抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體ds6及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體DS6及其應(yīng)用。首次找到一種特異性抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白(hMYADM)的單克隆抗體。所述的單克隆抗體可良好地識(shí)別hMYADM抗原，不與其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性和靈敏度均非常高。CCTCC NO：C2013332013.04.03CCTCC NO：C2013322013.04.03
【專利說(shuō)明】抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體DS6及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志（hMYADM)蛋白的單克隆 抗體的制備及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 造血譜系的發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其特征在于基因表達(dá)的特征性改 變，導(dǎo)致的階段特異性的表型和功能變化。造血干細(xì)胞分化異?？赡軐?dǎo)致白血病和其他血 液系統(tǒng)疾病的發(fā)生。在過(guò)去的幾十年里，對(duì)于參與造血發(fā)生的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及其受體 和轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。造血發(fā)生的過(guò)程可能涉及到的幾個(gè)關(guān)鍵變 量，包括轉(zhuǎn)錄因子作用，染色質(zhì)可接近性、生長(zhǎng)因子受體，以及發(fā)生這些遺傳改變的細(xì)胞整 體環(huán)境。然而，對(duì)多能祖細(xì)胞系的選擇的分子機(jī)制仍不清楚。對(duì)參與造血干細(xì)胞譜系發(fā)生的 基因進(jìn)行研究將為造血分化機(jī)制提供新的觀點(diǎn)，并有助于闡明許多造血障礙的發(fā)生原因。 多能造血干細(xì)胞具有選擇性表達(dá)多個(gè)淋巴系或髓系細(xì)胞分化的譜系特異性程序的能力。目 前認(rèn)為，特定譜系造血細(xì)胞的發(fā)生涉及到一些種系特異性基因的改變。而一個(gè)或幾個(gè)調(diào)節(jié) 性或"關(guān)鍵"基因的活化即可完全啟動(dòng)并調(diào)控譜系特異性基因程序。因此研究造血發(fā)生中 的特征性分子改變對(duì)深入闡明造血細(xì)胞的分化發(fā)育、體內(nèi)遷移、生物學(xué)作用及其分子機(jī)理 具有重大意義，可為認(rèn)識(shí)疾病（如白血?。┌l(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供新的角度，也可能為疾病的 防治提供新的思路和手段。
[0003] 髓系相關(guān)分化標(biāo)記（MYADM)是近年來(lái)鑒定得到的一種表達(dá)在造血干細(xì)胞分化的 特定階段的標(biāo)志物蛋白，屬于MAL蛋白家族成員。在MYADM蛋白序列中特征性地存在8個(gè) 跨膜區(qū)，形成2個(gè)MARVEL串聯(lián)排列，其優(yōu)勢(shì)分布于細(xì)胞膜上。小鼠 MYADM (mMYADM)在原始 造血祖細(xì)胞向特定細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)表達(dá)上調(diào)，在向B細(xì)胞祖細(xì)胞分化的條件下表達(dá)下調(diào)。 反義寡核苷酸抑制其表達(dá)可導(dǎo)致小鼠骨髓粒細(xì)胞集落形成的大幅減少，提示mMYADM在髓 系細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理作用（Pettersson，M?等，J Leukoc Biol. 2000， 67:423-431 ;Dannaeus，K?等，Mol Biol R印? 2005, 32:149-157)。人源 MYADM(hMYADM)選 擇性表達(dá)在外周血來(lái)源的髓系細(xì)胞以及髓系白血病細(xì)胞，在PMA誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞分化 以及骨髓⑶34+細(xì)胞向粒、單核細(xì)胞分化中，hMYADM的表達(dá)明顯上調(diào)（Wang，Q.等，Life Sci. 2007, 80:420-429.)。在全反式維甲酸誘導(dǎo)前髓系白血病Nb4細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)顯著升 高（Cui，W.等，Mol Biol R印.2001,28:123-138)。在人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤臨床標(biāo)本中也檢測(cè) 到 MYADM 表達(dá)的改變（de Wit，NJ.等，Br J Cancer. 2005,92:2249-2261)。這些結(jié)果較充 分地揭該分子是與髓系分化發(fā)育密切相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志，有可能在白血病的發(fā)病機(jī)制 以及誘導(dǎo)分化中起著重要作用。
[0004] MYADM 分子可能有望獲得新的 CD 統(tǒng)一命名。CD (cluster of differentiation，白 細(xì)胞分化抗原）是白細(xì)胞在正常或刺激后分化和成熟過(guò)程中的某個(gè)階段出現(xiàn)或消失的細(xì) 胞表面標(biāo)志，不同的細(xì)胞類群分化的特異性表達(dá)標(biāo)志構(gòu)成不同的生物學(xué)功能和臨床意義， 許多CD分子都是有功能的分子，包括受體、酶、粘附分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、離子通道、調(diào)節(jié)分 子等，在造血細(xì)胞的分化、發(fā)育、激活、免疫應(yīng)答以及疾病的發(fā)生中發(fā)揮著極其重要的作用， CD分子還用于白血病的免疫學(xué)分型，而且可能作為新藥設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。如CD33已經(jīng)成為診 斷急性髓系白血?。ˋML)，尤其是未分化型AML的重要標(biāo)志，同時(shí)可用于區(qū)分AML與淋巴系 白血病?？耿?3單抗已應(yīng)用于治療AML的臨床I期研究，可選擇性去除惡性造血，回復(fù)正 常造血過(guò)程（Caligaris-Cappio, F?等，Lancet. 2001，358:49-55)。每一個(gè)新 CD 抗體的出 現(xiàn)，意味著新抗原相應(yīng)編碼基因及功能的闡明。隨著對(duì)細(xì)胞分化抗原分子研究的不斷深入， 可闡明一些造血細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程的理論問(wèn)題，并將對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理、診斷、預(yù)后及療效判 定等方面的研究起到極大的推動(dòng)作用。
