黑曲霉種子液的制備方法以及發(fā)酵制備檸檬酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黑曲霉種子液的制備方法，該方法包括將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，其中，該方法還包括將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)之前，將黑曲霉孢子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，所述預(yù)培養(yǎng)的條件包括：pH值為6.2-7.2。另外，本發(fā)明還公開了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法。采用本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，能夠縮短黑曲霉在種子罐中的培養(yǎng)時間，從而提高了設(shè)備的利用率，降低了能耗，同時提高了種子液的質(zhì)量，使發(fā)酵水平有了較大提高，具有可觀的經(jīng)濟和社會效益。
【專利說明】黑曲霉種子液的制備方法以及發(fā)酵制備檸檬酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑曲霉種子液的制備方法以及發(fā)酵制備檸檬酸的方法，具體地， 涉及一種用于檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的黑曲霉種子液的制備方法和利用該黑曲霉種子液發(fā)酵制 備檸檬酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸安全無毒，是目前世界上產(chǎn)量最大的發(fā)酵有機酸。大量應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、 環(huán)保、食品等領(lǐng)域，如作為酸味劑、調(diào)味劑及防腐劑、保鮮劑、緩沖劑、螯合劑。在化工行業(yè)、 化妝品行業(yè)及洗滌行業(yè)中可作抗氧化劑、增塑劑、洗滌劑。在醫(yī)藥行業(yè)中可作抗凝劑。在進(jìn) 行發(fā)酵以制備檸檬酸之前，通常需要對用于生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉進(jìn)行培養(yǎng)，以擴大黑曲霉 的量并使其生長狀態(tài)處于適于進(jìn)行發(fā)酵的狀態(tài)。
[0003] 目前在檸檬酸發(fā)酵之前對黑曲霉進(jìn)行培養(yǎng)的方法通常為將黑曲霉麩曲接種到種 子罐的種子培養(yǎng)基中，在pH為5-6,糖濃度在8-12重量％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)20-30小時得 到黑曲霉種子液，再將該黑曲霉種子液接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。
[0004] 現(xiàn)有工藝的缺點在于：種子罐培養(yǎng)通常在pH值為5-6的條件下進(jìn)行是為了不影響 種子培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的利用，但是，在上述條件下黑曲霉孢子吸水膨脹、萌發(fā)的時間 較長，因此，種子罐的利用率較低。同時，在PH值為5-6的條件，黑曲霉孢子不能在最佳的 條件下萌發(fā)會導(dǎo)致其萌發(fā)不充分，從而會影響最終得到的黑曲霉種子液的質(zhì)量，進(jìn)而會影 響后續(xù)的檸檬酸發(fā)酵水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于為了解決上述問題，提供一種能夠縮短黑曲霉孢子在種子罐中 (縮短黑曲霉的擴大培養(yǎng)的時間）的培養(yǎng)時間，從而能夠提高設(shè)備的利用率，降低能耗，同時 提高黑曲霉種子液的質(zhì)量，使發(fā)酵水平有較大提高的黑曲霉種子液的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，黑曲霉的孢子吸水膨脹和萌發(fā)的最佳pH值為6. 2-7. 2,但 是，如果在現(xiàn)有條件下將種子培養(yǎng)液的pH調(diào)整到6. 2-7. 2時存在幾個不利因素：（1)高pH 將影響培養(yǎng)液中蛋白的性質(zhì)；（2)高pH條件下高溫滅菌會導(dǎo)致糖液中各組分發(fā)生變化，產(chǎn) 生不可利用的糖；（3)調(diào)高pH導(dǎo)致培養(yǎng)基中其它離子濃度上升，不利于黑曲霉孢子生長。如 果在種子罐中進(jìn)行擴大培養(yǎng)之前，在PH值為6. 2-7. 2的條件下，先對黑曲霉孢子進(jìn)行預(yù)培 養(yǎng)，就能夠使黑曲霉孢子更快地吸水膨脹和萌發(fā)，然后再將所述膨脹和萌發(fā)的黑曲霉孢子 接種至種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，便可大大縮短黑曲霉孢子在種子罐中的時間。由于黑曲霉 孢子在種子罐中的時間得到了縮短，同時又由于黑曲霉孢子在預(yù)培養(yǎng)階段吸水膨脹和萌發(fā) 的時間也縮短，因此，整個種子液制備的總時間得到了有效的雙重縮短，進(jìn)而大大提高了種 子罐的利用率，并降低了能耗。另外，由于在預(yù)培養(yǎng)階段，黑曲霉孢子在其適宜的條件下進(jìn) 行吸水膨脹和萌發(fā)，因此，其萌發(fā)的較為充分，從而可以提高后續(xù)制備的種子液的質(zhì)量，進(jìn) 而可以提高發(fā)酵水平。
