專利名稱：新的TGF-β家族的生長/分化因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的TGF-β家族的生長/分化因子及其DNA編碼序列。
屬于TGF-β家族的生長因子有BMP-、TGF-及激活素/抑制素-相關的蛋白(Roberts und Sporn，Handbook of Experimental Pharmacology 95，419-472，(1990))。此類生長因子廣泛應用于臨床治療及相關應用。此類因子適于創(chuàng)傷治療及組織再生。并且，TGF-β家族的更多因子可誘導組織如骨骼生長。
Wozney(Progress in Growth Factor Research 1(1989)，267-280)和Vale等人(Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990)，211-248)報道了各種不同的生長因子如與BMP-和激活素/抑制素組相近的因子。這種的成員之間具有明顯的結(jié)構(gòu)相似性。此類蛋白的前體由一個N端信號序列、前肽和一個含有110至140個氨基酸的C端序列構(gòu)成。C端從前體分裂之后成為成熟蛋白。此類因子根據(jù)其氨基酸序列的同源性來劃分。成熟蛋白含有高度保守的序列，尤其是此類因子具有該家族成員所共有的7個半胱氨酸殘基。TGF-β類蛋白是多功能的具有激素活性的生長因子，并且也具有其他相關的生物活性如細胞的向化性、促進細胞的分化和組織誘導能力。EP 0 222 491 A1公開了抑制素α和β鏈的序列。
總之，TGF-β類蛋白在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別使其具有相當不同的生物學作用，并且此類蛋白存在于廣泛不同的組織類型和發(fā)育時期。因而在執(zhí)行具體功能方面有所不同，如要求的細胞生理環(huán)境、壽命、定位、對輔助因子的需求、抗降解能力。盡管已描述很多蛋白具有組織誘導的潛力，但是對其在機體內(nèi)，尤其是在醫(yī)學上的作用還需進行詳細研究。很可能還有未知的TGF-β家族成員蛋白，它們對于不同組織的分化/誘導特別有意義。由于對其功能不夠了解，而缺乏鑒別不同TGF-β蛋白的生物檢測方法，因而這些新的TGF-β蛋白的分離具有很大難度。另一方面，與已知TGF-β蛋白的核酸序列同源性太小，傳統(tǒng)的核酸雜交技術也不可能用于篩選未知的TGF-β蛋白。盡管如此，急需分離鑒定新的TGF-β蛋白以滿足所有醫(yī)療上所需要的具有(組織)誘導/分化作用的蛋白。該類(蛋白)因子可用于治療各種組織損傷和組織退化疾病。
PCT/EP93/00350專利申請?zhí)峁┝薚GF-β蛋白MP121的一個核酸和蛋白序列，并標明了大部分與成熟肽相對應的序列。MP121前體肽的全序列還未公開發(fā)表。
本發(fā)明的根本任務是得到新的具有促細胞分裂和/或誘導分化潛力的TGF-β蛋白的DNA編碼序列，尤其是TGF-蛋白MP121的DNA和氨基酸全長序列。
這一問題的解決在于得到一個編碼TGF-β家族蛋白的DNA分子，它包含(a)編碼成熟蛋白區(qū)段及任選地SEQ ID NO.1中標明的核甘酸序列的其它功能區(qū)段(b)由序列(a)根據(jù)遺傳密碼的簡并而得到的核酸序列之一(c)一種對應于序列(a)和(b)之一的等位衍生物的核苷酸序列(d)基于其源自其它脊椎動物而與序列(a)不同的序列之一(e)與(a)、(b)、(c)、或(d)的序列之一雜交的核苷酸序列并且前提是根據(jù)(e)的DNA分子至少要含有TGF-β家族的成熟蛋白的編碼區(qū)。
本發(fā)明的其它實施形式涉及權利要求2至10的主題，本發(fā)明的其它優(yōu)點和特征由優(yōu)選實施方案說明。序列及圖譜現(xiàn)簡述如下SEQ ID NO.1表示人的TGF-β蛋白MP121的編碼DNA的完整核苷酸序列。起始密碼ATG始于第128個核苷酸。完全成熟蛋白尤其優(yōu)選始于第836個核苷酸。
SEQ ID NO.2是根據(jù)SEQ ID NO.1核酸序列推出的人TGF-β蛋白MP121的原前體蛋白的全長氨基酸序列。成熟蛋白起始點優(yōu)選位于第217至240氨基酸之間的區(qū)域，尤其是第236或第237、而最優(yōu)選第237氨基酸。
SEQ ID NO.3是小鼠的TGF-β蛋白MP121編碼DNA的的完整核苷酸序列。編碼區(qū)開始于第131個核苷酸處的ATG起始碼并結(jié)束于在第1187個核苷酸處的終止碼。優(yōu)選成熟蛋白的起始碼始于第839位核苷酸，在其基因組DNA的第446與447個位置之間有一長度為5.5kb的內(nèi)含子。
SEQ ID NO.4是小鼠TGF-β蛋白MP121的原前體蛋白的完整氨基酸序列，該氨基酸序列是根據(jù)SEQ ID NO.3的核苷酸序列而得到的。該成熟蛋白起始點與SEQ ID NO.2的人MP121蛋白的起始點相當，即在第217至240氨基酸之間的區(qū)域。該成熟蛋白的最優(yōu)選的起始點是第237個氨基酸，這樣成熟蛋白部分正如人的MP121成熟蛋白一樣由116個氨基酸組成。TGF-β家族的前體蛋白通常在RXXR位點之后切開從而分離成熟蛋白(見zkaynak et al.，J.Biol.Chem.267，25220-25227，(1992)及其所引的文獻)。因此就小鼠的MP121而言，成熟蛋白的至少部分起始點也可能是第236個氨基酸。
SEQ ID NO.5顯示人的MP121基因的外顯子/內(nèi)含子相接的核苷酸序列。兩個外顯子的核苷酸由大寫字母表示，而內(nèi)含子序列由小寫字母表示。


圖1是人MP121與一些TGF-β家族成員(抑制素α和β鏈)的氨基酸序列的比較，該圖的比較是由7個保守的半胱氨酸殘基的第一個開始。*表示該氨基酸在參加比較的所有蛋白中都是相同的；+表示在至少有一個參加比較的蛋白與人MP121都含有該氨基酸。
圖2表示在此項發(fā)明中應用的寡核苷酸引物的核酸序列以及與已知的TGF-β家族成員的序列比較。M代表A或C，S代表C或G，R代表A或G，而K代表G或T。2a表示引物OD的序列，而2b表示引物OID的序列。
圖3顯示的是利用抗人MP121的雞抗體進行的Western印跡的簡圖。
圖4表示在小鼠不同組織中MP121與激活素βA和βB的表達相比較。
圖5表示利用部分純化的MP121對多巴胺神經(jīng)元進行處理，對該神經(jīng)元的生存力所產(chǎn)生的正面效果。
此外本發(fā)明中涉及的概念“成熟蛋白”也包括總蛋白的功能區(qū)域，它們具有幾乎同樣生物學活性并優(yōu)選至少要含有TGF-β家族的7個保守半胱氨酸所在的區(qū)段的那些區(qū)域。特別是成熟蛋白的N端有可能被輕度修飾，因此其序列會與SEQ ID NO 2和4的序列有所不同。成熟蛋白中可能有附加的氨基酸存在，其存在不影響蛋白的功能、也可能存在氨基酸缺失，只要這些氨基酸的缺失也不限制蛋白的功能。但優(yōu)選人及小鼠的蛋白具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4氨基酸序列中第237個氨基酸以后的所有氨基酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在TGF-β家族的其它成員中，位于成熟蛋白N端的附加氨基酸不影響蛋白的活性，如N端附加的6個組氨酸即屬此種情況。
本發(fā)明包括上述所定義的成熟蛋白的編碼區(qū)段，任選地也包括SEQID NO 1核苷酸序列的其它功能區(qū)段、及根據(jù)遺傳密碼的簡并所產(chǎn)生的所有序列以及這些序列的衍生物。并且，本發(fā)明包括來自其他哺乳動物的由于來源不同而序列稍有不同的編碼TGF-β家族蛋白的DNA序列，但這些DNA所編碼的蛋白序列相近并具有大致相同的生物學作用。這些序列相互間具有很大的共同點，正如SEQ ID NO 1和NO 3比較所得出的相似性一樣。
另外，本發(fā)明也包含與上述序列雜交的序列，前提是這些DNA序列至少含有完整的編碼TGF-β家族成熟蛋白(根據(jù)上述定義)的區(qū)段并保留生物活性。
“功能區(qū)域”的概念從本發(fā)明的角度來講，是指能夠具備MP121蛋白天然區(qū)域的生物學作用之一的蛋白片段，如作為信號肽、前體肽或成熟蛋白部分。
優(yōu)選的人MP121成熟蛋白部分的DNA編碼區(qū)段優(yōu)選從第836個核苷酸開始至終止碼即SEQ ID NO 1所示序列的第1184個核苷酸。任選地該DNA分子還可能包括SEQ ID NO 1所示序列的其它功能區(qū)段，即編碼信號肽或/和前體肽部分的核苷酸序列。特別優(yōu)選該DNA分子包含用于信號-和前肽部分和成熟蛋白的部分的序列，即SEQ ID NO 1所示序列的第128至1184個核苷酸。如SEQ ID NO.3所示，優(yōu)選的小鼠的MP121成熟蛋白的編碼區(qū)始于第839個核苷酸直至第1187個核苷酸的終止碼，某些情況下，該DNA分子也包括SEQ ID NO.3所示序列的其它功能區(qū)段，即信號肽或/和前體肽部分的編碼序列。
另一方面，除成熟肽編碼區(qū)之外，本發(fā)明的DNA分子也包括其它蛋白的功能信號肽和/或前體肽部分的編碼區(qū)，這些蛋白如具有“半胱氨酸結(jié)”(Cystine Knot Motif)的蛋白(Cell，Vol.73(1993).S.421-424)，尤其是TGF-B-家族的其它蛋白如上面所提到的激活素/抑制素或BMP-蛋白，特別是MP52(見PCT/EP94/02630)。所涉及的核苷酸序列來源于上述所列的公開發(fā)表的文獻。重要的是，這些序列仍然保持成熟蛋白的正確閱讀框架。不過，由于在不同的寄主細胞中得到表達，因而不同的信號序列或/及前體肽可能對其表達具有正面影響。前體肽被其它蛋白的前體肽所替代已有諸如以下的報道(Mol.Endocrinol.5(1991)，149-155；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，2905-2909).盡管該專利所覆蓋的所有來自其它脊椎動物的簡并序列及雜交序列，由于其核苷酸或/和氨基酸序列的細微變化而表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，但是，這類序列所編碼的蛋白仍具有大致相同的有用特性，使其仍然可能在醫(yī)學上得到基本相同的應用。