[0005] 制備hMYADM的單克隆抗體，對(duì)進(jìn)一步深入研究其功能具有重要意義，可應(yīng)用于不 同細(xì)胞和組織中該分子的檢測(cè)，有可能揭示該新分子在臨床疾病防治中的可能應(yīng)用前景， 豐富造血細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程的基礎(chǔ)理論研究，并對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理、診斷、預(yù)后及療效判定等 方面的研究起到啟發(fā)作用。
[0006] 然而，本領(lǐng)域目前還缺乏特異性的、可良好識(shí)別hMYADM的單克隆抗體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽來(lái)源于人髓系相關(guān)分化標(biāo)志 蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于作為抗原，制備特異性檢測(cè)人 髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體。
[0010] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種單克隆抗體，其是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201333(DS6)的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體由所述的多肽免疫動(dòng)物獲得。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的單克隆抗體的用途，用于制備特異性檢測(cè)人髓 系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的檢測(cè)試劑盒。
[0013] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白包括：（1)定性檢測(cè)人髓 系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白；或（2)定量檢測(cè)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白；
[0014] 較佳地，所述的定性檢測(cè)包括：通過(guò)免疫印跡方法或免疫熒光的方法鑒定人髓系 相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的存在情況；
[0015] 較佳地，所述的定量檢測(cè)包括：通過(guò)流式細(xì)胞方法對(duì)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白表 達(dá)的強(qiáng)度或陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行定量，或通過(guò)雙抗體夾心ELISA法對(duì)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白 表達(dá)的強(qiáng)度進(jìn)行定量。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種雜交瘤細(xì)胞株，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的 保藏號(hào)是 CCTCC N0:C201333。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)試劑盒，其中包括所述的單克隆抗體或所述 的雜交瘤細(xì)胞株。
[0018] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：另一單克隆抗體，該另一單克隆抗體是 特異性抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體，其由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201332(FMA1) 的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：固相載體（如多孔板）；較佳地，權(quán)利要 求3所述的單克隆抗體包被于所述的固相載體；較佳的，所述的另一抗體還連接有標(biāo)記物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記物選自：辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧 化酶、3 -D-半乳糖苷酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、熒光素或葡萄糖淀粉酶。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：
[0022] 與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物；
[0023] 顯色劑；
[0024] 洗滌液；和/或
[0025] 終止液。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的試劑盒的用途，用于特異性檢測(cè)人髓系相關(guān)分 化標(biāo)志蛋白。
[0027] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1A、HL_60細(xì)胞（前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞）的hMYADM單克隆抗體（DS6、EF1、PCD1) 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以同型抗體正常小鼠 IgG(購(gòu)自BD公司）作為對(duì)照。
[0029] 圖1B、HL_60細(xì)胞（前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞）的hMYADM單克隆抗體（FMA1、LK1、FB6) 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以同型抗體正常小鼠 IgG(購(gòu)自BD公司）作為對(duì)照。
[0030] 圖2A、應(yīng)用DS6、EF1、P⑶1作為抗體，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)白血病細(xì)胞U937表面 hMYADM的表達(dá)，以同型抗體正常小鼠 IgG作為對(duì)照。