[0007] 基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種黑曲霉種子液的制備方法，該方法包括將黑曲 霉接種到種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，其中，該方法還包括將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)基液中進(jìn) 行培養(yǎng)之前，將黑曲霉孢子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，所述預(yù)培養(yǎng)的條件包括：PH值為6. 2-7. 2。
[0008] 優(yōu)選地，在所述預(yù)培養(yǎng)之前，將黑曲霉孢子在無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮液。 并且，當(dāng)黑曲霉孢子以黑曲霉麩曲的形式存在時，更優(yōu)選地，在將黑曲霉分散于無菌水中之 前，用無菌水對黑曲霉麩曲進(jìn)行洗滌、過濾以除去黑曲霉麩曲，得到黑曲霉孢子。
[0009] 另外，本發(fā)明還提供一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括在能夠生成檸檬酸 的條件下，將通過本發(fā)明所述的黑曲霉種子液的制備方法得到的黑曲霉種子液接種至發(fā)酵 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液。
[0010] 采用本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，能夠縮短黑曲霉孢子在種子罐中的培養(yǎng) 時間，從而提高了種子罐的利用率，降低了能耗，同時提高了種子液的質(zhì)量，使發(fā)酵水平有 所提高。優(yōu)選情況下，在所述預(yù)培養(yǎng)之前，將黑曲霉孢子在無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮 液，便于黑曲霉孢子的儲存并且能夠延長其儲存時間；同時，在發(fā)酵制備檸檬酸時，能夠?qū)?黑曲霉的接種量進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)，從而能夠有效的控制發(fā)酵水平。因此，采用本發(fā)明的黑曲霉 種子液的制備方法，具有可觀的經(jīng)濟和社會效益。

【具體實施方式】
[0011] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，該方法包括將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)液 中進(jìn)行培養(yǎng)，其中，該方法還包括將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)之前，將黑曲霉孢 子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，所述預(yù)培養(yǎng)的條件包括：pH值為6. 2-7. 2。
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將預(yù)培養(yǎng)的pH值調(diào)節(jié)至6. 5-7. 2時，能夠進(jìn)一步實現(xiàn)本 發(fā)明的目的。因此，優(yōu)選地，所述預(yù)培養(yǎng)的條件包括：PH值為6. 5-7. 2。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，所述調(diào)節(jié)pH值的方法可以是本領(lǐng)域常 用的方法，例如用堿性試劑調(diào)節(jié)；所述堿性試劑可以是本領(lǐng)域常用的各種堿性試劑，只要不 影響黑曲霉的正常生理活動就可以，優(yōu)選地，所述堿性試劑選自氨水、氫氧化鈉和碳酸鈣中 的一種或多種。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，對于所述預(yù)培養(yǎng)的溫度沒有特別的限 制，只要是有利于黑曲霉孢子萌發(fā)和生長的溫度即可，例如，可以采用與種子罐的培養(yǎng)溫度 相同的溫度。優(yōu)選地，所述預(yù)培養(yǎng)的溫度為30-35°C ;另外，對于所述預(yù)培養(yǎng)的時間也沒有 特別的限制，但是為了使黑曲霉孢子充分膨脹和萌發(fā)并且節(jié)省預(yù)培養(yǎng)的時間，優(yōu)選地，預(yù)培 養(yǎng)的時間為4-8小時。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，對黑曲霉孢子預(yù)培養(yǎng)的狀態(tài)沒有特別的 限制，例如，可以為動態(tài)培養(yǎng)，也可以為靜置培養(yǎng)。但是為了讓黑曲霉孢子更好的萌發(fā)和生 長，所述預(yù)培養(yǎng)的條件還包括在10-50rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，也即動態(tài)培養(yǎng)；或者，還可 以向孢子培養(yǎng)液中通入無菌空氣，所通入的無菌空氣的量沒有特別的限制，優(yōu)選地，通氣量 為0. 01-0. 05體積：（體積?分鐘);或者，也可以采用搖床培養(yǎng)和通入無菌空氣相結(jié)合的方 法。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，為了使黑曲霉孢子更好地萌發(fā)和恢復(fù)生 命代謝，進(jìn)一步縮短整個種子液的制備時間并提高種子液的質(zhì)量，優(yōu)選地，所述預(yù)培養(yǎng)在營 養(yǎng)物存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，例如可以在一定糖濃度的糖液中進(jìn)行培養(yǎng)，為了使黑曲霉在 低滲透壓的條件下更好地膨脹和萌發(fā)，優(yōu)選地，所述糖濃度為2-5g/100mL ;同時，為了節(jié)省 操作步驟，可以直接將糖液滴加入黑曲霉孢子中。其中，所述糖濃度為以葡萄糖計的單糖的 含量。