根據(jù)本發(fā)明，“雜交”是常用雜交條件，優(yōu)選利用6×SSC的鹽濃度，雜交溫度為62℃-66℃，之后的洗膜條件是使用0.6×SSC，0.1％SDS，于62℃-66℃洗滌1小時。
本發(fā)明的優(yōu)選實施形式是如上所定義的源于脊椎動物尤其是哺乳動物如豬，雞及嚙齒動物如大鼠或小鼠，尤其是來源于靈長類如人的DNA序列及復制的相應序列。
SEQ ID NO.1及3所示的及稱作人及鼠MP121的序列是本發(fā)明特別優(yōu)選實施形式。MP121基因的轉(zhuǎn)錄在肝組織中進行，其編碼蛋白與抑制素/激活素類的成熟蛋白的氨基酸序列具有很大同源性(見圖1)。人的α-抑制素、抑制素βA(激活素βA)、及抑制素βB(激活素βB)的蛋白序列已由Mason等報道(Biochem.Biophys.Res.Comm.135，957-964(1986))。已知的抑制素序列所特有的典型的序列同源性也在MP121前體肽部分中出現(xiàn)，而MP121前體肽的其它部分與抑制素的前體肽有明顯區(qū)別。
但就目前所知，MP121與激活素的表達模式有所不同。激活素主要在性腺中表達(激活素βA在卵巢，激活素βB在睪丸及卵巢)，而MP121主要在肝臟中表達。迄今所用的實驗方法還不足以檢測其微量表達。據(jù)文獻報道，已證實激活素除了在不同小鼠組織的性腺表達之外也在成年動物(Meunier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，247-251(1988))以及在胚胎發(fā)育過程中表達(Roberts et al.，Endocrinology 128，3122-3129(1991))。因此MP121也可能在其它組織中表達，這還有待于進一步的證實。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是至少含有本發(fā)明中的DNA分子的一個拷貝的載體。在此類載體中，優(yōu)選該DNA分子與控制表達的序列相接。這類載體適用于在穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化的細胞中生產(chǎn)TGF-β類蛋白。不同的動物、植物、真菌及細菌系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)化以及后續(xù)的培養(yǎng)。優(yōu)選本發(fā)明中的載體含有在寄主細胞中復制所必需的序列，并且可自主復制。此外優(yōu)選利用含有可選擇標記基因的載體使寄主細胞的轉(zhuǎn)化能夠得到鑒定。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是經(jīng)本發(fā)明中的DNA或載體轉(zhuǎn)化的寄主細胞，合適的寄主細胞實例包括各種真核及原核細胞，如大腸桿菌、昆蟲細胞、植物細胞，哺乳細胞及真菌如酵母菌。
本發(fā)明的另一重要內(nèi)容是權利要求1的DNA序列所編碼的TGF-β家族的一個蛋白。優(yōu)選該蛋白具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或任選地其功能部分(如上定義)，并且表現(xiàn)出可能與醫(yī)療應用相關的生物特性如組織誘導活性。
由于該蛋白與具有“半胱氨酸結(jié)”的蛋白尤其是TGF-β蛋白形成同源雙體或異源雙體，因而該蛋白的上述特性會有所變化。這些雙體結(jié)構(gòu)同樣可能在臨床上得到應用，所以也是本專利申請的內(nèi)容。優(yōu)選異源雙體包含由本發(fā)明中的蛋白單體及α-，βA-或βB-抑制素鏈的單體形成的異源雙體。優(yōu)選異源雙體的性質(zhì)可能更與激活素及抑制素的性質(zhì)相近。例如若與抑制素α-蛋白或其他抑制素β-蛋白形成異源雙體，那么MP121/抑制素(α-鏈)或MP121/激活素(βA-或βB-鏈)的異源雙體就可能抑制或促進促濾泡激素(FSH)的合成。MP121/激活素異源雙體也可能影響中胚層的發(fā)育?？梢赃M一步預見，與TGF-β蛋白的BMP類的成員形成異源雙體，會增強類BMP活性，諸如誘導或促進骨骼形成，軟骨形成及結(jié)締組織的形成的能力。
因此本發(fā)明的另一內(nèi)容是如下所述的異源雙體由權利要求1的DNA序列所編碼的本發(fā)明的TGF-β家族蛋白，與具有“半胱氨酸結(jié)”的蛋白尤其是與其它TGF-β家族蛋白的單體所形成的異源雙體。類似的異源雙體蛋白在WO93/09229，EPO 626451A2及J.Biol.Chem.265(1990).13198-13205中已有描述。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是如下的嵌合蛋白即具有本發(fā)明的DNA序列編碼蛋白如優(yōu)選SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.4所示的蛋白的功能衍生物或區(qū)段，尤其是具有成熟蛋白的功能區(qū)段并此外含有其它蛋白的部分片段的嵌合蛋白。其它蛋白可以是優(yōu)選屬于TGF-β家族的含有“半胱氨酸結(jié)”的蛋白，如尤其MP52(PCT/EP94/02630).其它的完整蛋白的區(qū)域如蛋白的受體結(jié)合部位，會使原始的MP121蛋白的特異性發(fā)生變化本發(fā)明中的蛋白優(yōu)選MP121的生物特性可根據(jù)以下文獻中的活性分析方法進行確定Wrana等(Cell 71.1003-1014(1992))，Ling等(Proc.Natl.Acad.of Science.82.7217-7221(1985))，Takuwa等(Am.J.Physiol.257.E797-E803(1989))，F(xiàn)ann和Patterson(Proc.Natl.Acad.of Science.91.43-47(1994))，Broxmeyer等(Proc.Natl.Acad.of Science.85.9052-9056(1988))，Green等(Cell.71.731-739(1992))，Partridge等(Endocrinology.108.213-219(1981))或Krieglstein等(EMBO J.14.736-742(1995))。
已有報道，激活素A及TGF-β1，-2和-3在體外具有提高多巴胺神經(jīng)元生存力的效果(Krieglstein等EMBO J.14，736-742(1995))；Krieglstein等Neurosciene 63.1189-1196(1994))。部分純化的MP121對經(jīng)8天培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元的存活力具有促進作用(與對照的上清液相比較)(圖5)。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是生產(chǎn)TGF-β-家族蛋白的如下方法其特征在于，培養(yǎng)本發(fā)明的DNA或載體所轉(zhuǎn)化的寄主細胞，從細胞中或/和培養(yǎng)液的上清液中提取TGF-β-蛋白。該方法包括在合適培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化寄主細胞的培養(yǎng)及所產(chǎn)生的TGF-β-蛋白的提純。通過該方法可生產(chǎn)足夠量的目的蛋白，使其可能應用于醫(yī)療或需要生長因子的細胞培養(yǎng)技術。寄主細胞可以是細菌如芽孢桿菌類或大腸桿菌，真菌如酵母菌，植物細胞如煙草、馬鈴薯或擬南芥，或動物細胞尤其是脊椎動物細胞系如Mo-、Cos-或CHO-細胞系，或昆蟲細胞系。利用桿狀病毒系統(tǒng)，可實現(xiàn)在昆蟲幼蟲中的表達。利用細菌進行生產(chǎn)，則本發(fā)明蛋白可以包含體形式產(chǎn)生。對這些包含體可依照已知的方法進行復性，以得到具有活性的蛋白(見Jaenicke，R.和Rudolph，R.Protein Structure.ed.Creighton，T.E.，IRL Press.Chapter 9)。若生產(chǎn)與其它TGF-β家族成員蛋白所形成的異源雙體，兩種蛋白的單體可在同一細胞系中表達或分別表達，對形成的包含體同樣的復性方法是合適的。適用于在同一細胞系中的共表達的方法主要有病毒系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)或痘菌病毒系統(tǒng)。異源雙體蛋白質(zhì)的生產(chǎn)原則上專業(yè)人員是已知的，如WO93/09229和EP 0626 451A2中所述。
生產(chǎn)含有其它蛋白部分的嵌合蛋白，需要在DNA水平上作相應的改變，這些通常是專業(yè)人員熟知的并由其操作(EMBO J.10(1991)，2105-2110；Cell 69(1992)，329-341；J.Neurosci.39(1994)，195-210)。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是含有藥物有效量的TGF-β蛋白作為有效成分的藥物組合物。這種組合物任選地含有制藥上可接受的載體、輔助劑、稀釋或填充劑。此藥物組合物可單獨用于創(chuàng)傷治療及組織再生，也可與其它有效成分結(jié)合使用，如其它TGF-β蛋白或生長因子如EGF(表皮生長因子或PDGF(血小板生長因子)。并且，此種藥物組合物也可用于預防疾病。
本發(fā)明中的內(nèi)容還有含有本發(fā)明的異源雙體蛋白或/和嵌合蛋白的藥物組合物。
優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物用于治療或預防骨/軟骨/結(jié)締組織/皮膚、黏膜、內(nèi)皮組織、上皮組織、神經(jīng)、大腦、腎或牙齒的損傷；及用于牙齒植入、創(chuàng)傷愈合及組織再生過程；作為促進細胞分裂素用于誘導肝組織生長，誘導骨髓細胞或前體細胞的增生；用于保持分化狀態(tài)及治療不育癥及用于避孕。此外本發(fā)明的藥物組合物還用于治療物質(zhì)交換方面的疾病如消化系統(tǒng)疾病或涉及血糖水平的疾病。