[0031] 圖2B、應(yīng)用FMA1、LK1、FB6作為抗體，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)白血病細(xì)胞U937表面 hMYADM的表達(dá)，以同型抗體正常小鼠 IgG作為對(duì)照。
[0032] 圖3、生物素標(biāo)記的單抗的鑒定。
[0033] 圖4、顯示可溶性hMYADM分子檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以DS6作為包被抗體， FMl作為檢測(cè)抗體，然后加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品rhMYAD/Fc重組蛋白作為檢測(cè)抗原，繪制 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。X軸代表抗體原濃度，Y軸代表光密度0D450值。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，首次找到一種特異性抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白 (hMYADM)的單克隆抗體。所述的單克隆抗體可良好地識(shí)別hMYADM抗原，不與其它蛋白發(fā)生 交叉反應(yīng)，特異性和靈敏度均非常高。
[0035] 本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，一種抗原可能含有多個(gè)抗原表位（抗原決定簇），因此， 針對(duì)同一個(gè)抗原可以獲得不止一個(gè)抗體，這些抗體對(duì)抗原的結(jié)合特性（如特異性等）均可 能是不同的。因此，針對(duì)同一個(gè)抗原，本領(lǐng)域人員需要進(jìn)行大量的反復(fù)比較、篩選和鑒定，才 能找到適合于特異性結(jié)合的單抗。本發(fā)明中，由于hMYADM氨基酸序列長(zhǎng)，抗原決定簇很多 被包在蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，因此難以找到一種特異性高的單克隆抗體。一些抗hMYADM單克隆 抗體當(dāng)用于實(shí)際檢測(cè)時(shí)，遭遇到與天然hMYADM蛋白結(jié)合特性差的問(wèn)題，這可能是由于待測(cè) 樣品中hMYADM蛋白的抗原決定簇被包在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部，無(wú)法接觸到抗體造成的。
[0036] 針對(duì)上述技術(shù)難題，本發(fā)明人選取了多種hMYADM蛋白的片段來(lái)免疫動(dòng)物，獲取動(dòng) 物的脾細(xì)胞用于制備雜交瘤細(xì)胞株，從而找到合適的用于免疫的片段。作為本發(fā)明的優(yōu)選 方式，所述的hMYADM蛋白片段是來(lái)自于hMYADM氨基酸序列第127-144位上的一段18肽氨 基酸序列FLSHGRSRDHAIAATFFS (SEQ ID NO: 1)，具有良好的免疫原性，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)單克隆篩 選和驗(yàn)證，從而獲得本發(fā)明的DS6單克隆抗體。
[0037] 作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方式，所述的hMYADM蛋白片段是來(lái)自于hMYADM氨基酸序 列第187-204位上的一段18肽氨基酸序列正4?150?1￥〇即?41^(5￡〇10勵(lì):2)，具有良好 的免疫原性，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)單克隆篩選和驗(yàn)證，從而獲得本發(fā)明的FMl單克隆抗體。
[0038] 所述單克隆抗體對(duì)于hMYADM蛋白具有很高的特異性，不結(jié)合于hMYADM以外的其 它蛋白。并且，當(dāng)用于檢測(cè)時(shí)，無(wú)需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行過(guò)多的處理即可獲得精確的檢測(cè)結(jié)果。 并且，以所述的單克隆抗體為基礎(chǔ)，可制備準(zhǔn)確地檢測(cè)hMYADM的試劑盒。
[0039] 本發(fā)明的單克隆抗體利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備（見(jiàn)Kohler等，Nature256 ;495， 1975 ;Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6:511,1976 ;Kohler 等，Eur. J. Immunol. 6:292,1976; Hammerling 等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., 1981)。本發(fā)明的單克隆抗體的一種雜交瘤的制備方法是：
[0040] (1)小鼠免疫：選擇適齡的小鼠，以抗原肽對(duì)小鼠進(jìn)行免疫；
[0041] (2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0并使之保持良好的生長(zhǎng) 狀態(tài)用于細(xì)胞融合；
[0042] (3)細(xì)胞融合：以BALB/C小鼠脾細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞。將⑴中備好的小鼠處死， 制備免疫脾細(xì)胞懸液。收集（2)中的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。將上述兩種細(xì)胞混合離心，然后以 聚乙二醇（PEG)介導(dǎo)細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，接種至培養(yǎng)板，適當(dāng)條件培養(yǎng)；
[0043] (4)雜交瘤細(xì)胞的篩選：將上述培養(yǎng)物在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細(xì)胞集落長(zhǎng)到 大小合適時(shí)，吸取培養(yǎng)液上清做抗體鑒定，篩選陽(yáng)性克?。?br> [0044] (5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化：以有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞，將稀釋到一定密度的 細(xì)胞接種至96孔板，使每孔只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。形成細(xì)胞集落的孔取上清做酶聯(lián)免疫吸 附實(shí)驗(yàn)（ELISA)，鑒定陽(yáng)性克隆?？梢灾貜?fù)克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性孔率達(dá)到 100%。將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)做抗體鑒定；