[0018] 其中，對為預(yù)培養(yǎng)階段提供糖類等營養(yǎng)物的物質(zhì)沒有特別的限制，只要能夠促進(jìn) 黑曲霉孢子的生長和生命代謝的恢復(fù)既可。綜合考慮萌發(fā)后的黑曲霉孢子在種子培養(yǎng)液中 的適應(yīng)性，優(yōu)選地，為預(yù)培養(yǎng)階段提供糖類等營養(yǎng)物的物質(zhì)和黑曲霉種子培養(yǎng)液相同。
[0019] 現(xiàn)有技術(shù)中為了使黑曲霉孢子保持存活狀態(tài)以及便于保存，通常將黑曲霉孢子置 于麩曲（如麩皮）中制得黑曲霉麩曲。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然可以直接將黑曲霉麩曲進(jìn) 行預(yù)培養(yǎng)之后再接種到種子培養(yǎng)液中，但是黑曲霉麩曲的保存時間較短，所占空間較大而 不便于保存，并且將黑曲霉進(jìn)行擴大培養(yǎng)時直接在種子罐中接種黑曲霉麩曲，而無法對黑 曲霉的接種量進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)，進(jìn)而會影響后續(xù)檸檬酸發(fā)酵中在發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量。因 此，為了節(jié)省原先用于保存黑曲霉麩曲所用的容器所占用的空間，而且延長保存時間，以及 在黑曲霉的擴大培養(yǎng)以及檸檬酸發(fā)酵時便于對黑曲霉的接種量準(zhǔn)確計數(shù)。優(yōu)選地，該方法 還包括在預(yù)培養(yǎng)之前，將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子在無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮 液。制成孢子懸浮液進(jìn)行保存時，在4°c下最長可保存20天，而通常的黑曲霉麩曲僅能夠保 存10-15天。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子制成孢子 懸浮液的方法可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法，例如，可以直接將黑曲霉麩曲與 無菌水混合、攪拌，使黑曲霉懸孢子浮于無菌水中制得孢子懸浮液，而此時，游離出黑曲霉 孢子的麩曲由于密度較大會沉于容器的底部，因此，可以直接取容器上部的黑曲霉孢子懸 浮液進(jìn)行計數(shù)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，為了使黑曲霉孢子充分從麩曲中游離出 來，并且能夠得到均勻分散的孢子懸浮液，從而更有利于對黑曲霉孢子進(jìn)行準(zhǔn)確的計數(shù)。 優(yōu)選地，將黑曲霉在無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮液的方法還包括：將黑曲霉分散到無 菌水中，在300-1000rpm條件下，攪拌30-60min ;然后在20000-40000頻率下，超聲處理 20-40min〇
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，為了排除黑曲霉麩曲中麩曲的干擾而得 到黑曲霉純孢子懸浮液，從而更有利于準(zhǔn)確計數(shù)，優(yōu)選地，將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子在 無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮液的方法還包括：在將黑曲霉分散于無菌水中之前，用無 菌水對黑曲霉麩曲進(jìn)行洗滌、過濾以除去麩曲，得到黑曲霉孢子。其中，所述洗滌和過濾的 方法可以是本領(lǐng)域常用的各種洗滌和過濾方法，例如所述洗滌的方法可以為在盛有黑曲霉 麩曲的容器中加入無菌水，并進(jìn)行攪拌洗滌；所述過濾的方法可以利用四層醫(yī)用紗布過濾， 優(yōu)選0· Imm的錦綸絲網(wǎng)過濾。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，對于所述孢子懸浮液中的黑曲霉的孢子 的含量沒有特別的限制，但是為了使黑曲霉孢子更好地分散并為了后續(xù)擴大培養(yǎng)時接種量 的需要，優(yōu)選地，所述孢子懸浮液中黑曲霉孢子的含量為4. OX 108-7. OX IO8個孢子/ml。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，對于所述種子培養(yǎng)液沒有特別的限制， 可以是本領(lǐng)域常規(guī)的種子培養(yǎng)液，例如可以將制備發(fā)酵培養(yǎng)基過程中的酶解得到的產(chǎn)物， 加水稀釋至總糖濃度為8-12重量％，得到種子培養(yǎng)液。其中，所述糖濃度為以葡萄糖計的單 糖的含量。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉種子液的制備方法，對于將黑曲霉接種到種子液中進(jìn)行 培養(yǎng)的條件沒有特別的限定，可以是本領(lǐng)域常用的條件，例如，可以包括：培養(yǎng)的溫度為 33-40°C，起始pH值為5-6,通氣量為0. 1-0. 6體積：（體積?分鐘)。