專利名稱：鑒定用于分化定型內(nèi)胚層的因子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學和細胞生物學領域，尤其涉及鑒定可用于分化定型內(nèi)胚層細胞為其它細胞類型的因子。
背景技術：
人多能性干細胞(pluripotent stem cell)，如胚胎干細胞(ES)和胚胎生殖細胞(EG)，于1994年首先從無成纖維細胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Bongso et al.，1994)，1997年從含成纖維細胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Hogan，1997)。隨后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有絲分裂失活的小鼠飼養(yǎng)層連續(xù)培養(yǎng)人ES和EG細胞的方法(Reubinoffet al.，2000；Shamblott et al.，1998；Thomson et al.，1998)。
人ES和EG細胞(hESC)為研究人類早期發(fā)育和為治療性干預一些疾病狀態(tài)(如糖尿病和帕金森氏癥)提供了極難得的機會。例如，在采用細胞療法治療糖尿病的過程中，使用衍生自hSEC的產(chǎn)生胰島素的β細胞會比目前利用來自供者胰腺的細胞治療糖尿病有很大進步。但目前還不知道如何從hSEC得到產(chǎn)生胰島素的β細胞。因此，目前利用來自供者胰腺的胰島細胞治療糖尿病的細胞療法受限于缺乏移植所需的高質(zhì)量胰島細胞。對單一I型糖尿病人的細胞治療需要移植大約8×108胰島細胞(Shapiro et al.，2000；Shapiro et al.，2001a；Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰島細胞至少需要兩個健康供者的器官提供。而人胚胎干細胞為開發(fā)用于人類細胞治療的大量的高質(zhì)量分化細胞提供了起始材料的來源。
多能性和能夠維持hSEC細胞較長時間培養(yǎng)這兩個性質(zhì)使其特別適合用于細胞治療。多能性是指hESC能夠分化為所有3種主要胚層(內(nèi)胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，進而在除胚胎外組織(如胎盤)和生殖細胞外還形成成熟器官的所有體細胞類型的能力。盡管多能性賦予了hSEC特殊的用途，但這個性質(zhì)也給這些細胞及其衍生物的研究和控制帶來挑戰(zhàn)。由于在分化hSEC培養(yǎng)基中會產(chǎn)生大量細胞類型，所以大部分細胞類型產(chǎn)生效率很低。而且，成功評價任一指定細胞類型的產(chǎn)生關鍵取決于定義合適的標志物。高效、定向的分化對hESCs的治療性應用非常重要。
解決上述問題對利用hSEC作為起始材料生產(chǎn)用于細胞治療應用的細胞有利。此外，其還有利于鑒定促進衍生自hESCs的前體細胞分化為用于細胞治療的細胞類型的因子。
發(fā)明概要本發(fā)明的實施方案涉及鑒定一種或多種分化因子的方法，該分化因子可用于分化細胞群中的細胞成為可用于細胞治療的細胞，該細胞群包含PDX1-陽性(表達PDX1的)內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陰性內(nèi)胚層細胞(不顯著表達PDX1的內(nèi)胚層細胞)，如定型內(nèi)胚層細胞。舉例來說，本文所述方法的一些實施方案涉及鑒定能夠促進定型內(nèi)胚層細胞分化為組織和/或器官的前體細胞的因子，這些組織和/或器官包括但不限于胰腺、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱。在一些實施方案中，這些前體細胞是PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞。在其它實施方案中，這些前體細胞是不顯著表達PDX1的內(nèi)胚層細胞。
在本文所述方法的一些實施方案中，定型內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群與候選(測試)分化因子接觸或以其它方法提供候選(測試)分化因子。在優(yōu)選的實施方案中，定型內(nèi)胚層細胞是人定型內(nèi)胚層細胞。在更優(yōu)選的實施方案中，該人定型內(nèi)胚層細胞是可分化成腸管或衍生自腸管的器官的細胞的多潛能細胞。
在本文所述方法的其它實施方案中，PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群與候選(測試)分化因子接觸或以其它方法提供候選(測試)分化因子。在優(yōu)選的實施方案中，PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞。在某些實施方案中，該人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是PDX1-陽性的前腸/中腸內(nèi)胚層細胞。在更優(yōu)選的實施方案中，該人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是PDX1-陽性的前腸內(nèi)胚層細胞。在其它優(yōu)選的實施方案中，該人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是前腸后部的PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞。在特別選的實施方案中，該人PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞是可分化成衍生自腸管前部的細胞、組織或器官的多潛能細胞。
涉及本文所述方法時，候選分化因子可能是已知引起細胞分化的因子或未知引起細胞分化的因子。在某些實施方案中，候選分化因子可以是多肽，例如生長因子。在一些實施方案中，該生長因子包括但不限于FGF10、FGF4、FGF2、Wnt3A或Wnt3B。在其它實施方案中，候選分化因子可以是小分子。在具體實施方案中，該小分子是類視黃醇化合物，如視黃酸。或者，在一些實施方案中，候選分化因子不是類視黃醇，不是前腸分化因子或不是TGFβ超家族的成員。在其它實施方案中，候選分化因子是除類視黃醇化合物、前腸分化因子或TGFβ超家族成員之外的任何分子，如活化素(activin)A和B。在其它實施方案中，候選分化因子是之前未知引起定型內(nèi)胚層細胞分化的因子。
本文所述方法的其它實施方案涉及在眾多濃度下測試候選分化因子。例如，候選分化因子可能只在濃度高于特定閥值時引起定型內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的分化。另外，當以低濃度提供時，候選分化因子可以使細胞分化成第一細胞類型，而當以更高濃度提供時可使同樣細胞分化成第二細胞類型。在一些實施方案中，候選分化因子以約0.1ng/ml至約10mg/ml范圍內(nèi)的一個或多個濃度提供。
在使包含定型內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群接觸或以其它方式提供候選分化因子之前或大約同時，選定并評估至少一種標志物以確定其表達。這一步驟可稱為第一標志物評估步驟。或者，這一步驟可稱為在第一時間點確定標志物的表達。標志物可以是可用于監(jiān)測細胞分化的任何標志物，但是，優(yōu)選的標志物包括但不限于性別決定區(qū)Y-盒17(SOX17)、胰-十二指腸同源框因子-1(PDX1)、白蛋白、肝細胞特異性抗原(HSA)、普洛斯彼羅-相關同源框1(prospero-related homeobox 1，PROX1)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TITF1)、絨毛蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、細胞色素P450 7A(CYP7A)、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)、肝細胞核因子4a(HNF4a)、CXC型趨化因子受體4(CXCR4)、血管性血友病因子(VMF)、血管細胞粘附分子(VACM1)、載脂蛋白A1(APOA1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT2)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖激酶(GLUKO)和人造血表達同源框(humanhematopoietically expressed homeobox，hHEX)和CDX2。
從使包含定型內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群接觸或以其它方式提供候選分化因子算起經(jīng)過足夠的時間后，再次評估至少一個標志物在細胞培養(yǎng)物或細胞群中的表達。這一步驟可稱為第二標志物評估步驟。或者，這一步驟可稱為在第二時間點確定標志物的表達。在優(yōu)選的實施方案中，在第一和第二時間點評估的標志物是相同標志物。
在本文所述方法的一些實施方案中，進一步確定該至少一個標志物在第二時間點的表達與其在第一時間點的表達相比是否增加或減少。該至少一個標志物表達的增加或減少表明該候選分化因子能夠促進定型內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的分化。使包含定型內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群接觸或以其它方式提供候選分化因子與確定該至少一個標志物在第二時間點的表達之間的足夠時間間隔可從短至1小時到長至10天。在一些實施方案中，使包含定型內(nèi)胚層細胞和/或PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群接觸或以其它方式提供候選分化因子之后多次評估該至少一個標志物的表達。在某些實施方案中，用Q-PCR評估標志物的表達。在其它實施方案中，用免疫細胞化學評估標志物的表達。
本發(fā)明的其它實施方案涉及鑒定能夠促進PDX1-陰性定型內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的分化因子的方法。在這些方法中，PDX1-陰性定型內(nèi)胚層細胞接觸候選分化因子，并且確定接觸候選分化因子后PDX1在細胞群中的表達與接觸候選分化因子前PDX1在細胞群中的表達相比是否增加。PDX1在細胞群中的表達增加表明該候選分化因子能夠促進PDX1-陰性定型內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化。在一些實施方案中，用定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)確定PDX1的表達。前述方法的一些實施方案進一步包括確定細胞群接觸候選分化因子前后其中HOXA13和/或HOXC16的表達的步驟。在一些實施方案中，候選分化因子是小分子，例如類視黃醇，如RA。在其它實施方案中，候選分化因子是多肽，例如生長因子，如FGF-10。