[0045] (6)小鼠腹水的誘導(dǎo)：在接種雜交瘤細(xì)胞前10天，給BALB/C小鼠腹腔注射液體石 蠟0. 5ml/只，然后接種陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞I. OX IO6/只，10天后收集腹水后離心，測(cè)定抗體效 價(jià)，并純化單克隆抗體；
[0046] (7)單克隆抗體的純化：經(jīng) Affi-Gel protein A-agarose 親和柱（Bio-Rad)純化 腹水上清中的單克隆抗體。
[0047] 在獲得了所述雜交瘤的情況下，可按照常規(guī)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)擴(kuò)增 所述的雜交瘤細(xì)胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。作為一種實(shí)施方式，所述的單克隆抗 體可以由下列制備方法制備：（1)提供佐劑預(yù)處理的小鼠；（2)在小鼠腹腔內(nèi)接種所述的雜 交瘤細(xì)胞并分泌單克隆抗體；（3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。作為一種方式， 從腹水中分離單克隆抗體的方法是：收集腹水，用經(jīng)硫酸銨、辛酸沉淀，接著用Protein G 預(yù)裝層析柱純化，獲得高純度的抗hMYADM單克隆抗體。
[0048] 本發(fā)明的單克隆抗體還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。本領(lǐng)域人 員均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系或通過(guò)測(cè)序等手段得知所述的單克 隆抗體后，本領(lǐng)域人員可以方便地獲得所述的抗體。
[0049] 檢測(cè)試劑盒
[0050] 在獲得了本發(fā)明的抗hMYADM單克隆抗體后，本領(lǐng)域人員可通過(guò)多種途徑來(lái)靈敏 地檢測(cè)樣品中hMYADM蛋白及其濃度，采用的技術(shù)可以是免疫學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)。包括定 性檢測(cè)和定量檢測(cè)方法。較佳地，所述的定性檢測(cè)包括：通過(guò)免疫印跡方法或免疫熒光的方 法鑒定人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的存在情況；較佳地，所述的定量檢測(cè)包括：通過(guò)流式細(xì) 胞方法對(duì)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)的強(qiáng)度或陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行定量，或通過(guò)雙抗體夾心 ELISA法對(duì)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)的強(qiáng)度進(jìn)行定量。
[0051] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在hMYADM的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中 含有一種或多種本發(fā)明的抗hMYADM單克隆抗體。
[0052] 所述試劑盒中除了含有本發(fā)明的抗hMYADM單克隆抗體以外，還可以包含其它檢 測(cè)試劑或輔劑，如顯色劑、標(biāo)記物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，各種變化形 式的檢測(cè)試劑盒均是包含在本發(fā)明中的，只要其中利用了本發(fā)明的抗hMYADM單克隆抗體 作為與hMYADM特異性結(jié)合的試劑。
[0053] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，ELISA對(duì)目標(biāo)抗原檢測(cè)的靈敏度、特異性主要取決于其中所 應(yīng)用的抗體的性質(zhì)和質(zhì)量。而本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的基于hMYADM氨基酸序列第 127-144位免疫動(dòng)物而制備的DS6抗體與基于hMYADM氨基酸序列第187-204位制備的FMl 抗體可以構(gòu)成抗體組合，良好地應(yīng)用于雙夾心ELISA法檢測(cè)hMYADM。雙抗夾心法常規(guī)的做 法是將包被抗體固定于載體，然后包被抗體與抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶標(biāo)記的檢測(cè)抗體反 應(yīng)，洗滌，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。雙抗夾心法特別適用于具有兩個(gè)或 兩個(gè)以上表位的抗原的檢測(cè)。相對(duì)于單抗體的競(jìng)爭(zhēng)法來(lái)說(shuō)，雙抗體夾心法的測(cè)定效果更為 優(yōu)良，因而測(cè)定時(shí)只需很少的樣品量。所以采用雙抗體夾心法無(wú)論在靈敏度、精確度、準(zhǔn)確 度、特異性及穩(wěn)定性上更具有優(yōu)勢(shì)。
[0054] 作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，以DS6抗體作為包被抗體，以FMl作為檢測(cè)抗體，其檢 測(cè)靈敏度更為理想。
[0055] 所述的包被抗體被包被在固相載體上。本發(fā)明對(duì)所采用的固相載體沒(méi)有特別的限 制，只要其能夠與包被抗體相偶聯(lián)（連接）即可。例如，所述的固相載體選自：微量滴定板 (如96孔板）、或微球等。
[0056] 如本文所用，所述的"標(biāo)記物"是指用于確定待檢測(cè)樣品中hMYADM的存在與否以 及存在的量的標(biāo)志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的包被抗體和/或檢測(cè)抗體后，可 以采用本領(lǐng)域常規(guī)用于與檢測(cè)抗體結(jié)合來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的各種標(biāo)記物。本發(fā)明對(duì)所采用的標(biāo)記 物沒(méi)有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測(cè)抗體結(jié)合，且在適當(dāng)處理后能夠準(zhǔn)確地指示 待檢測(cè)樣品中hMYADM蛋白的存在與否以及存在量的標(biāo)記物均是可用的。所述的標(biāo)記物可 直接被設(shè)置于檢測(cè)抗體上；或者，所述的標(biāo)記物也可被設(shè)置于特異性抗檢測(cè)抗體的抗抗體 上，本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的抗體的種類和特性，選擇適宜的標(biāo)記物。