對于將黑曲霉接種到 種子液中進(jìn)行培養(yǎng)的時間沒有特別的限制，但是由于在接種到種子液中之前已經(jīng)對黑曲霉 孢子進(jìn)行了預(yù)培養(yǎng)，即使培養(yǎng)時間少于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)時間，黑曲霉也能夠得到良好的生 長，因此，為了節(jié)省種子罐運行所需成本的同時使已膨脹和萌發(fā)的黑曲霉充分的生長，優(yōu)選 的，在種子液中培養(yǎng)10-15小時。需要理解的是，在保證黑曲霉孢子在預(yù)培養(yǎng)階段充分膨 脹和萌發(fā)的情況下，其在種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)的時間可以根據(jù)黑曲霉生長的實際狀況進(jìn)行調(diào) 整。例如，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的時間較長，例如8小時時，可以適當(dāng)?shù)目s短黑曲霉在種子罐中的培養(yǎng) 時間，例如可以為10小時；當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的時間較短，例如4小時時，則相反。
[0026] 由以上可以看出，采用本發(fā)明的方法進(jìn)行種子液的制備，預(yù)培養(yǎng)的時間與黑曲霉 在種子罐中的培養(yǎng)時間的總和不會超過20小時，而采用現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行種子液的制 備，其培養(yǎng)時間為25-30小時。因此，采用本發(fā)明的方法有效的縮短了黑曲霉種子液制備的 時間，從而提供了種子罐的利用率。
[0027] 另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在能夠生成 檸檬酸的條件下，將通過上述制備方法得到的黑曲霉種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā) 酵，得到發(fā)酵液。
[0028] 由于本發(fā)明提供的制備檸檬酸的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)主要在于使用本發(fā) 明的方法制備的黑曲霉種子液進(jìn)行發(fā)酵，因此對于發(fā)酵制備檸檬酸的方法的其他條件和操 作沒有特別的要求，例如，發(fā)酵條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件，例如，發(fā)酵的條件可以 包括：溫度為30-40°C，優(yōu)選為35-37°C;起始pH值為4-5 ;通氣量為0. 1-1體積：（體積?分 鐘)，優(yōu)選為〇. 3-0. 8體積：（體積?分鐘）；時間為50-75小時，優(yōu)選為55-65小時。
[0029] 發(fā)酵過程就其本質(zhì)來說是由微生物參與的生物化學(xué)反應(yīng)過程，因此微生物細(xì)胞的 數(shù)量、狀態(tài)、代謝情況對產(chǎn)物的生物合成有著重要的影響。菌體濃度的大小對發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn) 率有著重要的影響。理論上菌體濃度越大，產(chǎn)物的產(chǎn)量也越大，但是菌體濃度過高會產(chǎn)生 其他影響，如營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，如有毒物質(zhì)的積累 等，這些可能改變菌體的代謝途徑。因此，本發(fā)明中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黑曲霉的接 種量優(yōu)選為I. 8 X 107-3. 5 X IO7個孢子，進(jìn)一步優(yōu)選為2. 2 X 107-2. 6 X IO7個孢子。
[0030] 孢子的數(shù)量可以通過本領(lǐng)域公知的方法測定，例如，黑曲霉麩曲中、黑曲霉孢子懸 浮液中、黑曲霉種子液中的孢子數(shù)均可以按照血球平板計數(shù)法測得。具體地，該方法為：稱 取Ig黑曲霉麩曲5組，每組中加入含土蒽4體積％的無菌生理鹽水，經(jīng)過磁力攪拌器和超 聲波使孢子成為游離狀態(tài)，分別在顯微鏡下進(jìn)行孢子計數(shù)，取5組得到的數(shù)據(jù)的平均值。孢 子懸浮液中的孢子數(shù)可以通過如下方法進(jìn)行計數(shù)：血球計數(shù)板計數(shù)法。
[0031] 本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指微生物發(fā)酵所需的供微 生物生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微 量元素)以及維生素和水等。發(fā)酵液也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指接入微生物菌株的 液體培養(yǎng)基(該液體培養(yǎng)基也即本發(fā)明中所稱發(fā)酵培養(yǎng)基)，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后所得產(chǎn) 物。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分沒有特別的要求，只 要可以用于檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基即可。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基含有由淀粉質(zhì)原料酶解得 到的酶解產(chǎn)物，且優(yōu)選由淀粉質(zhì)原料酶解得到的酶解產(chǎn)物的量占發(fā)酵培養(yǎng)基總量的80-100 重量％。