本發(fā)明的其它實施方案涉及鑒定能夠促進PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的分化因子的方法。在這些方法中，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞接觸候選分化因子，并且確定接觸候選分化因子后標志物在細胞群中的表達與接觸候選分化因子前該相同標志物在細胞群中的表達是否增加或減少。標志物表達的增加或減少表明該候選分化因子能夠促進PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化。在一些實施方案中，用Q-PCR確定標志物的表達。在一些實施方案中，候選分化因子是小分子，例如類視黃醇，如RA。在其它實施方案中，候選分化因子是多肽，例如生長因子，如FGF-10。
本發(fā)明的其它實施方案涉及用本文所述方法分化的細胞。這些細胞包括但不限于胰、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱的前體細胞。在一些實施方案中，該細胞可能是終末分化的。本文所述的其它實施方案涉及包含上述細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。
一些權(quán)限中，術語“包含”可能不具有任何通常所接受的定義。此處使用的術語“包含”是開放式的，可以包括任何其他元素?？紤]到這一點，本發(fā)明的其他實施方案參考以下編號的段落進行描述1.鑒定能夠促進包含人細胞的細胞群中人定型內(nèi)胚層細胞的分化的分化因子，所述方法包括步驟(a)獲得包含人定型內(nèi)胚層細胞的細胞群；(b)向所述細胞群提供候選分化因子；(c)確定細胞群中標志物在第一時間點的表達；(d)確定所述細胞群中相同標志物在第二時間點的表達，其中所述第二時間點在所述第一時間點之后，并且其中所述第二時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因子之后；以及(e)確定所述細胞群中標志物在所述第二時間點的表達與所述細胞群中該標志物在所述第一時間點的表達相比是否增加或減少，其中所述細胞群中所述標志物表達的增加或減少表明所述候選分化因子能夠促進所述人定型內(nèi)胚層細胞的分化。
2.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞占所述細胞群中人細胞的至少約10％。
3.段落1的方法，其中人飼養(yǎng)細胞存在于所述細胞群中，且其中至少約10％的除了所述飼養(yǎng)細胞以外的人細胞是定型內(nèi)胚層細胞。
4.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞占所述細胞群中人細胞的至少約90％。
5.段落1的方法，其中所述人飼養(yǎng)細胞存在于所述細胞群中，且其中至少約90％的除了所述飼養(yǎng)細胞以外的人細胞是定型內(nèi)胚層細胞。
6.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞響應所述候選分化因子而分化成源自腸管的細胞、組織或器官。
7.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞響應所述候選分化因子而分化成胰前體細胞。
8.段落7的方法，其中所述標志物選自胰-十二指腸同源框因子-1(PDX1)、同源框A13(HOXA13)和同源框C6(HOXC6)。
9.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞響應所述候選分化因子而分化成肝前體細胞。
10.段落9的方法，其中所述標志物選自白蛋白、普洛斯彼羅-相關同源框1(PROX1)和肝細胞特異性抗原(HSA)。
11.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞響應所述候選分化因子而分化成肺前體細胞。
12.段落11的方法，其中所述標志物是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TITF1)。
13.段落1的方法，其中所述人定型內(nèi)胚層細胞響應所述候選分化因子而分化成腸前體細胞。
14.如段落13的方法，其中所述標志物選自絨毛蛋白和尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2(caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2)。
15.段落1的方法，其中所述第一時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因子之前。
16.段落1的方法，其中所述第一時間點與向所述細胞群提供所述候選分化因子大致同時。
17.段落1的方法，其中所述第一時間點在向所述細胞群提供所述候選分化因子之后。
18.段落1的方法，其中所述標志物的表達增加。
19.段落1的方法，其中所述標志物的表達減少。
20.段落1的方法，其中所述標志物的表達通過定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)確定。
21.段落1的方法，其中所述標志物的表達通過免疫細胞化學確定。
22.段落1的方法，其中所述標志物選自胰-十二指腸同源框因子-1(PDX1)、同源框A13(HOXA13)和同源框C6(HOXC6)。
23.段落1的方法，其中所述標志物選自白蛋白、普洛斯彼羅-相關同源框1(PROX1)和肝細胞特異性抗原(HSA)。
24.段落1的方法，其中所述標志物選自絨毛蛋白和尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)。
25.段落1的方法，其中所述標志物是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TITF1)。
26.段落1的方法，其中所述分化因子包括前腸分化因子。
27.段落1的方法，其中所述分化因子包括小分子。
28.段落1的方法，其中所述分化因子包括類視黃醇。
29.段落1的方法，其中所述分化因子包括視黃酸。
30.段落1的方法，其中所述分化因子包括多肽。
31.段落1的方法，其中所述分化因子包括生長因子。
32.段落1的方法，其中所述分化因子包括FGF-10。
33.段落1的方法，其中所述分化因子包括FGF-2。
34.段落1的方法，其中所述分化因子包括Wnt3B。
35.段落1的方法，其中所述分化因子不是前腸分化因子。
36.段落1的方法，其中所述分化因子不是類視黃醇。
37.段落1的方法，其中所述分化因子不是視黃酸。
38.段落1的方法，其中所述分化因子以約0.1ng/ml至約10mg/ml的濃度提供給所述細胞群。
39.段落1的方法，其中所述分化因子以約1ng/ml至約1mg/ml的濃度提供給所述細胞群。
40.段落1的方法，其中所述分化因子以約10ng/ml至約100μg/ml的濃度提供給所述細胞群。
41.段落1的方法，其中所述分化因子以約100ng/ml至約10μg/ml的濃度提供給所述細胞群。
42.段落1的方法，其中所述分化因子以約1μg/ml的濃度提供給所述細胞群。
43.段落1的方法，其中所述分化因子以約100ng/ml的濃度提供給所述細胞群。
應了解上述的方法和組合物與體外培養(yǎng)的細胞有關。但是，上述體外分化的細胞組合物可用于體內(nèi)用途。
本發(fā)明的其他實施方案可參見以下專利申請于2003年12月23日提交的題為DEFINITIVE ENDODERM(定型內(nèi)胚層)的第60/532,004號美國臨時專利申請；于2004年4月27日提交的題為PDX1EXPRESSING ENDODERM(表達PDX1的內(nèi)胚層)的第60/566,293號美國臨時專利申請；于2004年7月9日提交的題為CHEMOKINE CELLSURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVEENDODERM(用于分離定型內(nèi)胚層的趨化因子細胞表面受體)的第60/586,566號美國臨時專利申請；于2004年7月14日提交的題為CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OFDEFINITIVE ENDODERM(用于分離定型內(nèi)胚層的趨化因子細胞表面受體)的第60/587,942號美國臨時專利申請；于2004年12月23日提交的題為DEFINITIVE ENDODERM(定型內(nèi)胚層)的第11/021,618號美國專利申請；于2005年4月26日提交的題為PDX1 EXPRESSINGENDODERM(表達PDX1的定型內(nèi)胚層)的第11/115,868號美國專利申請。


圖1是從hESC產(chǎn)生β-細胞的假想的分化途徑示意圖。途徑的第一步負責ES細胞至定形內(nèi)胚層系，也代表向胰內(nèi)胚層、內(nèi)分泌內(nèi)胚層或胰島/β-細胞的進一步分化事件前的第一步。途徑的第二步顯示SOX17-陽性/PDX1-陰性的定形內(nèi)胚層向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層的轉(zhuǎn)化。在介導這些轉(zhuǎn)化中起作用的因子用斜體字表示。定義靶細胞的相關標志物用下劃線表示。
圖2是人SOX17cDNA的示意圖，顯示了保守區(qū)的位置并突出顯示了用于通過GENOVAC的免疫步驟的區(qū)域。
圖3是關系樹狀圖，顯示SOX17與SOX7關系最近，與SOX18關系稍遠。在同源物種中SOX17蛋白質(zhì)比相同物種中的SOX群F亞族的其它成員的相關性強得多圖4是用兔抗SOX17抗體作探針的Westem印跡，該印跡證明這個抗體對成纖維細胞(1道)中過表達的SOX17有特異性，而缺乏與EGFP(2道)或最接近的SOX家族成員SOX7(3道)的免疫反應性。
圖5A-B是顯示大量AFP+共標記細胞的SOX17+細胞簇的顯微照片。這與其他SOX17+簇(B)形成顯著對比，因為在其他SOX17+簇中只能觀察到很少或者就根本沒有AFP+細胞。
圖6A-C是顯示體壁內(nèi)胚層和SOX17的顯微照片。圖A顯示隨機分化的hES細胞培養(yǎng)物中體壁內(nèi)胚層細胞表面的人血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)的免疫細胞化學檢測。圖B顯示與圖A相同的區(qū)域，對TM和SOX17雙標記。圖C是用DAPI標記核的相同區(qū)域的相差圖。注意DAPI標記的核和SOX17標記的完全相關。
圖7A-B是顯示定量PCR(Q-PCR)檢測的SOX17基因表達和SOX17-特異性抗體檢測的抗SOX17陽性細胞的條形圖。圖A顯示相對于未分化的對照培養(yǎng)基(SR20)活化素A增加SOX17基因表達，而視黃酸(RA)強烈抑制SOX17表達。圖B顯示在SOX17+細胞數(shù)量上反映了相似的模式以及這些變化的相似倍數(shù)，表明Q-PCR檢測SOX17基因表達可以在單個細胞水平反映出變化。
圖8A是條形圖，顯示活化素A存在下正在分化的hESC培養(yǎng)物保持低水平的AFP基因表達，而在10％小牛血清(FBS)中隨機分化的細胞顯示AFP的強烈上調(diào)。表達水平的差異大約是7倍。