例如，所述的標(biāo)記 物可以選自：辣根過(guò)氧化物酶（HRP)、堿性磷酸酯酶（AP)、葡萄糖氧化酶、P -D-半乳糖苷 酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0057] 當(dāng)采用如上所示的一些酶標(biāo)記物時(shí)，還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物，從 而可通過(guò)顯色等方式來(lái)報(bào)導(dǎo)標(biāo)記物的存在情況或者存在量。如本文所用，所述的"與標(biāo)記 物相對(duì)應(yīng)的底物"是指可被標(biāo)記物所催化顯色，用于顯示檢測(cè)抗體與hMYADM發(fā)生結(jié)合的識(shí) 別信號(hào)。所述的底物例如：用于辣根過(guò)氧化物酶的鄰苯二胺（OPD)、四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、 ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP);等等。本 領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的標(biāo)記物的種類和特性，選擇適宜的底物。
[0058] 為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置含已知濃度的多個(gè)hMYADM蛋白的標(biāo) 準(zhǔn)品。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法可采用常規(guī)的方法。
[0059] 此外，在所述試劑盒中還可包含使用說(shuō)明書(shū)，用于說(shuō)明其中裝載的試劑的使用方 法。
[0060] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供了一種抗hMYADM的單克隆抗體，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。制備方 法簡(jiǎn)單易行，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種用途，如對(duì)細(xì)胞和組織中 hMYADM分子表達(dá)情況的定性和定量等，可應(yīng)用于檢測(cè)該新基因在不同組織和細(xì)胞，以及在 骨髓干細(xì)胞向髓系分化不同階段的表達(dá)特征，更方便地應(yīng)用于該新基因的生物學(xué)和免疫學(xué) 功能研究。
[0061] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0062] 實(shí)施例1、抗hMYADM的單克隆抗體的制備方法
[0063] (I) hMYADM 表位選擇
[0064] 針對(duì)hMYADM全長(zhǎng)氨基酸序列（GenBank登錄號(hào)AY037147)，將序列分為不同的短肽 片段，片段長(zhǎng)度10_30aa，用于免疫小鼠，篩選免疫原性良好、免疫后可獲得對(duì)hMYADM抗原 具有良好特異性和敏感性的短肽。
[0065] (2)小鼠的免疫及骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
[0066] BALB/C小鼠購(gòu)自上海必凱公司。首次免疫：將交聯(lián)BSA的hMYADM短肽片段（上海 吉爾生化公司合成）以弗氏完全佐劑（購(gòu)自Sigma公司）乳化，第2、3次以弗氏不完全佐 劑（購(gòu)自Sigma公司）乳化，每鼠0. 2ml (含100 ii g多肽），背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每周一次。 初次免疫3周后加強(qiáng)免疫2次,每次間隔2周。末次免疫3天后,取脾細(xì)胞。
[0067] 把來(lái)自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，在含5%C02飽 和濕度的37°C孵箱中培養(yǎng)。融合前1天傳代以保證融合時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0068] (3)細(xì)胞融合
[0069] 將hMYADM肽段免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0做細(xì)胞融合。取對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0, IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì) 數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng) 液洗滌2次。將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按I : 10或1 : 5的比例混合在一起，在50ml塑料 離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm，8分鐘。棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影 響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。在室溫下融合：30秒內(nèi)加入預(yù) 熱的lml45%PEG (購(gòu)自默克公司，分子量4000)含5%DMS0,邊加邊攪拌；作用90秒鐘，若冬 天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘；加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別 加入lml，2ml，3ml，4ml，5ml和IOml ;離心，800rpm，6分鐘；棄上清,先用6ml左右20%小牛 血清RPMI1640輕輕混懸。根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，IOml -塊96孔 板。將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100 ill /孔，然后將培養(yǎng)板置于37°C、 5%C02的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0070] (4)雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0071] 應(yīng)用HAT選擇培養(yǎng)液篩選融合細(xì)胞，每隔3天換1/2培養(yǎng)液一次，12天后改用HT 培養(yǎng)液，約持續(xù)培養(yǎng)兩周。在細(xì)胞集落長(zhǎng)到適當(dāng)大小時(shí)，吸取培養(yǎng)液上清，做ELISA，篩選 陽(yáng)性克隆。采用ELISA間接法篩選陽(yáng)性雜交瘤。主要步驟：①0. OlM pH9. 6碳酸鹽緩沖 液稀釋hMYADM重組蛋白（全長(zhǎng)322氨基酸），I ii g/ml，0. Iml/孔包板，4°C過(guò)夜；②0. OlM pH7. 4PBS-Tween20洗板三次；③10%FCS0. OlM pH7. 2的PBS封閉30s ;④同上洗板；⑤加入 雜交瘤培養(yǎng)上清，〇. Iml/孔，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，37°C Xlhr ;⑥洗板； ⑦加羊抗小鼠 IgG/HRP，0. Iml/孔，37°C Xlhr ;⑧洗板；⑨加入底物（TMB)37°C X30s ;⑩2M H2SCM終止反應(yīng)；490nm測(cè)定其OD值，以P/N > 2. 1為陽(yáng)性。