一般地，淀粉質(zhì)原料酶解得到的產(chǎn)物稱為液化液，液化液經(jīng)固液分離得到酶解殘渣 和液化清液，通?？梢詫⒁夯逡河糜谥苽浒l(fā)酵培養(yǎng)基，也可以將液化清液與液化液混合 后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基。因此，本發(fā)明中，所述由淀粉質(zhì)原料酶解得到的酶解產(chǎn)物包括上述 經(jīng)固液分離得到的液化清液，也包括未經(jīng)固液分離的液化液，還包括上述二者的混合物。發(fā) 酵培養(yǎng)基優(yōu)選由液化液和液化清液與水混合或不與水混合得到，且進(jìn)一步優(yōu)選以發(fā)酵培養(yǎng) 基的總重量為100重量份為基準(zhǔn)，液化清液的用量為80-85重量份，液化液的用量為15-20 重量份。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，液化清液可以通過多種方法制備得到，例 如，可以通過如下方法制備得到：將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行酶解，酶解得到 的產(chǎn)物再經(jīng)固液分離，得到液化清液和酶解殘渣，固液分離的條件使酶解殘渣的固含量為 45-55重量％，優(yōu)選為49-51重量％。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以 用于酶解、發(fā)酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯）和小麥 中的一種或幾種，優(yōu)選情況下，所述淀粉質(zhì)原料為玉米。
[0035] 所述酶解步驟可以通過本領(lǐng)域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生 物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生 物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。
[0036] 由于微生物生長會產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出 于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的粉碎產(chǎn)物的干重計，淀粉酶的用量為15-50個酶活力單 位。
[0037] 本發(fā)明中，酶活力單位的定義為：在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1 毫克淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0038] 酶解的溫度可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為70_105°C，更優(yōu)選為90_95°C。酶解 的時間理論上越長越好，考慮到設(shè)備利用率，優(yōu)選酶解的時間為90-150分鐘，更優(yōu)選為 100-120分鐘。酶解的pH值可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為5. 0-7. 0,更優(yōu)選為5. 4-6. 2,進(jìn) 一步優(yōu)選為5. 8-6. 0。
[0039] 淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，淀粉酶一般包括α -淀粉酶、 β -淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，優(yōu)選使用α -淀粉酶和/或異淀粉酶。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，固液分離的方法與裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員 所公知，例如，壓濾機或離心機。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，將經(jīng)過種子培養(yǎng)得到的種子液加入到發(fā)酵 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，優(yōu)選，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量在2. 2 X 107-2. 6 X IO7 個孢子。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法沒有特別的限 制，只要得到的培養(yǎng)液能夠適用于黑曲霉菌種的生長即可。
[0044] 術(shù)語"通氣量"一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣 體積比來表示（V / V ·π?η)，例如通氣比為1:0. 1-1，簡稱通氣量為0. 1-1體積：（體積?分 鐘)。
[0045] 培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。