圖8B-C是兩張顯微圖片，顯示活化素A對AFP表達的抑制在單個細胞水平也很顯著，因為相對于單用10％FBS(頂部)，在活化素A處理的條件(底部)下只能觀察到非常少和小的AFP+細胞簇。
圖9A-B是顯示使用流式細胞儀定量的AFP+細胞數(shù)的對比圖片。這個圖證明在活化素A存在(左圖)或缺失(右圖)的條件下，AFP基因表達(圖8A)的改變倍數(shù)完全對應于AFP+細胞的數(shù)量，進一步支持了使用Q-PCR分析來指示單個細胞水平上發(fā)生的變化。
圖10A-F是顯示使hESC暴露于nodal、活化素A和活化素B(NAA)5天后SOX17+細胞數(shù)目顯著增加(A-C)的顯微圖片。通過比較每個區(qū)域SOX17+細胞占全部細胞數(shù)目(如DAPI染色的核(D-F)所示)的相對豐度，可以看出在用NAA處理5天后約30-50％的細胞對SOX17顯示免疫反應性。
圖11是證明活化素A(0，10，30或100ng/ml)劑量依賴的增加正在分化的hESC中SOX17基因表達的條形圖。在粘附培養(yǎng)時處理3天后增加的表達已經(jīng)很高，并一直持續(xù)到隨后懸浮培養(yǎng)的1、3和5天。
圖12A-C是證明活化素A對MIXL1(圖A)、GATA4(圖B)和HNF3b(圖C)的表達的影響的條形圖。也觀察到活化素A劑量依賴的增加定形內(nèi)胚層3種其他標志物MIXL1、GATA4和HNF3b。與活化素劑量對應的表達增加的倍數(shù)與對SOX17所觀察到的非常相似，表明活化素A特異化共表達所有4種基因(SOX17+、MIXL1+、GATA4+和HNF3b+)的細胞群。
圖13A-C是證明活化素A對AFP(圖A)、SOX7(圖B)和SPARC(圖C)的表達的影響的條形圖。內(nèi)臟內(nèi)胚層標志物AFP的表達對活化素A顯示劑量依賴性的降低。原始內(nèi)胚層標志物(SOX7)和體壁內(nèi)胚層標志物(SPARC)保持不變或在一些時間點顯示抑制，表明活化素A不起特異化這些胚外內(nèi)胚層細胞類型的作用。這進一步支持了以下事實SOX17、MIXL1、GATA4和HNF3b表達的增加歸因于對應活化素A的定形內(nèi)胚層細胞數(shù)目的增加。
圖14A-B是顯示活化素A對ZIC1(圖A)和Brachyury(圖B)的表達的影響的條形圖。神經(jīng)標志物ZIC1穩(wěn)定的表達證明活化素A對神經(jīng)分化沒有劑量依賴效應。Brachyury的表達降低顯示100ng/ml活化素A處理顯著抑制了中胚層分化。這可能是從中內(nèi)胚層前體向定形內(nèi)胚層特異化增加的結(jié)果。相對于未處理的對照培養(yǎng)物，低水平的活化素A(10和30ng/ml)處理在分化的較后期保持brachyury的表達。
圖15A-B是顯示響應活化素處理的體壁內(nèi)胚層分化降低的顯微圖片。在只有血清的條件下分化時，體壁內(nèi)胚層Tmhi區(qū)域存在于所有培養(yǎng)物中(A)，而包含活化素A時，向TM+細胞的分化非常少，TM免疫反應性的總強度較低。
圖16A-D是顯示響應活化素A和活化素B處理的標志物表達的顯微圖片。hESC用活化素A和活化素B連續(xù)處理4天，用SOX17、AFP和TM抗體三重標記。圖A-SOX17；圖B-AFP；圖C-TM；圖D-Phase/DAPI。注意到許多SOX17陽性細胞伴隨著AFP(B)和TM(C)免疫反應性的完全缺失。
圖17是顯示在體外從hESC出現(xiàn)定形內(nèi)胚層和內(nèi)臟內(nèi)胚層的顯微圖片。通過AFPhi/SOX17lo/-鑒定內(nèi)臟內(nèi)胚層區(qū)域，而定形內(nèi)胚層顯示完全相反的模式SOX17hi/AFPlo/-。因為這兩個區(qū)域互相靠近，所以選擇了這個區(qū)域。但是，在從AFPhi細胞的任意區(qū)域的完全分離物中經(jīng)常會觀察到SOX17hi/AFPlo/-區(qū)域，表明來自內(nèi)臟內(nèi)胚層的定形內(nèi)胚層的單獨起源。
圖18是描述TGFβ家族的配體和受體的圖表。激活AR Smads和BR Smads的因子可以在從人胚胎干細胞產(chǎn)生定形內(nèi)胚層的過程中起作用(參見J Cell Physiol.187265-76)。
圖19是顯示作為經(jīng)單一或組合的TGFβ因子處理結(jié)果的SOX17表達的誘導隨時間變化的條形圖。
圖20是顯示作為經(jīng)組合的TGFβ因子處理結(jié)果的SOX17+細胞數(shù)目隨時間變化的條形圖。
圖21是顯示作為經(jīng)組合的TGFβ因子處理結(jié)果的SOX17表達的誘導隨時間變化的條形圖。
圖22是顯示活化素A劑量依賴性地誘導SOX17+細胞數(shù)目增加的條形圖。
圖23是條形圖，顯示向活化素A和活化素B處理的培養(yǎng)物中添加Wnt3a促使SOX17的表達水平高于只用活化素A和活化素B誘導的表達水平。
圖24A-C是顯示低FBS條件增強向定形內(nèi)胚層分化的條形圖。在含2％FBS的培養(yǎng)基中用活化素A和活化素B處理(2AA)hESC，可導致SOX17的表達水平比在含10％FBS的培養(yǎng)基中經(jīng)相同處理(10AA)的SOX17的表達水平高2至3倍(圖A)。定形內(nèi)胚層標志物MIXL1(圖B)的誘導也以相同方式受影響，在2％FBS中對AFP(內(nèi)臟內(nèi)胚層)的抑制比在10％FBS條件下更強(圖C)。
圖25A-D是顯示培養(yǎng)物中SOX17+細胞分裂的顯微圖片。SOX17免疫反應性細胞存在于hESC克隆的分化邊緣(C、D)，被增殖細胞核抗原(PCNA)標記(圖B)，但不被OCT4共標記(圖C)。此外，在SOX17+細胞(箭頭)以及OCT4+細胞，未分化的hESCs(箭頭頭部)中用DAPI標記核均可看到清晰的有絲分裂圖(D)。
圖26是顯示在不同培養(yǎng)基條件下正在分化的hESC中CXCR4的相對表達水平的條形圖。
圖27A-D是顯示一組定形內(nèi)胚層標志物在如同圖26顯示的相同分化處理下如何與CXCR4共享非常相似的表達模式的條形圖。
圖28A-E是條形圖，顯示中胚層標志物(BRACHYURY，MOX1)、外胚層標志物(SOX1，ZIC1)和內(nèi)臟內(nèi)胚層標志物(SOX7)在如同圖26顯示的相同處理下如何表現(xiàn)出與CXCR4表達相反的關系。
圖29A-F是顯示在圖26-28中展示的三種培養(yǎng)基條件下SOX17免疫反應性細胞的相對差異的顯微圖片。
圖30A-C是流式細胞點圖，證明CXCR4+細胞數(shù)目隨添加至分化培養(yǎng)基的活化素A的濃度的增加而增加。
圖31A-D是條形圖，顯示從高劑量活化素A處理(A100-CX+)分離的CXCR4+細胞比親代群(A100)進一步富集定形內(nèi)胚層標志物。
圖32是條形圖，顯示使用熒光激活細胞分選術(FACS)分離的CXCR4+和CXCR4-細胞的基因表達以及親代群中的基因表達。這證明CXCR4+細胞基本包含了每個親代細胞群中所有的CXCR4基因表達，CXCR4-細胞群包含很少或沒有CXCR4基因表達。
圖33A-D是條形圖，證明從高劑量活化素A處理分離的CXCR4+細胞中中胚層(BRACHYURY，MOX1)、外胚層(SOX1，ZIC1)和內(nèi)臟內(nèi)胚層(SOX7)基因表達的缺失，這些非定形內(nèi)胚層標志物的表達已經(jīng)受到抑制。
圖34A-M是顯示可用于鑒定定形內(nèi)胚層細胞的標志物基因的表達模式的條形圖。圖G-L分別顯示了定形內(nèi)胚層標志物FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的表達分析。圖A-F分別顯示了前面描述的細胞系標記基因SOX17、SOX7、SOX17/SOX7、TM、ZIC1和MOX1)的表達分析。圖M顯示了CXCR4的表達分析。對于圖A-M的每一圖，標注hESC的列表示來自純化的人胚胎干細胞的基因表達；2NF表示細胞經(jīng)過2％FBS處理，不添加活化素；0.1A100表示細胞經(jīng)0.1％FBS和100ng/ml活化素A處理；1A100表示細胞經(jīng)過1％FBS和100ng/ml活化素A處理；2A100表示細胞經(jīng)過2％FBS和100ng/ml活化素A處理。
圖35是顯示在含有或不含活化素的條件下培養(yǎng)4天和6天的hESC培養(yǎng)物中PDX1基因相對表達的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)和成纖維生長因子(FGF-10)。
圖36A-F是顯示在含有或不含活化素的條件下培養(yǎng)4天和6天的hESCs培養(yǎng)物中標志物基因相對表達的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)和成纖維生長因子(FGF-10)。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)SOX17；(B)SOX7；(C)AFP；(D)SOX1；(E)ZIC1；和(F)NFM。
圖37A-C是顯示在含有或不含活化素的條件下培養(yǎng)4天和8天的hESC培養(yǎng)物中標志物基因相對表達的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)、成纖維生長因子(FGF-10)和成纖維生長因子(FGF-4)的組合。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)PDX1；(B)SOX7和(C)NFM。
圖38A-G是顯示在與50ng/ml FGF-10接觸的定形內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物中標志物基因的相對表達的圖表，其中在第4天添加1μM、0.2μM或0.04μM視黃酸(RA)與50ng/ml FGF-10聯(lián)合使用。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)PDX1；(B)HOXA3；(C)HOXC6；(D)HOXA13；(E)CDX1；(F)SOX1和(G)NFM。
圖39A-E顯示在含有或不含活化素，存在視黃酸(RA)、成纖維細胞生長因子(FGF-10)和下列之中的一種血清替代物(SR)，小牛血清(FBS)或B27構(gòu)成的組合的條件下培養(yǎng)4天和8天的hESC培養(yǎng)物中標志物基因的相對表達。各欄顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)PDX1；(B)SOX7；(C)AFP；(D)ZIC1和(E)NFM。
圖40A-B是顯示6天(剛好在添加RA之前)后和9天(暴露于RA3天后)時hESC培養(yǎng)物中胰(PDX1、HNF6)和肝(HNF6)的標志物基因的相對表達的圖表。包括了不同的條件的比較，在25ng/ml(A25)或50ng/ml(A50)的條件下添加了10ng/ml(a10)、25ng/ml(a25)或50ng/ml(a50)的活化素B。不含任何活化素A和活化素B(NF)的條件作為產(chǎn)生定形內(nèi)胚層和PDX1-陽性內(nèi)胚層的陰性對照。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)PDX1和(B)HNF6。