本發(fā)明中的TGF-β蛋白的另一可能的臨床應用是作為免疫反應的抑制因子以避免器官移植后的排斥現(xiàn)象，或用于促進血管生成。并且，本發(fā)明中的蛋白還可用于促進受孕能力或避孕。本發(fā)明中的醫(yī)藥組合物還可用于防病或整容外科。該組合物的使用不局限于人類，也適用于動物、尤其是家養(yǎng)或經(jīng)濟動物。
另外，根據(jù)不同需要異源雙體蛋白及嵌合蛋白的使用范圍及特異性也可由于其它蛋白或蛋白單體的區(qū)段不同而有所改變。
總之，本發(fā)明中的蛋白可用于治療與MP121的表達有關的疾病，一方面可通過提高MP121的量或已有的M121的活性，另一方面，則可通過抑制MP121的活性來實現(xiàn)。因此本發(fā)明的另一項內(nèi)容是合成反義核酸及核酶，以用于抑制MP121的轉(zhuǎn)譯。抑制是由于信使RNA被反義核酸結(jié)合“隱蔽”或被核酶切割。
已有關于合成反義核酸的報道(Weintraub，H.M，Scientific American26240(1990))。反義核酸與相對應的信使RNA雜交而形成不能被轉(zhuǎn)譯的雙鏈分子。反義核酸的利用例如見Marcus-Sekura，C.J的報道(Anal.Biochem.172(1988)，S.289-295)。
核酶是具有特異性切割類似于DNA限制性內(nèi)切酶的其它單鏈RNA分子能力的RNA分子。核酶的合成見報道Cech，J.Amer.Med.Assn.260(1988)，S.3030.
根據(jù)本發(fā)明，具有本發(fā)明DNA序列的合適載體可用于在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染病體細胞，或?qū)⒃撦d體先用于體外細胞轉(zhuǎn)染，再將這些轉(zhuǎn)染細胞植入病人體內(nèi)。同樣，可將MP121反義多核苷酸轉(zhuǎn)入不期望MP121表達的細胞。
對MP121活性的壓制已可通過將與MP121相反不引起信號繼續(xù)傳導的分子結(jié)合于MP121受體上來進行。
由此可見，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，細胞的MP121受體也很令人感興趣。為發(fā)現(xiàn)MP121受體，首先通過交聯(lián)實驗，測定不同細胞系對放射性標記的MP121(125J-MP121)的結(jié)合能力。然后，對結(jié)合MP121的細胞，利用表達載體(InVitrogen提供)構(gòu)建cDNA文庫。利用對放射性標記的MP121的結(jié)合能力，篩選出被受體-cDNA轉(zhuǎn)染的細胞。這是本專業(yè)人員已知的方法，如其用于分離激活素受體(Mathews，L.S.&Vale，W.W，Cell 65(1991)，973-982)和TGF-β TypeII受體(Lin，H.Y，等，Cell 68(1992)，775-785)。據(jù)推測MP121受體與已知的激活素受體類似，屬于同一家族的受體復合體，因而也可利用已知的方法簡并的寡核苷酸進行PCR，以發(fā)現(xiàn)異源復合體的部分片段。這一方法也用于激活素及TGF-β TYPE I受體(Tsuchida，等Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90(1993)，11242-11246；Attisano等，Cell，75(1993)，671-680；Franzen等，Cell 75(1993)，681-692).
本發(fā)明的最后一項內(nèi)容是能夠特異結(jié)合本發(fā)明蛋白的抗體或其一個抗體片段(如Fab或Fab’)。生產(chǎn)此種特異性抗體或抗體片段的方法屬于一般專業(yè)常識。優(yōu)選該抗體是一單克隆抗體。此抗體或抗體片段也適用于診斷方法。
此外，本發(fā)明將由以下實施例闡明。例1MP121的分離1.1總RNA是根據(jù)Chirgwin等的方法從(40歲)人的肝組織中提取的(Biochemistry，18，5294-5299(1979)).Poly(A+)-RNA則通過Oligo-(dT)層析從總RNA中分離出來(見產(chǎn)品提供者的方法Stratagene Poly(A)Quick-Column).1.2。反轉(zhuǎn)錄反應如下將1-2.5μg Poly(A)+-RNA 5分鐘加熱至65℃，快速轉(zhuǎn)到冰上冷卻。反應混合物包括27u RNA-Guard(Pharmacia)，2.5μg Oligo(dT)12-18(Pharmacia)，5×緩沖液(250mmol/l Tris/HClpH8.5，50mmol/l MgCl2，50mmol/l DTT，5mmol/l各dNTP，600mmol/LlKCl)，及每μg Poly(A+)-RNA所需的20U AMV反轉(zhuǎn)錄酶(BoehringerMannheim).反應混合物(25μl)在42℃溫育2小時之后，將所得cDNA保存于-20℃。1.3圖2所示的脫氧核苷酸引物OD及OID由全自動DNA合成儀(Biosearch)合成。先通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳、再利用等速電泳將凝膠上的主帶分離，從而將引物純化。通過比較已知TGF-β家族成員的核酸序列且選擇較高的保守區(qū)，以設計寡核苷酸，該保守區(qū)的比較如圖2所示。為了便于克隆，兩個寡核苷酸都有EcoRI酶切位點，并且，引物OD在其5’端還有一個NcoI酶切位點。1.4.PCR反應的起始物是相當于20ng Poly(A+)RNA的cDNA(見1.2)。50μl的反應體積包括1×PCR緩沖液(16.6mmol/l(NH4)2SO4，67 mmol/l Tris/HCl pH 8.8，2mmol/l MgCl2，6.7μmol/l EDTA，10mmol/l β-巰基乙醇，170μg/ml牛血清蛋白(BSA)(Gibco)，200μmol/l各dNTP(Pharmacia)，30pmol各寡核苷酸(OD&OID)及1.5UTaq-聚合酶(Ampli Taq，Perkin Elmer Cetus)。于反應混合物之上加一層石蠟油，然后進行40個循環(huán)的PCR反應。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)過酚/氯仿抽提純化后，用乙醇沉淀濃縮。1.5.PCR反應產(chǎn)物的一半用于SphI(Pharmacia)及AlwNI(Biolabs)酶切反應(根據(jù)公司提供的方法)。另一半則用于AvaI(BRL)、AlwNI(Biolabs)及TfiI(Biolabs)酶切反應。酶切反應體積為100μl(含8U酶)，于37℃溫育2～12小時(TfiI除外，為65℃溫育)進行。1.6.利用瓊脂糖凝膠電泳將酶切產(chǎn)物分離。經(jīng)溴乙錠染色后將未被酶切的擴增片段從凝膠上切出，并經(jīng)酚抽提后分離出來。所得的DNA再經(jīng)過兩次酚/氯仿抽提后純化。1.7.經(jīng)乙醇沉淀后所得的DNA的1/4或1/5重新用以擴增，反應條件與第一次的擴增條件相同，不同的是循環(huán)次數(shù)降至13次，重新擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，用于與上述相同的酶切反應，然后從未被酶切的產(chǎn)物如對于擴增產(chǎn)物所述的一樣瓊脂糖凝膠上分離出來，再用于重復擴增。1.8將從凝膠上最后分離出的擴增產(chǎn)物用5U EcoRI(Pharmacia)酶切(反應條件根據(jù)酶提供者所述)。酶切混合物的1/4用于與EcoRI切割的pBluescript Sk+(Stratagene)載體連接。連接后各酶復合物的24個克隆作序列分析。AlwNI和SphI酶切片段只具有BMP6及抑制素βA序列、而不含任何新的序列。在AvaI、AlwNI及TfiI的酶切片段中，發(fā)現(xiàn)了19個相同的新序列并被命名為MP121。這些質(zhì)粒被命名為pSK-MP121(OD/OID)。其中的一個序列與發(fā)現(xiàn)的主要序列在兩個核苷酸上有所不同。連接反應及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化是根據(jù)Sambrook等的方法(MolecularCloningA Laboratory Manual(1989))。
根據(jù)Frohmann(見Perkin-ELmer Corp出版的Amplifications，5，11-15(1990))的方法，得到了cDNA克隆的3’端序列，從而具備了全長的cDNA克隆。用于分離第一MP121片段的肝mRNA如上所述在使用連接有銜接頭引物的Oligo dT(16mer)(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC-T16)的情況下反轉(zhuǎn)錄。擴增反應所用的銜接頭引物是(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)及根據(jù)MP121序列所合成的一內(nèi)部引物(GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA)。擴增產(chǎn)物又重新用于擴增反應，所用引物為銜接頭引物及另一根據(jù)MP121制備的內(nèi)部引物(ACATAGCAGGC ATGCCTGGTATTG)。重新擴增產(chǎn)物經(jīng)SphI酶切后，克隆在pT7/T3 U19載體(Pharmacia)的SphI位點并且測定其序列。利用與已知MP121序列的重合部分，對所得克隆進行鑒定。將一個被命名為P121Lt3’MP13的克隆用于分離一個NcoI/SphI片段(NcoI端經(jīng)T4聚合酶處理為鈍端)。該片段被克隆在上面提及的pSK-MP121(OD/OID)載體上，OD-引物序列與pSK的多克隆點的T7引物的方向相對應。所用的載體是經(jīng) SphI/SmaI酶切的。所構(gòu)建的重組基因命名為pMP121DFus6。其含有SEQ ID NO.1所示的第922至1360個核苷酸的MP121序列部分。1.9 pMP121 DFus6中的DdeI片段，即SEQ ID NO.1中第931至1304個核苷酸部分，被用于篩選一個人肝臟的cDNA文庫(Clontech，#HL3006b，Lot 36223)(方法見Ausubel等Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989)出版)。從8.1×105噬菌體中篩選出24個噬菌體區(qū)(Mischplaques)，并分別純化得到了單噬菌體。從中選出經(jīng)PCR反應檢測為陽性的10個克隆，并純化出單噬菌體。PCR所用引物為LO2(ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG)及來自DdeI片段的引物LOI1(CTGCAGCTGTGTTGGCCTTGAGA)。將噬菌體中的cDNA片段經(jīng)EcoRI酶切分離出來，并克隆在用EcoRI裂解的pBluescript SK載體。