[0046] 按照本發(fā)明的方法制備得到的發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè) 產(chǎn)品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明，糖濃度的測定方法可以是本領(lǐng)域公知的各種方法，優(yōu)選為費林法，參 照國標(biāo)GBT50099-2008。以下實施例中，黑曲霉預(yù)培養(yǎng)過程中的糖濃度以及種子罐中的糖濃 度均指以費林法測定的還原糖濃度計的糖濃度。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵液終點酸度的測定方法可以是本領(lǐng)域公知的各種方法，優(yōu)選為 NaOH滴定法，參照國標(biāo)GBT8269-2006。
[0049] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0051] 此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
[0052] 實施例1
[0053] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉種子液和檸檬酸的制備方法。
[0054] (1)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0055] 將收獲的56千克玉米進(jìn)行粉碎，得到顆粒直徑平均為380微米的粉碎后產(chǎn)物，將 粉碎后的產(chǎn)物按27重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后的產(chǎn)物，加入50個酶活力單位的 淀粉酶(諾維信公司，α -淀粉酶，本發(fā)明實施例中均為此淀粉酶)，進(jìn)入噴射器，在95°C、pH 為5. 8的條件下酶解110分鐘，得到酶解液化液，將酶解得到的酶解液化液通過用液壓式板 框壓濾機進(jìn)行壓濾，分離出液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為50重量％，將 177. 1千克的上述液化清液、38. 9千克的酶解得到的產(chǎn)物滅菌后加入到300L的發(fā)酵罐中， 得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0056] (2)黑曲霉的培養(yǎng)
[0057] 預(yù)培養(yǎng)
[0058] 取360瓶成熟麩曲35L用無菌水沖洗并過濾，在800rpm條件下，攪拌45min ;然 后在30000頻率下，超聲處理30min，得到30L的分散均勻的孢子懸浮液，其中，孢子濃度為 6. OX IO8個孢子/ml懸浮液，取7. 5L的上述孢子懸浮液，向所述孢子懸浮液中滴加濃度為 35重量％的氫氧化鈉水溶液，使pH值為6. 8,再向所述孢子懸浮液中添加步驟（1)中制備 的酶解液化液，使得以孢子懸浮液的總體積為基準(zhǔn)，糖濃度為2重量％，在35°C的條件下，在 轉(zhuǎn)速為20rpm的搖床上，用軟管通入0. Ol體積：（體積?分鐘）無菌空氣，培養(yǎng)8小時。 [0059] 種子罐的培養(yǎng)
[0060] 將制備發(fā)酵培養(yǎng)基過程中的部分酶解得到的產(chǎn)物，加水稀釋至總糖為10重量％， 得到種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至 36°C，接入經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的孢子懸浮液，每升培養(yǎng)液中黑曲霉的接種量為3X108個孢子。在 36°C、起始pH值為5. 6、0. 6體積：（體積?分鐘）的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)10小 時，pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。
[0061] (3)檸檬酸發(fā)酵
[0062] 將經(jīng)過培養(yǎng)的黑曲霉菌種加入到上述得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵，以發(fā)酵培養(yǎng) 基的體積為基準(zhǔn)，所述黑曲霉的接種量為2. 5 X IO7個孢子/L，發(fā)酵條件包括溫度為36°C， 起始pH值為4. 5,通氣量為0. 8體積：（體積?分鐘)，發(fā)酵55小時后，還原糖為0g/100mL， 停止發(fā)酵，進(jìn)行固液分離，測定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率，具體結(jié)果見 表1。
[0063] 實施例2
[0064] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉種子液和檸檬酸的制備方法。
[0065] 通過與實施例1相同的方法進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，不同的是黑曲霉的培養(yǎng)過程如下：
[0066] 預(yù)培養(yǎng)
[0067] 取360瓶成熟麩曲35L用無菌水沖洗并過濾，在300rpm條件下，攪拌60min ;然 后在40000頻率下，超聲處理20min，得到30L的分散均勻的孢子懸浮液，其中，孢子濃度為 7. OX IO8個孢子/ml，取7. 5L的孢子懸浮液，向所述孢子懸浮液中滴加濃度為35重量％的 氫氧化鈉水溶液，使pH值為7. 2,再向所述孢子懸浮液中添加實施例1步驟（1)中制備的酶 解液化液，使得以孢子懸浮液的總體積為基準(zhǔn)，糖濃度為5重量％，在35°C的條件下，在轉(zhuǎn)速 為50rpm的搖床上，用軟管通入0. 03體積：（體積?分鐘）微量無菌空氣，培養(yǎng)4小時。
[0068] 種子罐的培養(yǎng)