圖41A-C顯示在含有100ng/ml(A100)、50ng/ml(A50)或不含(NF)活化素A的條件下培養(yǎng)5天(剛好在添加視黃酸之前)時和添加RA后2、4和6天(分別是第7、9和11天)的hESCs培養(yǎng)物中標志物基因的相對表達。每個柱圖下直接標記的百分比表明分化3至5天期間的FBS劑量。從第7天開始，用RA處理(R)的細胞在包含0.5％FBS的RPMI培養(yǎng)基中生長。RA的濃度在第7天是2μM，第9天是1μM，第11天是0.2μM。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)PDX1；(B)ZIC1和(C)SOX7。
圖42A-B顯示首先在低FBS中用活化素A處理誘導定形內(nèi)胚層(第5天)，然后用包含25ng/ml活化素A和RA或各種條件培養(yǎng)基(MEFCM、CM#2、CM#3和CM#4)和RA的新鮮(A25R)培養(yǎng)基誘導PDX1-表達內(nèi)胚層。在第5、6、7、8和9天檢測標志物表達。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平(A)PDX1和(B)CDX1。
圖43顯示了首先在低FBS中用活化素A處理誘導定形內(nèi)胚層，然后用新鮮培養(yǎng)基處理，該新鮮培養(yǎng)基在以新鮮培養(yǎng)基稀釋的條件培養(yǎng)基中包含活化素A和視黃酸(A25R)或者不同量的RA。培養(yǎng)基的總體積均是5ml。
圖44是Western印跡，顯示PDX1在添加RA和50ng/ml活化素A后3天(d8)和4天(d9)時RA-處理的定形內(nèi)胚層細胞的免疫沉淀。
圖45是一個概要圖表，顯示遺傳標記了在PDX1啟動子控制下的EGFP報告基因的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞熒光激活細胞分選術(FACS)的結(jié)果。
圖46為顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)和EGFP-陽性細胞(GFP+)的群在相對于管家基因校正后的相對PDX1表達水平的圖表。
圖47為顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)、一半帶有最低EGFP信號強度(Lo)的EGFP-陽性細胞群和一半帶有最高EGFP信號強度(Hi)的EGFP-陽性細胞群的群相對于管家基因校正后的相對PDX1表達水平。
圖48A-E顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)和EGFP-陽性細胞(GFP+)的群相對于管家基因校正后5種胰內(nèi)胚層標志物的相對表達水平。各圖A-NKX2.2；B-GLUT2；C-HNF3β；D-KRT19和E-HNF4α。
圖49是顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)和EGFP-陽性細胞(GFP+)的群在相對管家基因校正后兩種非胰內(nèi)胚層標志物的相對表達水平。各圖A-ZIC1和B-GFAP。
圖50A-D顯示移植到免疫妥協(xié)小鼠的腎包膜下的定型內(nèi)胚層細胞的體內(nèi)分化。各圖A-蘇木精-伊紅染色顯示腸管樣結(jié)構(gòu)；B-抗肝細胞特異性抗原(肝)的抗體免疫反應性；C-抗絨毛蛋白(villin)(腸)的抗體免疫反應性；和D-抗CDX2(腸)的抗體免疫反應性。
圖51A-C是顯示在第5至10天接觸20ng/ml Wnt3B、5ng/ml FGF2或100ng/ml FGF2的細胞中肝組織標志物(白蛋白和PROX1)和肺組織標志物(TITF1)校正后的相對表達水平的圖表。DE指定型內(nèi)胚層細胞。各圖A-白蛋白，B-PROX1，和C-TITF1。
圖52A-L是顯示在第5至10天接觸20-50ng/ml Wnt3A、5ng/mlFGF2或100ng/ml FGF2和在第9和10天接觸BMP4的細胞中肝組織標志物(AFP、AAT、hHEX、GLUT2、APOA1和VCAM1)和肺組織標志物(VWF和CXR4)校正后的相對表達水平的圖表。DE指定型內(nèi)胚層細胞。各圖A-AFP，B-AAT，C-GLUKO，D-hHEX，E-TAT，F(xiàn)-hNF4a，G-CYP7A，H-GLUT2，I-APOA1，J-VCAM1，K-VWF，和L-CXCR4。
詳細說明人早期發(fā)育的一個關鍵階段，即術語原腸胚形成發(fā)生在受精2-3周后。原腸胚形成極端重要，因為在此期三個原始胚首先專一化和有序化(Lu et al.，2001；Schoenwolf and Smith，2000)。外胚層負責身體外層及全部神經(jīng)系統(tǒng)的形成，然而，心臟、血液、骨骼、骨骼肌及其它結(jié)締組織均衍生于中胚層。定形內(nèi)胚層定義為負責全部腸管形成的胚層，該全部的腸管包括食道、胃、小腸及大腸，以及從腸道衍生的器官，如肺、肝、胸腺、甲狀旁腺及甲狀腺、膽囊及胰(Grapin-Botton and Melton，2000；Kimelman and Griffin，2000；Tremblay et al.，2000；Wells and Melton，1999；Wells and Melton，2000)。定形內(nèi)胚層與稱為原始內(nèi)胚層的完全分離的細胞系之間有著非常明顯的不同。原始內(nèi)胚層主要形成胚外組織，主要是胎盤卵黃囊的體壁及內(nèi)臟內(nèi)胚層部分及Reichert′s膜的細胞外基質(zhì)材料。
在原腸胚形成過程中，定形內(nèi)胚層形成過程始于細胞遷徙事件，其中，中內(nèi)胚層細胞(能夠形成中胚層或內(nèi)胚層的細胞組分)穿過一個稱作原條(primitive streak)的結(jié)構(gòu)。定形內(nèi)胚層衍生于穿過原條前部及結(jié)(一個位于原線最前面部分的特定結(jié)構(gòu))的細胞。當遷徙發(fā)生時，定形內(nèi)胚層首先形成腸管的最前面部分直至形成腸管后端時結(jié)束。
定形內(nèi)胚層和從其衍生的內(nèi)胚層細胞代表了細胞衍生的重要多潛能起點，該細胞組成衍生自定形內(nèi)胚層譜系的終分化的組織和/或器官。這些細胞、組織和/或器官在細胞治療中極其有用。由此，本文描述的鑒定分化因子的方法有利于細胞治療的進步，該分化因子能夠使定形內(nèi)胚層細胞和/或表達PDX1的內(nèi)胚層細胞分化成衍生自定形內(nèi)胚層細胞譜系的其它細胞類型。
具體地，本發(fā)明的一些實施方案涉及鑒定一種或多種分化因子的方法，所述分化因子可用于分化包含PDX1陽性內(nèi)胚層細胞和/或定形內(nèi)胚層細胞的細胞群中的細胞，其能夠促進定形內(nèi)胚層細胞分化為組織和/或器官前體的細胞，該組織和/或器官包括但不限于胰腺、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱。
本文還描述了涉及定形內(nèi)胚層細胞組合物、PDX1陽性內(nèi)胚層細胞組合物以及可用于制備這些細胞的方法和組合物的其它方面。
定義貫穿本申請使用的某些術語和短語具有以下所描述的意義
此處使用的“胚胎的”指有機體的一系列發(fā)育階段，開始于單一受精卵，結(jié)束于多細胞結(jié)構(gòu)，這種多細胞結(jié)構(gòu)除了發(fā)育的配子生殖細胞外不再包含多能性或全能性細胞。除了來自配子融合的胚胎，術語“胚胎的”也指來自體細胞核轉(zhuǎn)移的胚胎。
本文使用的“多能性”或“多能性細胞”指能產(chǎn)生有限數(shù)量的其它具體細胞類型的細胞類型。
本文使用的“表達”指材料或物質(zhì)的產(chǎn)生以及材料或物質(zhì)產(chǎn)生的水平或量。因此，檢測特定標志物的表達指測定所表達的標志物的相對或絕對量，或僅僅檢測標志物的存在與否。
此處使用的“標志物”指能夠被觀察或檢測到的任何分子。例如，標志物可包括但不限于核酸如特異基因的轉(zhuǎn)錄本、基因的多肽產(chǎn)物、非基因多肽產(chǎn)物、糖蛋白、糖、糖脂、脂質(zhì)、脂蛋白或小分子(例如，分子量小于10,000amu的分子)。
當涉及細胞培養(yǎng)物和/或細胞群時，術語“部分”表示細胞培養(yǎng)物或細胞群任意不為零的量，范圍從單個細胞到整個細胞培養(yǎng)物或細胞群。
關于細胞培養(yǎng)物或細胞群中的細胞，術語“基本上不含”表示細胞培養(yǎng)物或細胞群所不含的特異細胞類型在細胞培養(yǎng)物或細胞群的所有細胞中占有的比例少于5％。
此處使用的“類視黃醇(retinoid)”指視黃醇、視黃醛或視黃酸以及這些化合物的任何衍生物。
“條件培養(yǎng)基”是指與基本培養(yǎng)基比較發(fā)生了改變的培養(yǎng)基。
本文使用的“前腸/中腸”指腸管前部及中部細胞，包括前腸/中腸連接部的細胞。
定形內(nèi)胚層細胞和其相關過程本發(fā)明描述的實施方案涉及在培養(yǎng)物中生成定形內(nèi)胚層細胞的新的確定方法，其通過將諸如干細胞的多能性細胞分化為多潛能定形內(nèi)胚層細胞。如上所述，定形內(nèi)胚層細胞并不分化為源于外胚層或中胚層的組織，然而，可分化為腸管及源于腸管的器官。在一些優(yōu)選的實施方案中，定形內(nèi)胚層細胞衍生于hESCs。這些方法提供了有效生成人內(nèi)胚層衍生的組織，如胰、肝、肺、胃、腸、甲狀腺和胸腺的基礎。例如，定形內(nèi)胚層的生成是干細胞向功能性的產(chǎn)生胰島素的β細胞分化的第一步。為了獲得有用量的產(chǎn)生胰島素的β細胞，在達到胰島/β細胞前，期望每個分化步驟都是高效的分化步驟。因為干細胞分化為定形內(nèi)胚層細胞也許代表著生成功能性胰島/β細胞的最初步驟(如圖1所示)，特別需要此步分化高效。
鑒于有效分化多能性細胞至定形內(nèi)胚層細胞的需要，本發(fā)明一些方面涉及體外方法學，其將約50-80％的多能性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細胞。典型地，這些方法包括以已明確及暫時指定的方式使用培養(yǎng)物及生長因子。使用可與定形內(nèi)胚層細胞特異結(jié)合的試劑，從細胞群中將定形內(nèi)胚層細胞與其它細胞分離和/或純化，可獲得定形內(nèi)胚層細胞群的進一步富集。這樣，本發(fā)明的一些實施方案涉及定形內(nèi)胚層細胞及制備分離和/或純化這些細胞的方法。
為了確定細胞培養(yǎng)物或細胞群內(nèi)定形內(nèi)胚層細胞的數(shù)量，需要從培養(yǎng)物或細胞群中區(qū)分這類細胞與其它細胞的方法。因此，本發(fā)明的某些實施方案涉及細胞標志物，其存在與否和/或相對表達水平對定形內(nèi)胚層是特異的，以及檢測確定這些標志物表達的方法。
在本發(fā)明的一些實施方案中，標志物存在與否和/或其表達水平由定量PCR(Q-PCR)確定。例如，一些遺傳標志物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本量，例如SOX17、CXCR4、OCT4、AFP、TM、SPARC、SOX7、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1、CRIP1及本文所述的其它標志物，由定量Q-PCR確定。在其它實施方案中，免疫組化技術用于檢測上述基因表達的蛋白。在其它實施方案中，Q-PCR及免疫組化技術用于識別及確定這些標志物的量或相對比例。
