTTTTGAC51 ATTGTTAACG GCATCATTAA TTTTTGCATC TTCTATAGTA ACTGCTAATG101 CAGTGCAGAT GACCGGGGAC CCCATCCCCG ACACCTTCAC CCACGAAAAG151 CCGCGCGACC CCTACTGGTA CAAGCACGCG GTCTTCTACG AGGTGCTGGT201 GCGCGGGTTC AGCGACTCCA ACGACGACGG CACCGGAGAC CTGCGCGGCC251 TCATCAACCG GCTGGACTAT CTGCAGTGGC TGGGCATCGA CTGCATCTGG301 CTGCTGCCGA TCTACCAGTC GCCGCTGCGG GACGGCGGCT ACGACATCAG351 CGACTACACC AAGATCCTGC CGGAGTTCGG CGATCTGGGC GACTTCGTGG401 AGCTGG TCGA TGAGGCGCAC CGGCGGGGCA TCCGCGTCAT CGCCGACCTG451 GTGATGAACC ACACCAGCGA CCAGCACCCC TGGTTCCAGG CGTCCCGCAC501 GGACCCCGAC GGGCCGTACG GCGACTTCTA CATGTGGTCC GACACCGACG551 ACAAGTACCC GGACGCGCGG ATCATCTTCG TCGACACCGA GGTGTCCAAC601 TGGACCTACG ACCCGGTGCG CGGCCAGTAC TACTGGCACC GCTTCTTCTC651 CCACCAGCCG GACCTCAACT ACGACAACCC GGCGGTGCAG GAGGCGATGC701 TGGAGGTGCT GCGGTTCTGG CTGGACCTGG GCATCGACGG GTTCCGGTTG751 GACGCGGTGC CCTACCTGTA CGCCCGCGAG GGCACCAACT GCGAGAACCT801 GCCGGAGACC CACGCCTATC TGAAGCGGGT GCGCGCCGAA GTGGACCGGC851 TGTACCCGGA CCGGGTGCTG CTGGCCGAGG CCAACCAGTG GCCGGCCGAC901 GTGGTGGAGT ACTTCGGCGA CCCGGCCACC GGCGGGGACG AGTGCCACAT951 GGCCTTCCAC TTCCCGGTGA TGCCACGGAT CTTCATGGCG GTGCGGCGCG1001 AGCAGCGCTA CCCCATCTCC GAGATCATGG CGCAGACCCC CAAGATCCCC1051 GAGAACTGCC AGTGGGGCAT CTTCCTGCGC AACCACGATG AGCTGACGCT1101 GGAGATGGTC ACCGACGAAG AGCGGGACTA CATGTACGCC GAGTACGCCA1151 AGGACCCACG GATGAAGGCC AACATCGGCA TCCGGCGCCG GCTGGCCCCG1201 CTGCTGGACA ACGACCGCAA CCAGCTGGAG CTGTTCACCG CGCTGCTGCT1251 GTCGCTGCCG GGATCGCCGG TGCTGTACTA CGGCGACGAG ATCGGCATGG1301 GCGACAACAT CTGGCTGGGC GACCGCGACA GCGTGCGCAC CCCGATGCAG1351 TGGACGCCCG ACCGCAACGC CGGCTTCTCC CGCTGCGACC CGGCCCGGCT1401 CTACCTGCCG GTGATCATGG ACCCGATCTA CGGGTACCAG GCGGTCAACG1451 TGGAGGCCCA GCAGCGCAAC CCCGGCTCGC TGCTGAACTG GACCCGCAAG1501 ATGATCGAGA TCCGCAAGCG GCACCCGGTG TTCGGGCTGG GCTCGTATGT1551 GGAGCTGCCG GCCTCCAACC CCAGCGTGCT GGCCTTCGTG CGCGAGTACG1601 GCGACGACCG GGTGCTGTGC GTCAACAACC TCTCGCGCTT CCCGCAGCCG
1651 GTGGAGCTGG ACCTGCGCCG CTTCGAAGGC TGCACCCCGG TGGAGTGCAT1701 GGGCGGGGTG CAGTTCCCGG CGATCGGCGA GCTGCCCTAC CTGCTCACCC1751 TGCCCGGTCA CGGCTTCTAC TGGTTCGTGC TGCCGCCGCC GCCCGGCGGC1801 TGGCCCGACG GCTCCGGCGC CGCCGAGCAG TCACTGCGGG AACAGTCCGA1851 CCGGGGTGCG GACTTCCCCG CAGATCCCTC GCAGGAGACC CGGCAGACGG1901 CGAAGTAACC GCGG將合成的DNA片段和質(zhì)粒pMLK83_P43用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac II進(jìn)行雙酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選鑒定獲得重組質(zhì)粒 pMLK83-p43-tcTreS.