[0069] 將制備發(fā)酵培養(yǎng)基過程中的部分酶解得到的產(chǎn)物，加水稀釋至總糖為10重量％， 得到種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至 36°C，接入經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的孢子懸浮液，每升培養(yǎng)液中黑曲霉的接種量為3X108個孢子。在 36°C、起始pH值為5. 6、0. 4體積：（體積?分鐘）的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)12小 時，pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。
[0070] 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵53小時后，還原糖濃度為0g/100mL，停止發(fā)酵，進(jìn)行固液分離，測 定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0071] 實施例3
[0072] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉種子液和檸檬酸的制備方法。
[0073] 通過與實施例1相同的方法進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，不同的是黑曲霉的培養(yǎng)過程如下：
[0074] 黑曲霉的培養(yǎng)
[0075] 預(yù)培養(yǎng)
[0076] 取360瓶成熟麩曲35L用無菌水沖洗并過濾，在IOOOrpm條件下，攪拌30min ;然 后在20000頻率下，超聲處理40min。得到30L的分散均勻的孢子懸浮液，其中，孢子濃度為 4. OX IO8個孢子/ml，取7. 5L的孢子懸浮液，向所述孢子懸浮液中滴加濃度為35重量％的 氫氧化鈉水溶液，使pH值為6. 5,再向所述孢子懸浮液中添加實施例1步驟（1)中制備的酶 解液化液，使得以孢子懸浮液的總體積為基準(zhǔn)，糖濃度為3. 5重量％，在35°C的條件下，在轉(zhuǎn) 速為IOrpm的搖床上，用軟管通入0. 05體積：（體積?分鐘）無菌空氣，培養(yǎng)6小時。
[0077] 種子罐的培養(yǎng)
[0078] 將制備發(fā)酵培養(yǎng)基過程中的部分酶解得到的產(chǎn)物，加水稀釋至總糖為10重量％， 得到種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘后快速降溫至 36°C，接入經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的孢子懸浮液，每升培養(yǎng)液中黑曲霉的接種量為3X10 8個孢子。在 36°C、起始pH值為5. 6、0. 2體積：（體積?分鐘）的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)13小 時，pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。
[0079] 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵50小時后，還原糖濃度為0g/100mL，停止發(fā)酵，進(jìn)行固液分離，測 定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0080] 實施例4
[0081] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉種子液和檸檬酸的制備方法。
[0082] 按照與實施例1相同的方法對黑曲霉種子液的制備以及發(fā)酵制備檸檬酸，不同的 是，在黑曲霉的預(yù)培養(yǎng)階段，調(diào)節(jié)孢子懸浮液的PH值為6. 2,預(yù)培養(yǎng)的時間為8h，種子罐培 養(yǎng)的時間為12小時，pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止 培養(yǎng)。進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵58小時后，還原糖濃度為0g/100mL，停止發(fā)酵，進(jìn)行固液分離，測定 檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0083] 實施例5
[0084] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉種子液和檸檬酸的制備方法。
[0085] 按照與實施例1相同的方法對黑曲霉種子液的制備以及發(fā)酵制備檸檬酸，不同的 是，黑曲霉成熟麩曲使用無菌水沖洗后不進(jìn)行過濾。預(yù)培養(yǎng)的時間為8h，種子罐培養(yǎng)的時 間為10. 5小時，pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。 進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵56小時后，還原糖濃度為0g/100mL，停止發(fā)酵，進(jìn)行固液分離，測定檸檬酸 溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0086] 實施例6
[0087] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉種子液和檸檬酸的制備方法。