通過使用如上述的確定一種或多種合適的標志物表達的方法，在細胞培養(yǎng)物或細胞群內(nèi)鑒別定形內(nèi)胚層細胞以及確定定形內(nèi)胚層細胞的比例是可能的。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細胞或細胞群表達SOX17和/或CXCR4基因的水平比非定形內(nèi)胚層細胞類型或細胞群高約2個數(shù)量級。在其它實施方案中，產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細胞或細胞群表達SOX17和/或CXCR4基因的水平比非定形內(nèi)胚層細胞類型或細胞群高2個以上數(shù)量級。在另一些其它實施方案中，產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細胞或細胞群表達一種或多種選自SOX17、CXCR4、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物，比非定形內(nèi)胚層細胞類型或細胞群的表達高約2個或2個以上的數(shù)量級。在本文所述的一些實施方案中，定形內(nèi)胚層細胞不顯著表達PDX1。
本文所述實施方案還涉及定形內(nèi)胚層細胞組合物。例如，一些實施方案涉及包括定形內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物，然而其它的涉及富集了定形內(nèi)胚層細胞的細胞群。一些優(yōu)選的實施方案涉及包括定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中至少約50-80％的細胞為定形內(nèi)胚層細胞。特別優(yōu)選的實施方案涉及包括人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約50-80％人細胞為定形內(nèi)胚層細胞。由于分化方法的效果可以通過改變一些參數(shù)來調(diào)節(jié)，這些參數(shù)包括但不限于細胞生長條件、生長因子濃度及培養(yǎng)步驟的時間安排，本發(fā)明所述的分化方法可使約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、或大于95％的多能性細胞轉(zhuǎn)化為定形內(nèi)胚層。在其它優(yōu)選的實施方案中，將諸如干細胞群體的多能性細胞群轉(zhuǎn)化為基本純的定形內(nèi)胚層細胞群。
本發(fā)明所述的組合物及方法具有幾個有用的特征。例如，包括定形內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物及細胞群，以及制備這些細胞培養(yǎng)物及細胞群的方法可用于模建人發(fā)育的早期階段。此外，本發(fā)明所述的組合物及方法也可用于如糖尿病的疾病的干預治療。例如，由于定形內(nèi)胚層僅用作有限數(shù)量的組織的來源，因而其可用于發(fā)育純的組織或細胞類型。
從多能性細胞制備定形內(nèi)胚層以下及于2004年12月23日提交的題為DEFINITIVEENDODERM(定型內(nèi)胚層)的第11/021,618號美國專利中描述了分化多能性細胞生產(chǎn)包含定型內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物和富集的細胞群的方法。一些這樣的方法中，作為起始材料的多能性細胞是干細胞。某些方法中，從胚胎干細胞生產(chǎn)包含定型內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和富集的細胞群。優(yōu)選的衍生定形內(nèi)胚層細胞的方法利用人胚胎干細胞作為制備定形內(nèi)胚層的起始材料。這些多能性細胞可以是衍生于桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或從胚胎性腺嵴獲得的細胞。使用現(xiàn)有技術方法，人干細胞可在培養(yǎng)基中保持多能狀態(tài)而基本不分化。所述的方法在諸如第5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806及6,251,671號美國專利中有所描述。
在生產(chǎn)定型內(nèi)胚層細胞的一些方法中，hESCs保持在滋養(yǎng)層。在這些方法中，任何能夠使hESCs保持在多能狀態(tài)的滋養(yǎng)層都可用于本發(fā)明所述的方法中。一個常用的培養(yǎng)人胚胎干細胞的滋養(yǎng)層為一層小鼠成纖維細胞。最近，人成纖維細胞滋養(yǎng)層也已開發(fā)出來用于培養(yǎng)hESCs(參見第2002/0072117號美國專利申請中公開的方法)。本發(fā)明所述方法的其它實施方案允許不使用滋養(yǎng)層保持多能性hESCs。這些方法已在第2003/0175956號美國專利申請中有描述。
本發(fā)明所述的人胚胎干細胞可以保持在具有或不具有血清的培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，使用血清替代品。在其它實施方案中，使用無血清的培養(yǎng)基技術，如美國專利申請?zhí)?003/0190748所述，其公開在此全部引入，以供參考。
在培養(yǎng)基中保持多能狀態(tài)的干細胞按照常規(guī)傳代，直到分化為定形內(nèi)胚層。在一些實施方案中，分化至定形內(nèi)胚層的完成是通過向干細胞培養(yǎng)基中加入TGFβ超家族生長因子，其加入的量足以促進分化至定形內(nèi)胚層。用于制備定形內(nèi)胚層的TGFβ超家族生長因子選自Nodal/活化素或BMP亞群。在本發(fā)明所述分化方法的一些實施方案中，生長因子選自Nodal、活化素A、活化素B及BMP4。此外，生長因子Wnt3a及其它Wnt家族成員可用于制備定形內(nèi)胚層細胞。在某些分化過程中，可以使用上述提及的任何生長因子的組合。
關于從多能性干細胞向定形內(nèi)胚層細胞分化的一些方法中，向細胞中加入的上述生長因子，其在培養(yǎng)基中的濃度足以促進至少部分干細胞分化至定形內(nèi)胚層細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中，培養(yǎng)基中上述生長因子的濃度至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、至少約1000ng/ml、至少約2000ng/ml、至少約3000ng/ml、至少約4000ng/ml、至少約5000ng/ml或大于5000ng/ml。
在將多能性干細胞分化為定形內(nèi)胚層細胞的某些方法中，上述生長因子在加入培養(yǎng)基后需要被從細胞培養(yǎng)物中除去。例如，生長因子的除去時間約在加入后1天、約2天、約3天、約4、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。在一個優(yōu)選實施方案中，生長因子的除去時間約在加入后4天。
定形內(nèi)胚層細胞的培養(yǎng)可在含有少量血清或無血清的培養(yǎng)基中進行。在某些培養(yǎng)條件下，血清的濃度范圍為約0.05％v/v至約20％v/v。例如，在一些分化方法中，培養(yǎng)基中血清的濃度可以低于約0.05％(v/v)、低于約0.1％(v/v)、低于約0.2％(v/v)、低于約0.3％(v/v)、低于約0.4％(v/v)、低于約0.5％(v/v)、低于約0.6％(v/v)、低于約0.7％(v/v)、低于約0.8％(v/v)、低于約0.9％(v/v)、低于約1％(v/v)、低于約2％(v/v)、低于約3％(v/v)、低于約4％(v/v)、低于約5％(v/v)、低于約6％(v/v)、低于約7％(v/v)、低于約8％(v/v)、低于約9％(v/v)、低于約10％(v/v)、低于約15％(v/v)或低于約20％(v/v)。在一些方法中，定形內(nèi)胚層細胞在無血清下或在血清替代品存在下生長。在其它實施方案中，定形內(nèi)胚層細胞在B27存在下生長。在這些實施方案中，B27添加物的濃度范圍為約0.2％至約20％v/v。
監(jiān)測多能性細胞向定形內(nèi)胚層的分化hESC培養(yǎng)至定形內(nèi)胚層的進程可以通過確定定形內(nèi)胚層的標志物特征表達來監(jiān)測。在一些實施方案中，一些標志物的表達可通過檢測是否存在標志物來確定?？蛇x擇地，一些標志物的表達可通過測定標志物在細胞培養(yǎng)物或細胞群細胞中的水平來確定。在這些實施方案中，可以定性或定量測定標志物的表達。一種定量標志物基因產(chǎn)生的表達標志物的方法可以使用定量PCR(Q-PCR)。進行Q-PCR的方法在現(xiàn)有技術中為公知的?，F(xiàn)有技術中已知的其它方法也可用于定量標志物基因的表達。例如，標志物基因產(chǎn)物的表達可以通過使用針對感興趣的特異標志物基因產(chǎn)物的抗體來檢測。在本發(fā)明的一些實施方案中，確定了定形內(nèi)胚層特征性的標志物基因的表達，及缺乏hESCs及其它細胞類型特征性的標志物基因的表達。
如下述實施例的進一步所述，定形內(nèi)胚層的一個可靠標志物為SOX17基因。這樣，本發(fā)明所述方法制備的定形內(nèi)胚層細胞表達SOX17標志物基因，由此產(chǎn)生SOX17基因產(chǎn)物。其它定形內(nèi)胚層的標志物為MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。由于定形內(nèi)胚層細胞表達SOX17標志物基因的水平高于SOX7標志物基因的水平，其中SOX7標志物基因為原始及內(nèi)臟內(nèi)胚層的特征(參見表1)，因此在本發(fā)明的一些實施方案中監(jiān)測SOX17和SOX7的表達。在其它實施方案中，監(jiān)測SOX17標志物基因的表達和OCT4標志物基因的表達，其中OCT4標志物基因為hESCs的特征。此外，由于定形內(nèi)胚層細胞表達SOX17標志物基因的水平高于AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平，可以監(jiān)測這些基因的表達。