對所得質(zhì)粒之一SK121L9.1的序列測定表明。起始密碼始于SEQ IDNO.1中的第128位核苷酸，在該起始密碼之前有三個處在同一閱讀框架的終止碼，分別在第62、77及92個核苷酸處。經(jīng)過與其它TGF-β蛋白的序列同源性比較，MP121成熟蛋白始于SEQ ID NO.1中的第836個核苷酸，即SEQ NO.2中的第237個氨基酸，終止碼始于SEQ ID NO.1的第1184個核苷酸。
質(zhì)粒SK121L9.1(保藏號9177)在1994年4月26日保藏在DSM中。1.10.小鼠中MP121 cDNA及其基因組DNA的分離將人MP121序列信息用于分離小鼠的MP121序列，其中涉及的方法是專業(yè)人員所熟知的方法，見Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel et al；Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，Wiley&Sons，1987-1995)或Molecular Cloning(Sambrooket al，2nd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989).
首先，從人MP121序列合成兩個引物ACGAATTCCGACGAGGCATCGACTGC，及GCGTCGACTACCATGTCAGGTATGTC，在兩個引物的5’端設計了一個酶切點(EcoRI及SalI)。兩個引物用于小鼠基因組DNA的擴增后，將所得的0.35Kb長的片段再克隆在Bluescript(Stratagene)載體上，并用于制備放射性探針，利用該探針按照標準方法篩選小鼠基因組DNA的λ文庫和cDNA文庫。cDNA是由小鼠的肝臟分離出的RNA合成，加上EcoRI/NcoI連接物序列后克隆在λgt10上。
從基因庫及cDNA庫中都分離出了MP121克隆。將含有全長編碼序列的cDNA亞克隆在Bluescript SK(Stratagene)的EcoRI位點，所得質(zhì)粒命名為小鼠SKMP121并于1995年5月10日保藏在DSM資料庫中(DSM9964)。序列分析所得全序列如SEQ ID NO.3所示。在SEQ ID NO.3序列中起始碼始于第131個核苷酸而終止碼始于第1187個核苷酸。根據(jù)該序列所推出的蛋白序列見SEQ ID NO.4。
來自基因組文庫的含MP121克隆的亞克隆分析表明，MP121前體肽的編碼區(qū)含有一個約5.5kb長的內(nèi)含子。該內(nèi)含子位于SEQ ID NO.3所示序列的第446與447個核苷酸之間。外顯子/內(nèi)含子的交接點如SEQ IDNO.5所示。例2MP121的表達在真核及原核系統(tǒng)中都有可能表達MP121。
只將MP121的成熟蛋白區(qū)段用于原核表達。在純化之后在大腸桿菌中表達的MP121成熟單體，可折疊為雙體。為簡化MP121蛋白的純化過程，在成熟蛋白的N-端可附加6個組氨酸殘基，通過6個組氨酸殘基與Ni螯合物Column層析柱的結(jié)合從而易于蛋白的純化。
例如用原核載體pBP4表達人MP121成熟蛋白區(qū)段(SEQ ID No.2中的第237-352氨基酸)，其N-端共有包括6個組氨酸在內(nèi)的13個附加氨基酸(MHHHHHHKLEFAM)。該載體是pBR322質(zhì)粒的衍生物，并含有抗四環(huán)素基因和來自pBluescriptII SK質(zhì)粒(Stratagene)的T7啟動子。另外，該載體在其T7啟動子之后還有一個核糖體結(jié)合部位和一個起始碼，起始碼之后則是6個組氨酸密碼。終止子(T)位于多個用于插入內(nèi)含子單酶切插入位點如Eco RI，Xho I，Sma I和Apa I及三種閱讀框架的終止碼之后。以質(zhì)粒SK121L9.1(DSM保藏號9177)為模板，經(jīng)PCR反應擴增出MP121成熟蛋白的cDNA，所用引物為GAATTCGCCATGGGCATCGACTGCCAAGGAGG和CCGCTCGAGAAGCTTCAACTGCA CCCACAGGC.兩個寡核苷酸的末端都有附加的酶切位點(分別為Eco RI/Nco I，或xho I/Hin dIII)。將所得的377bp長的片段克隆于pBluescript II SK(Stratagene)的EcoRV位點。將其中一個克隆(MP1215’端指向T7啟動子)經(jīng)EcoRI酶切后所得的0.38kb的片段也克隆于pBP4載體的EcoRI位點。所得質(zhì)粒pBP4MP121His中插入片段的正確走向經(jīng)酶切分析及序列分析之后而得到確定。pBP4MP121His質(zhì)粒于1995年1月30日保藏在DSM資料庫中(保藏號為9704)。
MP121蛋白也可通過利用T7-RNA聚合酶而得到表達?？衫貌煌谋磉_T7-RNA聚合酶的方法，如利用另一個含有T7-RNA聚合酶基因的質(zhì)粒、或編碼T7-RNA聚合酶的噬菌體侵染，或通過一特殊的含有T7-RNA聚合酶整合基因的細菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen，#69451-1)，在IPTG誘導表達T7-RNA聚合酶的情況下，可得到具有組氨酸標記(His-Tag)的MP121成熟蛋白(MP121 His)的包含體。在SDS聚丙稀酰胺(15％)凝膠電泳中，該蛋白的表觀分子量近16KD(理論分子量14.2KD)，如圖3的Western blot所示。用pBP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細菌作為對照，則沒有發(fā)現(xiàn)特異的蛋白條帶。由于該蛋白含有組氨酸標記(His-Tag)，所以，可利用Ni螯合劑-層析柱純化蛋白的方法，如Hochuli等所述(BIO/Technology Vol.6，1321-1325(1988)).通過反相高壓液相色譜法(HPLC)可對蛋白作進一步的純化。利用一反相色譜柱(Nucleosil 300-7C4，Macherey-Nagel，Art715023)，所用色譜條件為流速2毫升/分鐘，溶于0.1％TFA的乙腈，梯度為0～90％，時間100分鐘。在此條件下，MP121His蛋白在乙腈濃度為40％時開始洗脫。
利用MP121特異性抗體，通過Western blot分析以證實上述蛋白為人的MP121蛋白。所用的MP121多克隆抗體來自雞及兔。為得到用于免疫的抗原，將MP121成熟蛋白中的一個區(qū)段(SEQ ID NO.2中第260至352個氨基酸)與MS2一噬菌體聚合酶的前98個氨基酸片段的融合蛋白，在大腸桿菌中得到表達。將分離出的融合蛋白(MS2-MP121)包含體經(jīng)聚丙烯酰胺電泳分離，根據(jù)銅染色法染色之后，從凝膠上沖洗出來并用于免疫(雞或兔)(Tessmer，U.&Dernick，R.，IBL(1990)8-13)。從雞或兔獲得的抗體都能夠檢測出MP121的特異表達。圖3所示的Western blot分析，所用的是來自雞的MP121抗體。該抗體經(jīng)過PEG沉淀(Thalley B.S及Carroll，S.B.BIO/Technology，Vol.8，934-938(1990))及膜結(jié)合抗原(融合蛋白(MS2-MP121))的處理而得到進一步純化方法見Sambrook et al.，Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press1989.18.17頁)。所用的二抗為與堿性磷酸酶(Sigma A9171)相偶連的抗雞免疫球蛋白G(IgG)。利用Tropix Western-Light Protein Detection Kit(Serva#WL10RC)試劑盒，根據(jù)供貨者所提供的方法進行進一步檢測。
為得到具有生物活性的材料，可將在大腸桿菌中表達的MP121單體經(jīng)純化后折疊為雙體。所用方法見Jaenicke，R.和Rudolph，R(ProteinStructure，ed，Creighton，T.E.IRL Press，Chapter9)。
在真核細胞中表達MP121，所用的是牛痘病毒表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)在下述文獻中有詳細報道Cnrrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，Wiley&Sons，Chapter 16，Unit1 6.15～16.18)(以下將該文獻簡稱CP)，本專業(yè)人員可效仿。該系統(tǒng)的主要依據(jù)是，使用特定載體外源DNA可通過同源重組而整合在牛痘病毒的基因組上?；谶@一原理，所用的載體含有牛痘病毒基因組上的TK(胸苷激酶)基因。另外，載體也攜帶有大腸桿菌的花黃素—鳥嘌呤—磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)(Falkner，F(xiàn).G.&Moss，B.，J.of Virol.62(1988)，1849-1854))，旨在篩選重組病毒在該載體中克隆了帶有MP121的整個編碼區(qū)的cDNA。