[0088] 按照與實施例1相同的方法對黑曲霉種子液的制備以及發(fā)酵制備檸檬酸，不同的 是，在預(yù)培養(yǎng)階段，不向孢子懸浮液中添加酶解液化液，而是直接滴加氫氧化鈉后按照實施 例1的方法進(jìn)行黑曲霉孢子的預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的時間為8h，種子罐培養(yǎng)的時間為14小時， pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。進(jìn)行檸檬酸發(fā) 酵60小時后，還原糖濃度為0g/100mL，停止發(fā)酵，進(jìn)行固液分離，測定檸檬酸溶液的濃度， 計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0089] 對比例1
[0090] 按照與實施例1相同的方法對黑曲霉進(jìn)行擴大培養(yǎng)以及發(fā)酵制備檸檬酸，不同的 是，在黑曲霉的擴大培養(yǎng)時，直接將黑曲霉麩曲接種到含有種子培養(yǎng)液的種子罐中進(jìn)行培 養(yǎng)，不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)步驟，每升種子培養(yǎng)液中黑曲霉的接種量約為3 X IO8個孢子，培養(yǎng)30個 小時，pH為2. 3、酸度為0. 8g/100mL、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)，并將種子 液接種到發(fā)酵罐中繼續(xù)后續(xù)的發(fā)酵過程。
[0091] 按照實施例1的方法進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵63小時后，還原糖濃度為0g/100mL，停止發(fā) 酵，測定檸檬酸溶液的濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率，具體結(jié)果見表1。
[0092] 表 1
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 一種黑曲霉種子液的制備方法，該方法包括將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培 養(yǎng)，其特征在于，該方法還包括，將黑曲霉接種到種子培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)之前，將黑曲霉孢 子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，所述預(yù)培養(yǎng)的條件包括：pH值為6. 2-7. 2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，所述預(yù)培養(yǎng)的pH值為 6. 5-7· 2〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件還包 括，預(yù)培養(yǎng)的溫度為30-35°C，預(yù)培養(yǎng)的時間為4-8小時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件還包 括，在10-50rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件還包 括，將黑曲霉孢子在糖液中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，所述糖液中的糖含量為2-5g/100mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，該方法還包括，在預(yù)培養(yǎng)之 前，將黑曲霉孢子在無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，將黑曲霉孢子在無菌水中 進(jìn)行分散得到孢子懸浮液的方法包括：將黑曲霉孢子分散到無菌水中，在300-1000rpm條 件下，攪拌30-60min ;然后在20000-40000頻率下，超聲處理20-40min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，所述黑曲霉孢子以黑曲 霉麩曲的形式存在，將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子在無菌水中進(jìn)行分散得到孢子懸浮液的 方法還包括：在將黑曲霉孢子分散于無菌水中之前，用無菌水對黑曲霉麩曲進(jìn)行洗滌、過濾 以除去黑曲霉麩曲，得到黑曲霉孢子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，所述孢子懸浮液中黑曲 霉孢子的含量為4X 108-7X 108個孢子/ml。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉種子液的制備方法，其中，將黑曲霉接種到種子培養(yǎng) 液中進(jìn)行培養(yǎng)的條件包括：糖含量為8-12重量％，培養(yǎng)的溫度為33-40°C，起始pH值為5-6， 通氣量為〇. 1-0. 5體積：（體積?分鐘)，時間為10-15小時。
11. 一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括在能夠生成檸檬酸的條件下，將通過權(quán)利 要求1-10中任意一項所述的黑曲霉種子液的制備方法得到的黑曲霉種子液接種至發(fā)酵培 養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液。
【文檔編號】C12N1/14GK104277978SQ201310275581
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月1日
【發(fā)明者】李北, 周勇, 盧宗梅, 楊儒文 申請人:中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司