定形內(nèi)胚層的其它標志物為CXCR4基因。CXCR4基因編碼細胞表面趨化因子受體，其配體為趨化物SDF-1。成人中包含CXCR4受體的細胞的主要作用據(jù)信為遷移造血細胞至骨髓、運載淋巴細胞、分化各種B細胞及巨噬血細胞系[Kim，C.，and Broxmeyer，H.J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]。CXCR4受體也起著HIV-1進入T細胞中的共受體作用[Feng，Y.，etal.Science，272，872-877(1996)]。在一系列[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]開展的研究中，描述了在成年小鼠及其早期發(fā)育中趨化因子受體CXCR4及其獨特配體SDF-1[Kim，C.，and Broxmyer，H.，J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]的表達。CXCR4/SDF1在發(fā)育中的相互作用已經(jīng)清楚，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，當其中任一基因破壞[Nagasawa et al.Nature，382，635-638(1996)]，Ma，Q.，et al Immunity，10，463-471(1999)]都導致晚期胚胎死亡。McGrath等使用核糖核酸酶保護及原位雜交方法證實，在形成原腸胚的早期(E7.5)，CXCR4為檢測到的最豐富的趨化因子受體信使RNA。在原腸胚形成階段，CXCR4/SDF-1信號似乎主要誘導原條胚層細胞的遷移，并表達在此時存在的定形內(nèi)胚層、中胚層及外胚層上。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4及α-胎蛋白互相排斥，顯示在內(nèi)臟內(nèi)胚層缺乏表達[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]。
由于用多能性細胞制備的定形內(nèi)胚層細胞表達CXCR4標志物基因，可以監(jiān)測CXCR4的表達以跟蹤定形內(nèi)胚層細胞的生成。另外，根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的定形內(nèi)胚層細胞表達其它定形內(nèi)胚層標志物，包括但不限于SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1。由于定形內(nèi)胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于表達SOX7標志物基因的水平，可以監(jiān)測CXCR4和SOX7的表達。在其它實施方案中，監(jiān)測CXCR4標志物基因的表達和OCT4標志物基因表達。此外，由于定形內(nèi)胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于表達AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標志物基因的水平，可以監(jiān)測這些基因的表達。
應當理解，在內(nèi)胚層細胞中CXCR4的表達并不排斥SOX17的表達。相應地，根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的定形內(nèi)胚層細胞顯著表達SOX17和CXCR4，但不顯著表達AFP、TM、SPARC或PDX1。
應當理解，根據(jù)分化條件，在定形內(nèi)胚層細胞內(nèi)誘導不同水平范圍的SOX17和/或CXCR4標志物表達。這樣，在本發(fā)明一些實施方案中，SOX17標志物和/或CXCR4標志物在定形內(nèi)胚層細胞或細胞群的表達比SOX17標志物和/或CXCR4標志物在諸如多能性干細胞的非定形內(nèi)胚層細胞或細胞群中的表達至少高約2倍至至少約10,000倍。在本發(fā)明其它實施方案中，SOX17標志物和/或CXCR4標志物在定形內(nèi)胚層細胞或細胞群的表達比SOX17標志物和/或CXCR4標志物在諸如多能性干細胞的非定形內(nèi)胚層細胞或細胞群表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500倍或至少約10,000倍。在一些實施方案中，SOX17標志物和/或CXCR4標志物在定形內(nèi)胚層細胞或細胞群的表達無限制地高于SOX17標志物和/或CXCR4標志物在諸如多能性干細胞的非定形內(nèi)胚層細胞或細胞群表達。
還應當理解，在本發(fā)明一些實施方案中，與在非定形內(nèi)胚層細胞或細胞群中的GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1標志物的表達相比，在定形內(nèi)胚層細胞或細胞群體中的GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1標志物的表達增加。
也應當理解，在定形內(nèi)胚層細胞內(nèi)，SOX17標志物的表達水平與OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物表達水平存在一系列差異。類似地，在定形內(nèi)胚層細胞內(nèi)，CXCR4標志物的表達水平與OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物表達水平也存在一系列差異。因而，在本發(fā)明一些實施方案中，SOX17標志物或CXCR4標志物的表達比OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達高至少約2倍至至少約10,000倍。在本發(fā)明其它實施方案中，SOX17標志物或CXCR4標志物的表達比OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達高至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約40倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約500倍、至少約750倍、至少約1000倍、至少約2500倍、至少約5000倍、至少約7500倍或至少約10,000倍。在一些實施方案中，OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物在定形內(nèi)胚層細胞不顯著表達。
應當理解，在本發(fā)明一些實施方案中，在定形內(nèi)胚層細胞內(nèi)，與OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7的表達相比，選自GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及CRIP1的標志物的表達增加。
定形內(nèi)胚層的富集、分離和/或純化用任何上述方法制備的定形內(nèi)胚層細胞可使用特異針對這些細胞的親和標記物來富集、分離和/或純化。特異針對定形內(nèi)胚層細胞的親和標記物的實例為抗體、配體或其它特異針對如多肽的標志物分子的結(jié)合試劑(例如多肽)，該標志物分子存在于細胞定形內(nèi)胚層細胞的表面，但基本不存在于根據(jù)本發(fā)明所述的方法制備的細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的其它細胞類型中。在一些實施方案中，與CXCR4結(jié)合的抗體用于定形內(nèi)胚層的富集、分離和/或純化的親和標記物。在其它實施方案中，趨化因子SDF-1或其它基于SDF-1的分子也可用作親和標記物。這些分子包括，但不限于SDF-1片斷、SDF-1融合物或SDF-1模擬物。
制備抗體及其用于細胞分離的方法在本技術領域已知，這些方法可利用本發(fā)明所述的抗體及細胞來實施。在一個實施方案中，將結(jié)合CXCR4的抗體與磁珠結(jié)合，然后在細胞培養(yǎng)基中與定形內(nèi)胚層細胞結(jié)合，經(jīng)酶處理后降低了細胞間及與底物的粘附。將細胞/抗體/磁珠復合物暴露于移動磁場中以將磁珠結(jié)合的定形內(nèi)胚層細胞與未結(jié)合的細胞分開。一旦定形內(nèi)胚層細胞在培養(yǎng)基中與其它細胞物理分開，破壞結(jié)合的抗體，將細胞重新置于合適的組織培養(yǎng)基中。
也可使用獲得富集、分離或純化的定形內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物或細胞群的其它方法。例如，在一些實施方案中，CXCR4抗體與包含定形內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物一起孵育，該細胞培養(yǎng)物之前經(jīng)處理后降低了細胞間及與底物的粘附。然后將細胞洗滌、離心及再懸浮。細胞懸浮物然后再與第二抗體，如能夠與第一抗體結(jié)合的FITC偶聯(lián)抗體孵育。然后再將細胞洗滌、離心及再懸浮緩沖液中。隨后分析細胞懸浮物，使用熒光活化細胞分選器(FACS)分選。將CXCR4-陰性細胞分離，收集CXCR4-陽性細胞，由此分離了該類型細胞。需要時，分離的細胞組合物可進一步使用替代的親和方法或使用特異針對定形內(nèi)胚層的相同或不同標志物通過增加分選數(shù)次來純化。
在本發(fā)明其它實施方案中，使用結(jié)合CXCR4的配體或其它分子富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層。在一些實施方案中，所述分子為SDF-1或其片段、融合物或其模擬物。
在優(yōu)選實施方案中，當干細胞培養(yǎng)物被誘導向定形內(nèi)胚層系分化后，自其它非定形內(nèi)胚層細胞中富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細胞。應當明白，上述富集、分離和/或純化方法可利用任何分化階段的這種培養(yǎng)物。
除上述的方法，定形內(nèi)胚層細胞也可以其它細胞分離技術分離。此外，定形內(nèi)胚層細胞也可以在生長條件下通過一系列再培養(yǎng)的方法富集或分離，該生長條件有利于所述的定形內(nèi)胚層細胞選擇性存活或選擇性擴增。
使用本發(fā)明所述的方法，可在體外自至少經(jīng)過一些分化的如干細胞培養(yǎng)物或細胞群的多能性細胞培養(yǎng)物或細胞群中富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細胞。在一些實施方案中，所述細胞進行隨機分化。然而，在一些優(yōu)選實施方案，所述細胞被導向主要分化為定形內(nèi)胚層。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外自人胚胎干細胞制備定形內(nèi)胚層。使用本發(fā)明所述的方法，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，細胞群或細胞培養(yǎng)物中富集定形內(nèi)胚層為至少約2倍至約1000倍。在一些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，定形內(nèi)胚層細胞富集至少約5倍至約500倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，定形內(nèi)胚層細胞可富集至少約10倍至約200倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，定形內(nèi)胚層細胞可富集至少約20倍至約100倍。在其它實施方案中，與未處理的細胞群體或細胞培養(yǎng)物相比，定形內(nèi)胚層細胞富集至少約40倍至約80倍。在某些實施方案中，與未處理的細胞群體或細胞培養(yǎng)物相比，定形內(nèi)胚層細胞富集至少約2倍至約20倍。