為縮短質(zhì)粒SK121L9.1(DSM保藏號9177)中5’-端及3’-端的非翻譯區(qū)，并在兩端添加單酶切位點，需要進行一系列的PCR反應及亞克隆步驟。所有PCR反應都是以SK121 L9.1質(zhì)粒(DSM保藏號9177)作為模板。為縮短5’-端的非翻譯區(qū)所用的引物是CCCGGATCCGCTAGCACCATGACCTCCTCATTG CTTCTG(兩端分別有BamHI和NheI酶切位點)，及一內(nèi)部引物(CCCTGTTGTCCTCTAGAAGTG)。將所得的PCR片段克隆在Bluescript SK(Stratagene)上，通過序列分析并與SEQ ID NO.1所示序列的重合部分進行比較，以對所得序列進行確定。為縮短3’端的非翻譯區(qū)所用的模板是質(zhì)粒pBP4M121His中的SphI/EcoRI片段(0.22kb)。
人MP121的兩端片段通過內(nèi)部的酶切位點(XbaI與SphI)與質(zhì)粒SK121L9.1(DSM保藏號9177)中的MP121中的缺少中間DNA序列相連接，標準方法見Sambrook等(Molecular Cloning，2nd editeon，ColdSpring Harbour Laboratory Press，1989)。已被縮短的cDNA仍具有完整的MP121閱讀框架(SEQ ID NO.1中第128-1184個核苷酸)，并作為BamHI和EcoRI片段克隆在經(jīng)BamHI和EcoRI酶切的pBP1載體上。由此所獲得的質(zhì)粒pBP1MP121于1995年1月12日保藏在DSM資料庫中(保藏號9665)。
質(zhì)粒pBP1MP121被用于構(gòu)建重組的牛痘病毒。為此，將懸浮于1毫升PBS緩沖液的野生型牛痘病毒與80％合生的143B細胞(HuTK-，ATCC CRL 8303)在直徑為35mm的培養(yǎng)皿中混合，室溫下中度振蕩30分鐘以實現(xiàn)病毒對細胞的侵染(1病毒/10細胞)。將上清液移去并加入2毫升培養(yǎng)液(MEM，Gibco BRL#041-01095，含稀釋到1/500濃度的青霉素和鏈霉素，Gibco BRL#043-05140)，于37C溫育2小時。最后將培養(yǎng)液除去后，加入100ng pBP1MP121和2μg媒介DNA(超聲波處理的小牛胸腺DNA，Boehringer Manheim#104175)及10μl Lipofektin(GibcoBRL#18292-011)，在1ml MEM中溫育約15小時(37℃)，添加含有20％FCS(Sigma#F-7524)的1ml MEM之后于37℃繼續(xù)溫育24小時，最后將裂解細胞深凍保存。
基于花黃素—鳥嘌呤—磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的gpt篩選，及重組病毒的分離及擴增過程，大致如文獻CP中Unit 16.17所述進行。只是所用的細胞為RK13(ATCC CCL37)。
利用斑點雜交法(見CP.Unit 16.18)以確定MP121 cDNA是否整合在病毒基因組上。經(jīng)pBPMP121轉(zhuǎn)染所獲得的重組病毒與野生型病毒，都被用于分析MP121在細胞系143B(人HuTK-，ATCC CRL 8303)及NIH-3T3(DSM ACC59，瑞士小鼠胚胎)中的表達。根據(jù)細胞系提供者的說明進行細胞培養(yǎng)，用大約3倍于連生細胞數(shù)量的病毒進行細胞侵染(37℃，30分鐘)，然后加入含有10％FCS及青霉素/鏈霉素(1500，GibcoBRL#043-05140)的培養(yǎng)液，并在37℃溫育6小時。除去培養(yǎng)液后的細胞用例如HBSS(Gibco，BRL#14180-046)經(jīng)兩次洗滌后，再加入不含F(xiàn)CS的生產(chǎn)培養(yǎng)液(MEM用于HuTK-細胞系，DMEM+4.5g/l葡萄糖+NEAA(Gibco，BRL#11140-035)用于NIH-3T3細胞系；分別加入Aprotinin(Fluka#10820，50U/ml)和青霉素/鏈霉素)。經(jīng)20至22小時培養(yǎng)之后收集培養(yǎng)細胞的上清液，利用Western blots分析表達水平(標準方法見CP，Unit 10.8)。在1～3毫升的細胞培養(yǎng)液的上清液中，加入等體積的丙酮并在冰上溫育至少一小時之后蛋白質(zhì)沉淀并進行離心。將所得沉淀懸浮于電泳上樣液之中，并用于15％聚丙烯酰胺凝膠電泳(上樣液7M尿素，1％SDS，7mM NaH2PO4，0.01％溴酚藍，及任選1％ β-巰基乙醇)。所用的標記蛋白為預染色的蛋白分子量標準物(Gibco BRL#6041-020)。蛋白轉(zhuǎn)膜(PVDF膜Immobilon#IPVH 00010)及封膜過程與標準方法相同。
從(圖3)Western blot筒圖可以看出，經(jīng)重組病毒侵染的細胞顯示有特異性的MPl21條帶。NIH-3T3細胞中表達的MP121為分泌蛋白，該蛋白在非還原條件下電泳后顯示分子量約為18KD(預期的理論分子量為25KD)。該蛋白在還原性電泳中顯示的分子量為15 KD(期望的理論分子量為12.5 KD)。該結(jié)果表明，MP121正如所期望的是作為成熟蛋白的雙體得到表達。MP121蛋白雙體比單體MP121移動相對稍慢一些，這很可能是由于球狀結(jié)構(gòu)的形成，在HTuK-細胞中，也發(fā)現(xiàn)前體蛋白被加工為成熟蛋白。經(jīng)野生型病毒(不含外源DNA)侵染的細胞(HuTK-或NIH-3T3)在Western blot沒有顯示條帶。
牛痘表達系統(tǒng)適用于利用重組牛痘病毒進行共轉(zhuǎn)化，尤其是宜于不同TGF-β蛋白的異源雙體蛋白的形成。利用含有一種TGF-β蛋白單體特異性抗體的親合柱，有可能將異源雙體與同源雙體分開。其中抑制素的α-以及βA-βB鏈尤其令人感興趣。例3小鼠不同組織中MP121表達的研究從6周齡小鼠的不同組織(腦、心臟、腎、肝、肺、脾、肌肉、卵巢、睪丸)及胚胎干細胞中依照標準方法提取總RNA。按產(chǎn)家說明用10μg總RNA進行核糖核酸酶保護實驗(RPA)(Ambion RPAII Kit，#1410)。為獲得激活素βA及βB的特異性探針，利用特異性引物，對與成熟蛋白相對應的小鼠(129SV)基因組DNA進行擴增。為使擴增片段易于克隆，引物的末端各引入了EcoRI及/或BamHI或HindIII酶切位點。擴增激活素βA的引物序列來自鼠的mRNA序列(GenBank Accession#M 37482)GGATCCGAATTCGGCTTGGAGTGTGATGGCAAGG和GGATCCGAATTCCTCTG GGACCTGGCAACTCTAG。
擴增激活素βB所用的簡并引物則來自人的序列(Mason et al，Molecular Endocrinology 3，1352-1358(1989))GAGAATTCCA(GA)CA(GA)TT(TC)TT(CT)AT和GCAAGCTTT(GA)TA(TC)T C(GA)TC(GA)TC。獲得的PCR片段亞克隆于載體pGEM-4(Promega)上并對其進行鑒定。RPA測驗所保護的激活素特異性序列片段，激活素βA為369bp而激活素βB為254bp。MP121的保護片段為SEQ ID NO.3序列中的第887-1164個核苷酸?？寺∮趐GEM-4中的片段用于離體轉(zhuǎn)錄反應，以合成放射性標記的反義RNA探針。根據(jù)供貨者(Promega，Riboprobe Gemini Systems)所提供反應條件，使用100μM CTP和α32P-CTP(800Ci/mmol，Amersham)。同樣，用DdcI切開的線狀質(zhì)粒pTri-GAPDH(Ambion#7431)所合成的放射性標記RNA(CTP濃度為1mM)，用以作為對照。將4個反義RNA探針從聚丙烯酰胺凝膠上分離出來，并分別用于與小鼠相應組織的RNA(10μg總RNA/1×105cpm探針)混合，在42℃溫育過夜。根據(jù)標準方法進行變性凝膠電泳及放射性自顯影(4天)。例4MP121的部分純化及部分純化的MP121的活性研究在牛痘表達系統(tǒng)(見例2)所獲得的MP121蛋白，可以通過兩種層析柱而得到部分純化。
MP121生產(chǎn)過程如下連生的NIH-3T3細胞(DSM ACC59，瑞士小鼠胚胎)與同樣數(shù)量的重組病毒混合，于37℃溫育30分鐘以完成侵染過程，然后，添加含有10％FCS及青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)液。
在37℃培養(yǎng)4小時之后，除去培養(yǎng)液將細胞洗滌兩次，加入設有FCS的生產(chǎn)培養(yǎng)液(見例2)。繼續(xù)培養(yǎng)20-22小時之后。收集上清液并進行離心(40000×g，30分鐘，4℃)，然后對上清液再進行過濾以除去病毒(過濾網(wǎng)0.1μm孔徑，MillexVV，Milliporc#SLVV25LS)。利用野生型牛痘病毒侵染所得的細胞，按以上方法獲得對照上清液(Wt)。根據(jù)Western blot分析，MP121的表達量估計為50～100μg/l。
在1.1升含有MP121的細胞上清液中，分別加入蛋白酶抑制劑PMSF(1μm)，(NH4)2SO4(終濃度為1M)，Tris-pH8.0(終濃度為20mM)，將該樣品加到經(jīng)緩沖液A(1M(NH4)2SO4，20mM Tris-pH 8.0)平衡的苯基瓊脂糖柱(體積為5毫升(FastFlow(high sub)Pharmacia#17-0973-05)，利用15倍于柱體積的緩沖液A及10倍于柱體積的緩沖液B(20mM Tris.DH8.0)沖洗并用線性梯度從100％緩沖液C(20mM Tris pH8.0，80％乙二醇)洗脫，流速為1毫升/分鐘，洗脫50分鐘(每個餾分5ml)。Western blot分析表明，MP121蛋白在乙二醇濃度為50～80％時被洗脫出來。將蛋白組分的一部分經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(濃度15％)電泳，根據(jù)銀染色法(SilverStain-II，Daiichi#SE140000)確定含有MP121的組分并將其集中起來。純化對照上清液所得的相應組分，經(jīng)銀染色法分析之后，也被集中起來。