[0072] (5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化
[0073] 雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進(jìn)行，選擇抗體陽(yáng)性的雜交瘤孔細(xì)胞作適 當(dāng)增殖后，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞。用完全1640培養(yǎng)基稀釋成10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種到已有飼 養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)液中，每孔0. lml，7-10天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并檢測(cè)上清液中抗體， 選擇抗體滴度較高，呈單個(gè)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，作再次克隆化培養(yǎng)，直至單克隆孔抗體 檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。
[0074] (6)誘生腹水
[0075] 在接種雜交瘤細(xì)胞前10天，給BALB/C小鼠腹腔注射液體石蠟每只0. 5ml，然后每 只接種I. ox IO6陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，10天后收集腹水測(cè)定抗體效價(jià)。
[0076] (7)單克隆抗體的純化和類別鑒定
[0077] 經(jīng) Affi-Gel protein A-agarose 親和柱（Bio-Rad Laboratories)純化得到單克 隆抗體。用標(biāo)準(zhǔn)抗Ig類與亞類血清系統(tǒng)作夾心ELISA來(lái)分析所得到單克隆抗體的表型。
[0078] (8) hMYADM肽段篩選結(jié)果
[0079] hMYADM上不同位置的短肽免疫小鼠，制備雜交瘤細(xì)胞，最終獲得許多株單抗。進(jìn)一 步驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用來(lái)自于hMYADM氨基酸序列第127-144位上的一段18肽氨基酸序列 FLSHGRSRDHAIAATFFS (SEQ ID NO: 1)，具有良好的免疫原性，可獲得高效價(jià)的單抗。
[0080] 本發(fā)明人還篩選到來(lái)自于hMYADM氨基酸序列第187-204位上的一段18肽氨基酸 序列正4?130?1￥〇即?41^(3￡〇10勵(lì):2)，具有良好的免疫原性，可獲得高效價(jià)的單抗。
[0081] 而根據(jù)hMYADM其它位置設(shè)計(jì)的肽段，存在免疫原性不理想的問(wèn)題，或存在后續(xù)得 不得高特異性和高敏感性抗體的問(wèn)題。
[0082] 實(shí)施例2、用該單克隆抗體進(jìn)行hMYADM分子的鑒定
[0083] 應(yīng)用抗hMYADM單克隆抗體鑒定細(xì)胞表面表達(dá)的hMYADM分子（定性檢測(cè)），鑒定方 法：
[0084] 1、間接免疫熒光
[0085] 主要步驟：
[0086] ① HL-60細(xì)胞（購(gòu)自ATCC)以RPMI1640培養(yǎng)基懸浮于96孔板，IOOul/孔，37°C， 4h ;②0. OlM PH7. 2PBS洗板三次；③培養(yǎng)上清IOOul/孔，37°C X I. 5h，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照 (isotype control);④同上洗板；⑤加入單克隆抗體IOOii 1(1 :100)，37°C，lh ;⑥洗板三 次；⑦IOOyl PBS懸浮，加入Alexa Fluo594 (綠色突光)或0regon_green488 (紅色突光） 標(biāo)記的羊抗鼠二抗（購(gòu)自Invitrogen公司）3 ii 1，純小牛血清100 ii 1，室溫避光1小時(shí)；⑧ 同上洗三次，400 ill PBS懸?。虎釤晒忡R檢。
[0087] HL-60細(xì)胞為hMYADM表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，如上間接免疫處理后，根據(jù)在熒光顯微鏡下 見(jiàn)到的細(xì)胞表面的熒光情況，可選擇到敏感性和特異性好的單克隆抗體。應(yīng)用18肽氨基酸 序列FLSHGRSRDHAIAATFFS免疫獲得的部分單抗間接免疫細(xì)胞后的鏡檢結(jié)果參見(jiàn)圖1A，應(yīng) 用單克隆抗體DS6免疫的細(xì)胞表面上熒光顯著，而其它單抗如EFl、PCDl等則效果則不理 想。因此，單克隆抗體DS6對(duì)于hMYADM抗原具有良好的敏感性和特異性，經(jīng)鑒定其表型為 IgGl，kappa。
[0088] 應(yīng)用18肽氨基酸序列IFAFISDPNLYQHQPALE免疫獲得的部分單抗間接免疫細(xì)胞 后的鏡檢結(jié)果參見(jiàn)圖1B，應(yīng)用單克隆抗體FMl免疫的細(xì)胞表面上熒光顯著，而其它單抗如 LK1、FB6等則效果則不理想。因此，F(xiàn)MAl對(duì)于hMYADM抗原具有良好的敏感性和特異性，經(jīng) 鑒定其表型為IgGl, kappa。
[0089] 2>Western Blotting
[0090] HL-60細(xì)胞的裂解物用該單克隆抗體DS6進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，在相應(yīng)位 置呈現(xiàn)目的條帶，表明檢測(cè)到hMYADM分子的表達(dá)。具體步驟：
[0091] (I) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0092] 方法參見(jiàn)F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（科學(xué)出版社1998)。采用10% 分離膠和5%濃縮膠，電泳條件為電壓100V，電泳完畢后進(jìn)行考馬斯亮蘭染色。
[0093] (2)電轉(zhuǎn)移
[0094] 方法參見(jiàn)F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（科學(xué)出版社1998)。用電轉(zhuǎn) 移方式將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。
[0095] (3)免疫印跡