包含定形內(nèi)胚層的組合物上述方法產(chǎn)生的細胞組合物包括包含定形內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物和富集定形內(nèi)胚層的細胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約50-80％的細胞是定形內(nèi)胚層細胞。因為分化方法的效率可通過改變某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細胞生長條件、生長因子濃度和培養(yǎng)步驟的時間控制)來調(diào)整，此處描述的分化方法可導致約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％或超過約95％的多能性細胞向定形內(nèi)胚層的轉(zhuǎn)化。在所采用的分離定形內(nèi)胚層細胞的方法中，例如，通過使用結(jié)合CXCR4受體的親和試劑，可獲得基本上純的定形內(nèi)胚層細胞群。
本發(fā)明的一些實施方案涉及包含諸如干細胞的多能性細胞和定形內(nèi)胚層細胞的組合物，例如細胞群和細胞培養(yǎng)物。例如，用本發(fā)明的方法可以制備包含hESCs和定形內(nèi)胚層細胞混合物的組合物。一些實施方案中，能夠產(chǎn)生包含約每95個多能性細胞對應至少約5個定形內(nèi)胚層細胞的組合物。其他實施方案中，能夠產(chǎn)生包含約每5個多能性細胞對應至少約95個定形內(nèi)胚層細胞的組合物。此外，預期可以得到包含多能性細胞和定形內(nèi)胚層其他比例的細胞培養(yǎng)物或細胞群。例如，預期可以得到包含約每1,000,000個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每100,000個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層、約每10,000個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每1000個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每500個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每100個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每10個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每5個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每2個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約1個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約2個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約5個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約10個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約20個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約50個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約100個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約1000個定形內(nèi)胚層細胞、約每1個多能性細胞對應至少約10,000個定形內(nèi)胚層細胞、約多能性細胞對應至少約100,000個定形內(nèi)胚層細胞、和約每1個多能性細胞對應至少約1,000,000個定形內(nèi)胚層細胞的組合物。一些實施方案中，該多能性細胞是人多能性干細胞。某些實施方案中，該干細胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或胚胎生殖嵴。某些其他實施方案中，該多能性細胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過胚胎期的多細胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。
本發(fā)明的一些實施方案涉及包含從至少約5％定形內(nèi)胚層細胞到至少約95％定型內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。一些實施方案中，該細胞培養(yǎng)物或細胞群包含哺乳動物細胞。優(yōu)選實施方案中，該細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人細胞。例如，某些特定實施方案涉及含有人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中從至少約5％到至少約95％的人細胞是定形內(nèi)胚層細胞。其它實施方案涉及含有人細胞的細胞培養(yǎng)物，其中至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％或多于90％的人細胞是定形內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的飼養(yǎng)細胞。
本發(fā)明的進一步實施方案涉及包含人細胞(如人定形內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約5％的人細胞中SOX17或CXCR4標志物的表達高于OCT4、SPARC、α-甲胎蛋白(AFP)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)和/或SOX7標志物的表達。其他實施方案中，至少約10％的人細胞中、至少約15％的人細胞中、至少約20％的人細胞中、至少約25％的人細胞中、至少約30％的人細胞中、至少約35％的人細胞中、至少約40％的人細胞中、至少約45％的人細胞中、至少約50％的人細胞中、至少約55％的人細胞中、至少約60％的人細胞中、至少約65％的人細胞中、至少約70％的人細胞中、至少約75％的人細胞中、至少約80％的人細胞中、至少約85％的人細胞中、至少約90％的人細胞中、至少95％的人細胞中或多于95％的人細胞中，SOX17或CXCR4標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。一些細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞的實施方案中，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的飼養(yǎng)細胞。
應了解本發(fā)明的一些實施方案涉及包含人細胞(如人定形內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中從至少約5％到超過至少約95％的人細胞中一種或多種選自GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。一些細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞的實施方案中，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的飼養(yǎng)細胞。
本發(fā)明的其它實施方案涉及包含人細胞(如人定形內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約5％的人細胞中SOX17和CXCR4標志物的表達都高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。其他實施方案中，至少約10％的人細胞中、至少約15％的人細胞中、至少約20％的人細胞中、至少約25％的人細胞中、至少約30％的人細胞中、至少約35％的人細胞中、至少約40％的人細胞中、至少約45％的人細胞中、至少約50％的人細胞中、至少約55％的人細胞中、至少約60％的人細胞中、至少約65％的人細胞中、至少約70％的人細胞中、至少約75％的人細胞中、至少約80％的人細胞中、至少約85％的人細胞中、至少約90％的人細胞中、至少95％的人細胞中或多于95％的人細胞中，SOX17和CXCR4標志物的表達都高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。一些細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞的實施方案中，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的飼養(yǎng)細胞。
應了解本發(fā)明的一些實施方案涉及包含人細胞(如人定形內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中從至少約5％到超過至少約95％的人細胞中GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。一些細胞培養(yǎng)物或細胞群包含人飼養(yǎng)細胞的實施方案中，計算上述百分比時不考慮細胞培養(yǎng)物或細胞群中的飼養(yǎng)細胞。
本發(fā)明的其它實施方案涉及包含哺乳動物內(nèi)胚層細胞(如人內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約5％的內(nèi)胚層細胞中SOX17或CXCR4標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。其他實施方案中，至少約10％的內(nèi)胚層細胞中、至少約15％的內(nèi)胚層細胞中、至少約20％的內(nèi)胚層細胞中、至少約25％的內(nèi)胚層細胞中、至少約30％的內(nèi)胚層細胞中、至少約35％的內(nèi)胚層細胞中、至少約40％的內(nèi)胚層細胞中、至少約45％的內(nèi)胚層細胞中、至少約50％的內(nèi)胚層細胞中、至少約55％的內(nèi)胚層細胞中、至少約60％的內(nèi)胚層細胞中、至少約65％的內(nèi)胚層細胞中、至少約70％的內(nèi)胚層細胞中、至少約75％的內(nèi)胚層細胞中、至少約80％的內(nèi)胚層細胞中、至少約85％的內(nèi)胚層細胞中、至少約90％的內(nèi)胚層細胞中、至少95％的內(nèi)胚層細胞中或多于95％的內(nèi)胚層細胞中，SOX17或CXCR4標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
應了解本發(fā)明的一些實施方案涉及包含哺乳動物內(nèi)胚層細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中從至少約5％到超過至少約95％的內(nèi)胚層細胞中一種或多種選自GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