收集的MP121蛋白組分，通過反相高壓液相色譜(HPLC)進一步純化。先用緩沖液A(0.1％三氟乙酸的水溶液)平衡C8色譜柱(Aquapore RP300，Applied Biosystems，顆粒直徑7μm，孔徑300A°)。將上述收集的含MP121蛋白的組分加到色譜柱上之后，先用緩沖液A充分洗滌色譜柱。再用每分鐘1.5％緩沖液B(90％乙腈，0.1％三氟乙酸)的線性梯度以0.2ml/分鐘的流速將結(jié)合蛋白洗脫下來。將所收集的不同組分(體積600μl)用于Western blot及根據(jù)銀染色法所進行的凝膠電泳分析。MP121蛋白在乙腈濃度為55％時開始洗脫。將含MP121蛋白的組分集中起來，并且上清液的純化過程中的相應組分也被集中。經(jīng)銀染色的凝膠電泳分析表明，MP121蛋白組分中仍混有其它蛋白。為獲得純化的MP121，需要進一步的純化步驟。
可用專業(yè)人員所熟悉的純化方法作進一步純化，如使用凝膠篩柱，離子交換柱，親和柱或金屬螯合柱。根據(jù)Western blot分析結(jié)果估計，從1升細胞培養(yǎng)的上清液中可分離出約8克部分純化的MP121。部分純化的蛋白經(jīng)冷凍干燥后保存于-80℃。
為證實MP121對多巴胺神經(jīng)元的影響，從14天齡的大鼠胚胎(E14)的中腦區(qū)分離神經(jīng)元(方法見Shimoda等Brain Res.586，319-331(1992))。根據(jù)Krieglstein等(Neuroscience 63，1189-1196(1994))所述方法，進行神經(jīng)單細胞的分離及培養(yǎng)。在涂有多鳥氨酸/昆布氨酸的載玻片上，設計細胞密度為 200000細胞/厘米2。經(jīng)24小時培養(yǎng)之后，每隔三天將2/3的培養(yǎng)液(500μl)移去并添加同樣量的新鮮培養(yǎng)液及所需的其它成分。將苯基瓊脂糖柱及反相高壓液相色譜(HPLC)純化及冷凍干燥后部分純化的MP121蛋白溶于50％乙腈中，加入細胞培養(yǎng)液。MP121在培養(yǎng)液中的終濃度為20ng/ml(乙腈的終濃度為0.3％)。將同樣量的純化的對照上清液(wt)樣品溶于50％乙腈中并加入對照培養(yǎng)液中，其中乙腈的終濃度也為0.3％。經(jīng)8天培養(yǎng)后，用4％多聚甲醛在室溫下對所得培養(yǎng)物進行固定，經(jīng)丙酮滲透處理后(10分鐘，-20℃)再用PBS(磷酸緩沖的鹽溶液)沖洗，經(jīng)1％H2O2(溶于PBS)處理，并用馬血清沖洗、封閉處理之后，進行免疫組織化學染色。酪氨酸羥化酶(TH)是多巴胺及其它兒茶酚胺生物合成過程中的特定酶，所以TH可作為上述神經(jīng)元細胞培養(yǎng)的標記(含去甲腎上腺素的細胞不被分離)。用抗大鼠TH的小鼠單克隆抗體(稀釋1∶200，BoehringerMannheim)，經(jīng)37℃，1小時溫育處理后，再用試劑盒(Vectastain ABC KitVecto Labs)進行進一步檢測。從0.12cm2面積內(nèi)統(tǒng)計TH-陽性細胞的數(shù)量。從圖5可明顯看出，MP121對多巴胺神經(jīng)元的生長具有正面影響。
圖5表示從大鼠胚胎(E14)中腦分離的神經(jīng)元，經(jīng)8天培養(yǎng)后TH免疫反應呈陽性的多巴胺神經(jīng)元的存活數(shù)量。部分純化的MP121(濃度20ng/ml)、等量的對照上清液產(chǎn)物(wt)的處理效果及未經(jīng)處理的神經(jīng)元(對照含有0.3％乙腈培養(yǎng)液)。所示值為三次重復取樣的平均值±平均標準誤差。圖3-5的詳細說明圖3利用抗MP121的雞抗體所進行的Western blot簡圖。1在還原條件下(1％β-巰基乙醇)經(jīng)pBP4MP121His轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。2在還原條件下(1％β-巰基乙醇)經(jīng)重組病毒(含有插入的MP121 cDNA)侵染的NIH-3T3細胞的培養(yǎng)上清液。3在非還原條件下經(jīng)重組病毒(含有插入的MP121 cDNA)侵染的NIH-3T3細胞的培養(yǎng)上清液。M預染的蛋白分子量標記(標明主要蛋白條帶的表觀分子量)(Gibco BRL#26041-020)。圖4核糖核酸酶保護實驗的凝膠分析的放射自顯影圖譜。所用的特異性探針為激活素βA(βA)-、激活素βB(βB)-、MP121-及作為對照的GAPDH-探針。所用的總RNA是來自不同的小鼠組織(1大腦，2心臟，3腎，4肝，5肺，6肌肉，9卵巢，10脾，11睪丸)，來自胚干細胞(12CJ7)和作為對照的酵母(泳道13)。樣品14不含RNA以作為對照。8和15表示雜交中的未被保護的反義RNA樣品右側(cè)的括號內(nèi)標明了期望的未被保護的片段長度；被保護的片段長度則在左側(cè)標明。樣品7是作為分子量標記的經(jīng)MspI酶切及γ-32P-ATP(Amersham)末端標記的pBR322質(zhì)粒。圖5表示經(jīng)8天培養(yǎng)后存活的具有TH-免疫反應的大鼠胚胎(E14)中腦的多巴胺神經(jīng)元數(shù)目。所測效果來自以下不同處理部分純化的MP121(濃度為20ng/ml)、等量的部分純化的對照上清液(wt)及未經(jīng)處理的神經(jīng)元(對照含有0.3％乙腈的培養(yǎng)液)，所示值為三次重復取樣的平均值±平均標準誤差。
序列說明(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Biopharm Gesellschaft zur blotechnologlscnenEntwicklung von Pharmaka mhH(B)街號Czernyring 22(C)地點Heidelberg(E)國家Germany(F)郵編69115(ii)發(fā)明名稱新的TGF一β家族的生長/分化因子(iii)序列數(shù)6(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPA)(v)申請信息申請?zhí)朩O PCT/EP95/02552(2)SEQ ID NO1說明(i)序列特征(A)長度2272 BP(B)種類核苷酸(C)鏈狀雙鏈(D)拓撲線狀(vi)原始來源(A)有機體Homo sapiens(xi)序列說明SEQ ID NO1CAAGGAGCCA TGCCAGCTGG ACACACACTT CTTCCAGGGC CTCTGGCAGC CAGGACAGAG 60TTGAGACCAC AGCTGTTGAG ACCCTGAGCC CTGAGTCTGT ATTGCTCAAG AAGGGCCTTC 120CCCAGCAATG ACCTCCTCAT TGCTTCTGGC CTTTCTCCTC CTGGCTCCAA CCACAGTGGC 180CACTCCCAGA GCTGGCGGTC AGTGTCCAGC ATGTGGGGGG CCCACCTTGG AACTGGAGAG 240CCAGCGGGAG CTGCTTCTTG ATCTGGCCAA GAGAAGCATC TTGGACAAGC TGCACCTCAC 300CCAGCGCCCA ACACTGAACC GCCCTGTGTC CAGAGCTGCT TTGAGGACTG CACTGCAGCA 360CCTCCACGGG GTCCCACAGG GGGCACTTCT AGAGGACAAC AGGGAACAGG AATGTGAAAT 420CATCAGCTTT GCTGAGACAG GCCTCTCCAC CATCAACCAG ACTCGTCTTG ATTTTCACTT 480CTCCTCTGAT AGAACTGCTG GTGACAGGGA GGTCCAGCAG GCCAGTCTCA TGTTCTTTGT 540CCAGCTCCCT TCCAATACCA CTTGGACCTT GAAAGTGAGA GTCCTTGTGC TGGGTCCACA 600TAATACCAAC CTCACCTTGG CTACTCAGTA CCTGCTGGAG GTGGATGCCA GTGGCTGGCA 660TCAACTCCCC CTAGGGCCTG AAGCTCAAGC TGCCTGCAGC CAGGGGCACC TGACCCTGGA 720GCTGGTACTT GAAGGCCAGG TAGCCCAGAG CTCAGTCATC CTGGGTGGAG CTGCCCATAG 780GCCTTTTGTG GCAGCCCGGG TGAGAGTTGG GGGCAAACAC CAGATTCACC GACGAGGCAT 840CGACTGCCAA GGAGGGTCCA GGATGTGCTG TCGACAAGAG TTTTTTGTGG ACTTCCGTGA 900GATTGGCTGG CACGACTGGA TCATCCAGCC TGAGGGCTAC GCCATGAACT TCTGCATAGG 960GCAGTGCCCA CTACACATAG CAGGCATGCC TGGTATTGCT GCCTCCTTTC ACACTGCAGT1020GCTCAATCTT CTCAAGGCCA ACACAGCTGC AGGCACCACT GGAGGGGGCT CATGCTGTGT1080ACCCACGGCC CGGCGCCCCC TGTCTCTGCT CTATTATGAC AGGGACAGCA ACATTGTCAA1140GACTGACATA CCTGACATGG TAGTAGAGGC CTGTGGGTGC AGTTAGTCTA TGTGTGGTAT1200GGGCAGCCCA AGGTTGCATG GGAAAACACG CCCCTACAGA AGTGCACTTC CTTGAGAGGA1260GGGAATGACC