[0096] 5%脫脂奶粉4°C封閉過(guò)夜后，用本發(fā)明制備的單抗作為一抗，室溫下孵育2小時(shí)或 4°C反應(yīng)過(guò)夜，用TST (TBS加入0. 5%tween)洗滌3次，每次10min，再用TBS洗滌3次，每次 10min。以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG作為二抗，室溫反應(yīng)2h，用上述方法洗滌后用 ECL作用Imin后，利用化學(xué)發(fā)光成像儀成像。
[0097] 實(shí)施例3、用該單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面hMYADM分子的定量
[0098] 用流式細(xì)胞儀（FACS)方法檢測(cè)U937細(xì)胞（購(gòu)自ATCC)表面表達(dá)hMYADM分子的強(qiáng) 度：收集培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS (含2%FCS)洗滌3次（1000g/5min/4°C )，棄上清，細(xì)胞打 勻后每管加入2-5X IO5個(gè)細(xì)胞，加入本發(fā)明制備的部分單克隆抗體（FLSHGRSRDHAIAATFFS 免疫獲得）作為一抗，同型Ig為陰性對(duì)照抗體。試管置冰上，暗處反應(yīng)30min，用PBS洗 滌細(xì)胞3遍，離心棄上清，打勻后用FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG孵育30min，將細(xì)胞沉淀重懸于 250 ill的PBS中，在流式細(xì)胞儀（FACS cal ibur，BD公司）上檢測(cè)，Cel IQuest軟件分析，可 得到細(xì)胞表面表達(dá)hMYADM分子的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率，結(jié)果見(jiàn)圖2A，圖中的熒光強(qiáng)度表 示hMYADM的表達(dá)量。由結(jié)果可見(jiàn)，單克隆抗體DS6可良好地實(shí)現(xiàn)hMYADM抗體定量，定量結(jié) 果與公知的U937細(xì)胞表面hMYADM分子的表達(dá)強(qiáng)度相符，而其它單克隆抗體如EFl和PCDl 則檢測(cè)效果不理想，存在假陰性。
[0099] 同上述步驟，應(yīng)用本發(fā)明制備的部分單克隆抗體（IFAFISDPNLYQHQPALE免疫獲 得）作為一抗，同型Ig為陰性對(duì)照抗體進(jìn)行hMYADM抗體定量，結(jié)果見(jiàn)圖2B。由結(jié)果可見(jiàn)， 單克隆抗體FMl可良好地實(shí)現(xiàn)hMYADM抗體定量，定量結(jié)果與公知的U937細(xì)胞表面hMYADM 分子的表達(dá)強(qiáng)度相符，而其它單克隆抗體如LKl和FB6則檢測(cè)效果不理想，存在假陰性。
[0100] 實(shí)施例4、可溶性hMYADM分子檢測(cè)試劑盒的制備
[0101] 本實(shí)施例中，聯(lián)合應(yīng)用DS6單抗和FMl單抗檢測(cè)體液中可溶性或游離狀態(tài)的 hMYADM分子的存在及其相對(duì)水平。
[0102] (1)單克隆抗體的生物素（Biotin)標(biāo)記
[0103] 用碳酸鹽緩沖液（0. 01MCBS，pH9. 3)將純化的單抗（FMAl和DS6)的濃度調(diào)整為 200ug/ml，4°C透析過(guò)夜。然后，移入Eppendof管，并加入濃度為lmg/ml的生物素40ul，避 光震蕩4小時(shí)，再置于0.01M PBS(pH7. 2)中4°C透析72h后，分裝并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0104] (2)生物素標(biāo)記的單抗的鑒定
[0105] 將HL60細(xì)胞用PBS洗滌后，分裝于小試管中（5X105/管）。分別加入2株生物 素標(biāo)記的單抗FMl和DS6,4°C反應(yīng)45min。充分洗滌后加入熒光素標(biāo)記的鏈酶親和素 (streptavidin-PE)，再于4°C反應(yīng)45分鐘得到生物素標(biāo)記的單克隆抗體FMAl和DS6,流式 檢測(cè)結(jié)果表明，單抗FMAl和DS6均能良好地標(biāo)記生物素，如圖3。
[0106] (3)包被抗體的選擇檢測(cè)方法的建立
[0107] 用碳酸鹽緩沖液將本發(fā)明的兩株單抗的濃度調(diào)整為2ug/ml，分別作為包被抗體 用于包被0.01%多聚賴氨酸預(yù)處理（總劑量：l〇KGy、劑量率為lGy/min)的酶標(biāo)檢測(cè)板 (IOOul/孔），4°C保溫過(guò)夜。用4%BSA4°C封閉過(guò)夜并洗滌后，分別加入商品化的rhHMYADM/ Fc 重組蛋白（購(gòu)自 Abcam 公司）（lng/ml、500ng/ml 和 lug/ml，IOOul/ 孔），37°C反應(yīng) 2h。 洗滌后，分別加入對(duì)應(yīng)的生物素標(biāo)記的單抗（lOOul/孔），其中，當(dāng)DS6作為包被抗體時(shí)， 以FMl作為檢測(cè)抗體；反之，當(dāng)FMl作為包被抗體時(shí)，以DS6作為檢測(cè)抗體，37°C反應(yīng) lh。充分洗漆后，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（streptavidin-HRP) (I :1000 ; IOOul/孔），37°C反應(yīng)30min。洗滌后，加入臨時(shí)配制的底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB，100ul)， 37°C反應(yīng)15min后，用20mol/L H2S04(50ul/孔）終止酶促反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上測(cè)定OD45tl值。
[0108] 結(jié)果表明，F(xiàn)MAl和DS6無(wú)論作為包被體還是作為檢測(cè)抗體，均適用于制備本發(fā)明 的試劑盒，但使用DS6作為包被抗體并使用FMl作為檢測(cè)的標(biāo)記抗體，將會(huì)進(jìn)一步提高檢 測(cè)的靈敏度。
[0109] 因此，上述的DS6抗體和FMAl抗體可以良好地實(shí)現(xiàn)hMYADM抗原的夾心ELISA檢 測(cè)。
[0110] (4)可溶性hMYADM(sHMYADM)線性工作曲線的繪制
[0111] 用單克隆抗體DS6包被酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)版，4 °C保存過(guò)夜。PBS(含 0. 01%Tween-20)洗滌后，用4%BSA封閉過(guò)夜。洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)品rhHMYADM/Fc重組蛋白的梯 度稀釋液（1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、66. 67ng/ml、22. 22ng/ml、7. 41ng/ml、2. 47ng/ ml、0. 82ng/ml和0. 27ng/ml，lOOul/孔）。分析并記錄結(jié)果后，以shMYADM/Fc的濃度為橫 坐標(biāo)，OD15tl值為縱坐標(biāo)，繪制shMYADM的線性工作曲線。