實(shí)施例3本實(shí)例將包含來源于來源于地衣芽孢桿菌(Baclicus Iincheniformis)麥芽糖淀粉酶基因amyM的啟動(dòng)子,來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的α_乙酰乳酸脫羧酶基因信號(hào)肽DNA片斷和來源于水棲嗜熱菌(Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶基因單順反子的海藻糖合成酶表達(dá)元件克隆到整合質(zhì)粒PMLK83。1.構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMLK83_amyM根據(jù)Genbank中注釋的啟動(dòng)子amyM序列，設(shè)計(jì)上游引物為5’ cccaagcttctgtacacttgcgtcctcca 3’ 和下游弓I物為 5’ cgggatcctctcctcccctttcaatgtg3’。PCR 反應(yīng)體系 IOOul:DNA 模板(Bacillus licheniformis ATCC 14580 總 DNA) Iul (約20ng), 5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul, lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，
2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。PCR 片段和質(zhì)粒 pMLK83用限制性內(nèi)切酶BamH 1.Hind III分別進(jìn)行雙酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，經(jīng)篩選鑒定獲得重組質(zhì)粒pMLK83-amyM。2.構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMLK83-amyM_taTreS人工合成如下DNA片斷:I GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGTG GACCCCCTCT101 GGTACAAGGA CGCGGTGATC TACCAGCTCC ACGTCCGCTC CTTCTTTGAC151 GCCAACAACG ACGGCTACGG GGACTTTGAG GGCCTGAGGC GGAAGCTTCC201 CTACCTGGAG GAGCTCGGGG TCAACACCCT CTGGCTCATG CCCTTCTTCC251 AGTCCCCCTT GAGGGACGAC GGGTACGATA TCTCCGACTA CTACCAGATC301 CTCCCCGTCC ACGGGACCCT GGAGGACTTC ACCGTGGACG AGGCCCACGG351 CCGGGGGATG AAGGTGATCA TTGAGCTCGT CCTGAACCAC ACCTCCATTG401 ACCACCCTTG GTTCCAGGAG GCGAGGAAGC CGAATAGCCC CATGCGGGAC451 TGGTACGTGT GGAGCGACAC CCCGGAGAAG TACAAGGGGG TCCGGGTCAT501 CTTCAAGGAC TTTGAAACCT CCAACTGGAC CTTTGACCCC GTGGCCAAGG551 CCTACTACTG GCACCGCTTC TACTGGCACC AGCCCGACCT CAACTGGGAC601 AGCCCCGAGG TGGAGAAGGC CATCCACCAG GTCATGTTCT TCTGGGCCGA 651 CCTGGGGGTG GACGGCTTCC GCCTGGACGC CATCCCCTAC CTCTACGAGC
權(quán)利要求
1.一種能夠以整合型的方式表達(dá)海藻糖合成酶的重組枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于，其獲得方法為: 將海藻糖合成酶表達(dá)元件克隆到枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒上，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主枯草芽孢桿菌，挑選外源基因通過雙交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組枯草芽孢桿菌； 所述的海藻糖合成酶表達(dá)元件包含如下組分:能夠在枯草芽孢桿菌中高效啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，能在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)蛋白的信號(hào)肽DNA片斷和海藻糖合成酶基因； 所述的能夠在枯草芽孢桿菌中高效啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子為來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動(dòng)子P43,或來源于地衣芽孢桿菌(BaclicusIincheniformis)麥芽糖淀粉酶基因amyM的啟動(dòng)子； 所述的能在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)蛋白的信號(hào)肽DNA片斷為來源于高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信號(hào)肽DNA片斷，或來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的乙酰乳酸脫羧酶基因信號(hào)肽DNA片斷； 所述的海藻糖合成酶基因?yàn)閬碓从诠劝彼岚魲U菌(Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合成酶基因，來源于彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因，或來源于水棲嗜熱 菌(Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶基因， 所述的枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒為整合質(zhì)粒PMLK83及其衍生質(zhì)粒； 所述的宿主枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌168衍生菌株，包括1A751，WB600,和WB800。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的的重組枯草芽孢桿菌菌株來生產(chǎn)海藻糖合成酶及制備海藻糖的方法，其特征在于，工藝步驟如下: O 一級(jí)種的制備:從含新霉素20ug/ml的LB平板上接上述枯草芽孢桿菌基因工程菌株單菌落在4ml LB液體培養(yǎng)基37°C、220rpm培養(yǎng)過夜，所得的菌種為一級(jí)種； 2)二級(jí)種的制備:一級(jí)種接種于800ml LB液體培養(yǎng)基，于37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600為0.6左右(約4 5小時(shí))； 3)三級(jí)種的制備:將二級(jí)種接種到80LLB液體發(fā)酵罐中，37°C，以檸檬酸、NaOH控PH7.0左右，通風(fēng)攪拌，溶氧控制在20 30%，培養(yǎng)至0D600為0.6左右(約5 6小時(shí))； 4)生產(chǎn)罐發(fā)酵:將三級(jí)種接種到3T發(fā)酵罐中，LB液體培養(yǎng)基，36 38°C，通風(fēng)攪拌，溶氧控制在20 30%，以檸檬酸、NaOH控pH 6 8，培養(yǎng)約26小時(shí)，IOOOOg離心力離心除菌，用截留分子量5000 10000超濾膜濃縮上清液后，即得海藻糖合成酶濃縮原液； 5)以麥芽糖漿或淀粉漿為原料，通過常規(guī)酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖的方法利用上述重組海藻糖合成酶溶液制造海藻糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產(chǎn)海藻糖合成酶并將此酶用于生產(chǎn)海藻糖的方法。具體是將海藻糖合成酶表達(dá)元件整合到枯草芽孢桿菌染色體中構(gòu)建整合型重組枯草芽孢桿菌，以此重組枯草芽孢桿菌為菌種，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶。經(jīng)過簡(jiǎn)單分離，發(fā)酵液中的海藻糖合成酶能夠直接用于海藻糖的制造。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明利用食品安全的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)海藻糖合成酶，整合型表達(dá)的菌株所含的外源基因能夠穩(wěn)定傳代和表達(dá)，表達(dá)的海藻糖合成酶分泌到胞外，無抗菌活性，達(dá)到食品應(yīng)用酶制劑要求，有利于下一步海藻糖的制造。
文檔編號(hào)C12R1/145GK103215300SQ20131017469
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者黃日波, 李曉明, 羅兆飛, 韋航, 韋宇拓, 蒙健宗, 廖東慶, 韋玉琴, 李叢, 盧運(yùn)琨 申請(qǐng)人:南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司