TCATTCTCTG TCCAGAATGT GGACTCCCTC TTCCTGAGCA TCTTATGGAA1320ATTACCCCAC CTTTGACTTG AAGAAACCTT CATCTAAAGC AAGTCACTGT GCCATCTTCC1380TGACCACTAC CCTCTTTCCT AGGGCATAGT CCATCCCGCT AGTCCATCCC GCTAGCCCCA1440CTCCAGGGAC TCAGACCCAT CTCCAACCAT GAGCAATGCC ATCTGGTTCC CAGGCAAAGA1500CACCCTTAGC TCACCTTTAA TAGACCCCAT AACCCACTAT GCCTTCCTGT CCTTTCTACT1560CAATGGTCCC CACTCCAAGA TGAGTTGACA CAACCCCTTC CCCCAATTTT TGTGGATCTC1620CAGAGAGGCC CTTCTTTGGA TTCACCAAAG TTTAGATCAC TGCTGCCCAA AATAGAGGCT1680TACCTACCCC CCTCTTTGTT GTGAGCCCCT GTCCTTCTTA GTTGTCCAGG TGAACTACTA1740AAGCTCTCTT TGCATACCTT CATCCATTTT TTGTCCTTCT CTGCCTTTCT CTATGCCCTT1800AAGGGGTGAA TTGCCTGAGC TCTATCACCT GAGCTCCCCT GCCCTCTGGC TTCGTGCTGA1870GGTCAGGGCA TTTCTTATCC CTGTTCCCTC TCTGTCTAGG TGTCATGGTT CTGTGTAACT1920GTGGCTATTC TGTGTCCCTA CACTACCTGG CTACCCCCTT CCATGGCCCC AGCTCTGCCT1980ACATTCTGAT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TGAAAAGTTA AAAATTCCTT AATTTTTTAT2040TCCTGGTACC ACTACCACAA TTTACAGGGC AATATACCTG ATGTAATGAA AAGAAAAAGA2100AAAAGACAAA GCTACAACAG ATAAAAGACC TCAGGAATGT ACATCTAATT GACACTACAT2160TGCATTAATC AATAGCTGCA CTTTTTGCAA ACTGTGGCTA TGACAGTCCT GAACAAGAAG2220GGTTTCCTGT TTAAGCTGCA GTAACTTTTC TGACTATGGA TCATCGTTCC TT2272(2)對SEQ ID NO2的說明(i)序列特征(A)長度352氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈狀(D)拓撲線狀(ii)分子種類肽
(vi)原始來源(A)有機體Homo sapiens(xi)序列說明SEQ ID NO2Met Thr Ser Ser Leu Leu Leu Ala Phe Leu Leu Leu Ala Pro Thr Thr1 510 15Val Ala Thr Pro Arg Ala Gly Gly Gln Cys Pro Ala Cys Gly Gly Pro20 25 30Thr Leu Glu Leu Glu Ser Gln Arg Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Lys35 40 45Arg Ser Ile Leu Asp Lys Leu His Leu Thr Gln Arg Pro Thr Leu Asn50 55 60Arg Pro Val Ser Arg Ala Ala Leu Arg Thr Ala Leu Gln His Leu His65 70 75 80Gly Val Pro Gln Gly Ala Leu Leu Glu Asp Asn Arg Glu Gln Glu Cys85 90 95Glu Ile Ile Ser Phe Ala Glu Thr Gly Leu Ser Thr Ile Asn Gln Thr100 105 110Arg Leu Asp Phe His Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ala Gly Asp Arg Glu115 120 125Val Gln Gln Ala Ser Leu Met Phe Phe Val Gln Leu Pro Ser Asn Thr130 135 140Thr Trp Thr Leu Lys Val Arg Val Leu Val Leu Gly Pro His Asn Thr145 150 155 160Ash Leu Thr Leu Alg Thr Gln Tyr Leu Leu Glu Val Asp Ala Ger Gly165 170 175Trp His Gln Leu Pro Leu Gly Pro Glu Ala Gln Ala Ala Cys Ser Gln180 185 190Gly His Leu Thr Leu Glu Leu Val Leu Glu Gly Gln Val Ala Gln Ser195 200 205Ser Val Ile Leu Gly Gly Ala Ala His Arg Pro Phe Val Ala Ala Arg210 215 220Val Arg Val Gly Gly Lys His Gln Ile His Arg Arg Gly Ile Asp Cys225 230 235 240Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe Phe Val Asp Phe245 250 255Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro Glu Gly Tyr Ala260 265 270Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile Ala Gly Met Pro275 280 285Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn Leu Leu Lys Ala
290 295 300Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys Cys Val Pro Thr305 310 315 320Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg Asp Ser Asn Ile325 330 335Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Ser340 345 350(2)對SEQ ID NO3的說明(i)序列特征(A)長度1558 BP(B)種類核苷酸(C)鏈狀雙鏈(D)拓撲線狀(vi)原始來源(A)有機體小鼠(xi)序列說明SEQ ID NO3AAGGAGTCAT GCCAGTCGGA GGTCAGTCAC ATTCCTCCCA GGGTCCCTGG TGCCCAGGAC 60AGAGTTGAAG CACTCCCGTT GAGACCCTGA ATATAGGCTT TGGGTCCTTT AAGGAGGCTA 120TCCTCCAGCA ATGGCCTCCT CCTTGCTCCT GGCTCTTCTG TTCCTGACTC CAACCACAGT 180AGTGAACCCC AAAACTGAGG GTCCATGCCC AGCATGTTGG GGTGCCATCT TTGACCTGGA 240GAGCCAGCGG GAGCTGCTTC TCGATTTGGC CAAGAAAAGT ATCCTGGACA AGCTGCACCT 300CAGCCAGCGC CCCATACTCA GTCGGCCAGT GTCCAGAGGG GCTCTCAAGA CCGCGCTGCA 360GCGCCTCCGC GGGCCTCGAC GGGAAACCCT GTTGGAGCAT GACCAGAGAC AAGAAAGATA 420TGAGATCATC AGCTTTGCTG ACACAGACCT CTCCAGCATC AACCAGACCC GGCTCGAGTT 480CCACTTCTCT GGTAGAATGG CCAGTGGCAT GGAGGTCCGG CAGACCCGCT TCATGTTCTT 540CGTGCAGTTC CCCCACAATG CCACCCAGAC CATGAATATA AGAGTTCTTG TGCTAAGACC 600ATATGACACC AACCTCACCT TGACAAGTCA GTACGTGGTG CAGGTGAATG CCAGTGGCTG 660GTACCAGCTT CTCCTGGGAC CTGAAGCTCA AGCTGCTTGC AGCCAGGGAC ACCTTACTCT 720GGAGCTGGTA CCAGAAAGCC AGGTGGCCCA CAGTTCCTTG ATCCTGGGCT GGTTTTCCCA 780CAGGCCTTTT GTGGCAGCCC AGGTAAGGGT TGAGGGCAAG CATCGGGTTC GCCGGCGAGG 840TATCGATTGC CAGGGGGGGT CCAGGATGTG CTGTCGACAA GAGTTTTTTG TAGACTTCCG 900TGAGATTGGC TGGAATGACT GGATCATCCA GCCTGAAGGC TATGCCATGA ACTTCTGCAC 960TGGGCAGTGC CCACTACATG TGGCAGGCAT GCCTGGCATC TCTGCCTCCT TTCACACTGC1020AGTGCTGAAT CTGCTCAAAG CCAACGCAGC TGCTGGCACC ACTGGCAGGG GCTCGTGCTG1080CGTGCCTACA TCTCGGCGCC CTCTGTCTTT GCTCTACTAT GACAGGGACA GCAACATTGT1140CAAGACGGAT