[0112] 結(jié)果顯示，在0. 82-600ng/ml抗原濃度區(qū)間內(nèi)，抗原濃度與吸光度OD45tl之間具有 良好的線性關(guān)系，如圖4。
[0113] (5)檢測(cè)方法的穩(wěn)定性分析
[0114] 用單克隆抗體DS6包被多孔板，并于4°C下保存0、7、14、21天。重復(fù)上述夾心 ELISA法檢測(cè)，分析工作曲線中的部分測(cè)定點(diǎn)（663. 7ng/ml、22. 2ng/ml、7. 4ng/ml、2. 5ng/ ml)數(shù)值的變異。
[0115] 結(jié)果表明，用上述方法建立的可溶性HMYADM分子檢測(cè)試劑盒具有較好的靈敏性 和穩(wěn)定性，完全適合于廣泛推廣使用。
[0116] 實(shí)施例5、可溶性hMYADM分子檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0117] 攜帶人hMYADM基因的人U937細(xì)胞膜裂解液中可溶性hMYADM分子的檢測(cè)。
[0118] (a)細(xì)胞裂解液的制備
[0119] 取I X IO7的U937細(xì)胞，PBS洗滌三次后棄盡上清，重懸于0. 5ml預(yù)冷的 RIPA (I X PBS，1%NP_40，0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1%SDS)膜裂解液，向其中加入蛋白抑制劑 IOOul PMSF(10mg/ml，30ug/ml Aprotinin, 10Ommol/Na3VO4)并混勻。4°C條件下，用 Iml 針 筒輕輕吸放10次后，4°C冰箱靜置30分鐘。然后移入Eppendoff管中，再加入PMSF20ul，混 勻后于12000rpm離心10分鐘。然后收集上清，于-80°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0120] (b)細(xì)胞裂解液中可溶性hMYADM含量的測(cè)定
[0121] 將上述方法制備的細(xì)胞膜裂解液倍比稀釋后，用前述建立的雙抗體夾心法（使用 DS6作為包被抗體，并使用FMl作為檢測(cè)的標(biāo)記抗體）分析裂解液中可溶性hMYADM分子的 含量。
[0122] 結(jié)果顯示，U937細(xì)胞裂解液中shMYADM含量為5ng/ml。并且細(xì)胞膜裂解液中可溶 性hMYADM的濃度，隨著膜裂解液稀釋倍數(shù)的增加而降低。
[0123] 生物材料保藏
[0124] 本申請(qǐng)中，雜交瘤細(xì)胞株DS6已經(jīng)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)，武漢）， 保藏號(hào)為：CCTCC NO:C201333,保藏日為：2013年4月3日。
[0125] 本申請(qǐng)中，雜交瘤細(xì)胞株FMAl已經(jīng)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)，武 漢），保藏號(hào)為：CCTCC NO:C201332,保藏日為：2013年4月3日。
[0126] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的多肽，其特征在于，該多肽來(lái)源于人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白，其氨基酸序 列如SEQ ID N0:1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于作為抗原，制備特異性檢測(cè)人髓系 相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體。
3. -種單克隆抗體，其是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201333的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克 隆抗體。
4. 權(quán)利要求3所述的單克隆抗體的用途，用于制備特異性檢測(cè)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋 白的檢測(cè)試劑盒。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的檢測(cè)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白包括： (1)定性檢測(cè)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白；或（2)定量檢測(cè)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白； 較佳地，所述的定性檢測(cè)包括：通過(guò)免疫印跡方法或免疫熒光的方法鑒定人髓系相關(guān) 分化標(biāo)志蛋白的存在情況； 較佳地，所述的定量檢測(cè)包括：通過(guò)流式細(xì)胞方法對(duì)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)的 強(qiáng)度或陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行定量，或通過(guò)雙抗體夾心ELISA法對(duì)人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白表達(dá) 的強(qiáng)度進(jìn)行定量。
6. -種雜交瘤細(xì)胞株，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC N0:C201333。
7. -種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其中包括權(quán)利要求3所述的單克隆抗體或權(quán)利要求6 所述的雜交瘤細(xì)胞株。
8. 如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括：另一單克隆 抗體，該另一單克隆抗體是特異性抗人髓系相關(guān)分化標(biāo)志蛋白的單克隆抗體，其由保藏號(hào) 為CCTCC N0:C201332的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括：固相載體；較佳 地，權(quán)利要求3所述的單克隆抗體包被于所述的固相載體；較佳的，所述的另一抗體還連接 有標(biāo)記物。
10. 如權(quán)利要求7-9任一所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括： 與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物； 顯色劑； 洗滌液；和/或 終止液。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104277096SQ201310289480
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】李楠, 曹雪濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)