ATACCTGACA TGGTGGTCGA GGCCTGCGGG TGTAGTTAGC TTATGGGTGA 1200TACAGGCTGC CTGAGGTAGA ATGGCCTTCC TCAGGAAGGG AAACTCTGTT CCCACTTCTG 1260TCCAGAATGG AAACACCTTT CTAAGCATGC AGACATCCCT CTGTGGACTT CAGGGGATCC 1320ACCTCTAAAG AGAGTCACTA GTGACCAACA GCCTTTCTCT CTCCTGGGAC ATGGTTGACC 1380CAGTACACCC ATCCTCAGCC TTAAGTTAGA GGCTAATCGA CTCCTACATA TATATGTCAT 1440TTTGTCCTAG CAAACACCCC TTAGCTCCCC TTAGTCAACT ATGTAATCTA CTCTGCCTCC 1500CTGACCCTGC CACCGGAAGG TTCCTATTCC ACGATGATAT GCCTTAGTGT CTCCCCTT 1558(2)對SEQ ID NO4的說明(i)序列特征(A)長度352氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈狀(D)拓撲線狀(ii)分子種類肽(vi)原始來源(A)有機體小鼠(xi)序列說明SEQ ID NO4Met Ala Ser Ser Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu Thr Pro Thr Thr1 510 15Val Val Asn Pro Lys Thr Glu Gly Pro Cys Pro Ala Cys Trp Gly Ala20 25 30Ile Phe Asp Leu Glu Ser Gln Arg Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Lys35 40 45Lys Ser Ile Leu Asp Lys Leu His Leu Ser Gln Arg Pro Ile Leu Ser50 55 60Arg Pro Val Ser Arg Gly Ala Leu Lys Thr Ala Leu Gln Arg Leu Arg65 70 75 80Gly Pro Arg Arg Glu Thr Leu Leu Glu His Asp Gln Arg Gln Glu Glu85 90 95TyrGlu Ile Ile Ser Phe Ala Asp Thr Asp Leu Ser Ser Ile Asn Gln100 105 110Thr Arg Leu Glu Phe His Phe Ser Gly Arg Met Ala Ser Gly Met Glu115 120 125Val Arg Gln Thr Arg Phe Met Phe Phe Val Gln Phe Pro His Asn Ala130 135 140Thr Gln Thr Met Asn Ile Arg Val Leu Val Leu Arg Pro Tyr Asp Thr145 150 155 160Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gln Tyr Val Val Gln Val Asn Ala Ser Gly165 170 175Trp Tyr Gln Leu Leu Leu Gly Pro Glu Ala Gln Ala Ala Cys Ser Gln180 185 190Gly His Leu Thr Leu Glu Leu Val Pro Glu Ser Gln Val Ala His Ser195 200 205Ser Leu Ile Leu Gly Trp Phe Ser His Arg Pro Phe ValAla Ala Gln210 215 220Val Arg Val Glu Gly Lys His Arg Val Arg Arg Arg Gly Ile Asp Cys225 230 235 240Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe Phe Val Asp Phe245 250 255Arg Glu Ile Gly Trp Ash Asp Trp Ile Ile Gln Pro Glu Gly Tyr Ala260 265 270Met Ash Phe Cys Thr Gly Gln Cys Pro Leu His Val Ala Gly Met Pro275 280 285Gly Ile Ser Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Ash Leu Leu Lys Ala290 295 300Asn Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Arg Gly Ser Cys Cys Val Pro Thr305 310 315 320Ser Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg Asp Ser Asn Ile325 330 335Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Ser340 345 350(2)對SEQ ID NO5的說明(i)序列特征(A)長度18bp(B)種類核苷酸(C)鏈狀雙鏈(D)拓撲線狀(vi)原始來源(A)有機體Homo sapiens(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置1..3(ix)特征(A)名稱/鍵內(nèi)含子(B)位置4..18(xi)序列說明SEQ ID NO5CAGGTAGGTC CATGGTCG 18(2)對SEQ ID NO6的說明(i)序列特征(A)長度18bp(B)種類核苷酸(C)鏈狀雙鏈(D)拓撲線狀
(vi)原始來源(A)有機體Homo sapiens(ix)特征(A)名稱/鍵內(nèi)含子(B)位置1.15(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)位置16..18(xi)序列說明SEQ ID NO6CTTGATTTTT AACAGACC 18
權利要求
1，編碼一個TGF-β家族蛋白的DNA分子，它包含(a)編碼成熟蛋白區(qū)段及任選地SEQ ID NO.1中標明的核苷酸序列的其它功能區(qū)段(b)由序列(a)根據(jù)遺傳密碼的簡并而得到的核酸序列之一(c)一種對應于序列(a)和(b)之一的等位衍生物的核苷酸序列(d)基于其源自其它脊椎動物而與序列(a)不同的序列之一(e)與(a)、(b)、(c)、或(d)的序列之一雜交的核苷酸序列并且前提是根據(jù)(d)的DNA分子至少要含有完整的TGF-β家族的成熟蛋白的編碼區(qū)。
2，根據(jù)權利要求1所述的DNA分子其特征為除含有權利要求1(a)至(e)的區(qū)段之一之外，還含有編碼其它蛋白的至少一部分的核苷酸序列，并且其設計序列的表達可導致融合蛋白的形成。
3，載體其特征為它至少含有權利要求1或2的DNA分子的一個拷貝。
4，寄主細胞其特征為它是利用權利要求1或2中DNA或權利要求3中的載體所轉(zhuǎn)化的。
5，權利要求4中的寄主細胞其特征為它是細菌、真菌、植物或動物細胞。
6，權利要求1或2中DNA序列所編碼的TGF-β家族的蛋白。
7，權利要求6中的蛋白其特征為它具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4中顯示的氨基酸序列或任選地其功能區(qū)段。
8，嵌合蛋白其特征為它含有權利要求6或7中的蛋白并且至少含有其它蛋白的部分區(qū)段。
9，異源雙體蛋白其特征為它由權利要求6、7或8中的蛋白單體及其它具有“半胱氨酸結(jié)”的超家族蛋白單體構(gòu)成。
10，權利要求6至8中任一項的蛋白的生產(chǎn)方法其特征為培養(yǎng)權利要求4或5中的寄主細胞及從細胞或/和培養(yǎng)的上清液中獲得蛋白。
11，根據(jù)權利要求9的異源雙體蛋白的生產(chǎn)方法其特征為進行兩種單體在同一寄主細胞的共表達。
12，權利要求9的異源雙體蛋白的生產(chǎn)方法其特征為使兩種單體的包含體共同復性。
13，藥物組合物其特征為它至少含有權利要求6至9中一項的一種蛋白作為有效成分、任選地含有制藥常用載體、助劑、稀釋劑或填充劑。
14，根據(jù)權利要求13的藥物組合物用于治療或預防骨\軟骨\結(jié)締組織\皮膚、黏膜、內(nèi)皮組織、上皮組織、神經(jīng)、大腦、腎或牙齒的損傷；及用于牙齒植入、創(chuàng)傷愈合及組織再生過程；作為促進細胞分裂素用于誘導肝組織生長、誘導骨髓細胞或前體細胞的增生；用于保持分化狀態(tài)及治療不育癥及用于避孕，或用于治療物質(zhì)交換方面的疾病。
15，反義RNA其特征為其與權利要求1的DNA分子的一部分互補。
16，核酶其特征為它能夠?qū)嗬?的DNA分子的轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子進行特異切割
17，權利要求15中的反義RNA或權利要求16中的核酶用以阻斷權利要求6和7中任一項的蛋白的表達的應用。
18，權利要求1或2中的DNA序列或權利要求3中的載體用以對病體細胞進行體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染的應用。
19，抗體或抗體片段其特征為其結(jié)合權利要求6至9中任一項的一種蛋白。
20，受體其特征為其上特異地結(jié)合權利要求6及7中任一項的一種蛋白。
全文摘要
本發(fā)明包括TGF-β家族的一種蛋白、其編碼DNA及含有該蛋白的一種醫(yī)藥組合物。
文檔編號A61P3/00GK1151758SQ95193816
公開日1997年6月11日 申請日期1995年6月30日 優(yōu)先權日1994年7月1日
發(fā)明者G·霍藤, H·奈德哈特, R·貝克托爾德, J·波爾 申請人:藥物生物技術發(fā)展公司