本發(fā)明的其它實施方案涉及包含哺乳動物內(nèi)胚層細胞(如人內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約5％的內(nèi)胚層細胞中SOX17和CXCR4標志物的表達都高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。其他實施方案中，至少約10％的內(nèi)胚層細胞中、至少約15％的內(nèi)胚層細胞中、至少約20％的內(nèi)胚層細胞中、至少約25％的內(nèi)胚層細胞中、至少約30％的內(nèi)胚層細胞中、至少約35％的內(nèi)胚層細胞中、至少約40％的內(nèi)胚層細胞中、至少約45％的內(nèi)胚層細胞中、至少約50％的內(nèi)胚層細胞中、至少約55％的內(nèi)胚層細胞中、至少約60％的內(nèi)胚層細胞中、至少約65％的內(nèi)胚層細胞中、至少約70％的內(nèi)胚層細胞中、至少約75％的內(nèi)胚層細胞中、至少約80％的內(nèi)胚層細胞中、至少約85％的內(nèi)胚層細胞中、至少約90％的內(nèi)胚層細胞中、至少95％的內(nèi)胚層細胞中或多于95％的內(nèi)胚層細胞中，SOX17和CXCR4標志物的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
應了解本發(fā)明的一些實施方案涉及包含哺乳動物內(nèi)胚層細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中從至少約5％到超過至少約95％的內(nèi)胚層細胞中GATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的表達高于OCT4、SPARC、AFP、TM和/或SOX7標志物的表達。
使用此處描述的方法，可產(chǎn)生基本上不含其他細胞類型的包含定型內(nèi)胚層細胞的組合物。本發(fā)明的一些實施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生的定型內(nèi)胚層細胞群或細胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達OCT4、SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1和/或BRACH標志物基因的細胞。
本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)標志物基因的表達對定型內(nèi)胚層細胞的描述如下SOX17高、MIXL1高、AFP低、SPARC低、血栓調(diào)節(jié)素低、SOX7低、CXCR4高。
發(fā)育過程中PDX1基因表達PDX1(也稱為STF小IDX-1和IPF-1)是胰和喙十二指腸(rostralduodenum)發(fā)育必需的轉(zhuǎn)錄因子。PDX1首先在胰內(nèi)胚層表達，胰內(nèi)胚層來自后部前腸內(nèi)胚層，產(chǎn)生外分泌和內(nèi)分泌細胞，在小鼠中開始于E8.5。其后，PDX1限定于內(nèi)分泌胰腺的β-細胞和一些δ-細胞。這種表達模式在成年后也保持。發(fā)育早期PDX1也在鄰近形成中的胰的十二指腸內(nèi)胚層表達，然后在十二指腸的腸細胞和腸內(nèi)分泌細胞、胃竇及膽總管、膽囊和膽管中表達。在胰表達受限時，這個表達區(qū)域主要限于喙十二指腸。
PDX1陽性細胞和與其相關的步驟本文描述的其它分化方法的實施方案涉及產(chǎn)生PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的新的確定的方法，其中PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是多潛能細胞，能夠分化為衍生自腸管的前腸/中腸區(qū)域(PDX1-陽性前腸/中腸內(nèi)胚層)的細胞、組織或器官。一些優(yōu)選的實施方案涉及產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的方法。在一些實施方案中，這些PDX1陽性內(nèi)胚層細胞是多潛能細胞，能夠分化為衍生自腸管前部(PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層)的細胞、組織或器官。其他優(yōu)選的實施方案涉及產(chǎn)生腸管后部的PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的方法。在一些實施方案中，這些PDX1陽性內(nèi)胚層細胞是多潛能細胞，能夠分化為衍生自腸管的前腸區(qū)域的后部的細胞、組織或器官。
PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞，例如那些根據(jù)此處描述的方法產(chǎn)生的細胞，可用于產(chǎn)生完全分化的產(chǎn)生胰島素的β細胞。一些實施方案中，通過分化基本上不表達PDX1的定形內(nèi)胚層細胞(PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞；此處也指定形內(nèi)胚層)產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。可使用此處描述的方法或其他任何已知方法分化多能性細胞(如胚胎干細胞)來制備PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞。2004年12月23日提交的標題為“定形內(nèi)胚層”的第11/021,618號美國專利申請描述了一種從多能性細胞方便高效產(chǎn)生PDX1-陰性定形內(nèi)胚層的方法。
產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的方法為從多能性細胞高效產(chǎn)生胰腺組織(如腺泡細胞、導管細胞和胰島細胞)提供了基礎。在某些優(yōu)選實施方案中，人PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞衍生自人PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞，而這些細胞又衍生自hESC。然后這些人PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞被用于產(chǎn)生功能性的產(chǎn)生胰島素的β-細胞。為得到有效量的產(chǎn)生的胰島素β細胞，希望在分化為胰島/β-細胞終點前每個分化步驟都有高分化效率。因為PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化代表產(chǎn)生功能性胰島/β-細胞的一個早期步驟(如圖1所示)，尤其希望在這一步具有高分化效率。
考慮到需要PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的有效分化，本發(fā)明的一些方面涉及體外方法學，它會導致約2％-25％的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞轉(zhuǎn)化。典型地，該方法包括以確定的和短暫特定的方式使用培養(yǎng)基和生長因子條件。通過使用與PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞特異結(jié)合的試劑從細胞群中的其他細胞中分離和/或純化PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞，可進一步在細胞群中富集PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞?；蛘撸琍DX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可用諸如綠色熒光蛋白(GFP)的報告基因標記，以使得能夠檢測PDX1表達。這種熒光標記的細胞可用熒光激活細胞分選術(FACS)純化。本發(fā)明更深入的方面涉及細胞培養(yǎng)物和包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的富集的細胞群，以及鑒定在向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層和從PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層分化中有用的因子。
為測定細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的數(shù)量，需要一種在培養(yǎng)物或細胞群中從其他細胞區(qū)分這種細胞類型的方法。相應地，本發(fā)明的某些實施方案涉及細胞標志物及檢測和確定這些標志物表達的方法，這些標志物的存在與否和/或相對表達水平是PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的指示。
本發(fā)明所述的一些實施方案中，用定量PCR(Q-PCR)測定標志物的存在與否和/或表達水平。例如，某些遺傳標志物，如PDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α-甲胎蛋白(AFP)、同源框A13(HOXA13)、同源框C6(HOXC6)和/或此處描述的其他標志物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量用Q-PCR確定。其他實施方案中，用免疫組化方法檢測上述基因表達的蛋白。在其他實施方案中，使用Q-PCR和免疫組化兩種方法鑒定和檢測這些標志物的量和相對比例。
使用此處描述的分化和檢測方法就可能在細胞培養(yǎng)物或細胞群中鑒定PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞以及確定這些細胞的比例。例如，本發(fā)明一些實施方案中，產(chǎn)生的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞或細胞群表達PDX1基因的水平比PDX1-陰性細胞或細胞群高至少約2個數(shù)量級。其他實施方案中，產(chǎn)生的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞和細胞群表達PDX1基因的水平比PDX1-陰性細胞或細胞群高2個以上數(shù)量級。在其他實施方案中，產(chǎn)生的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞或細胞群表達一種或多種選自PDX1、SOX17、HOXA13和HOXC6的標志物的水平比PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞高約2個或2個以上數(shù)量級。
此處描述的組合物和方法有幾個有用的特性。例如，包含PDX1-陽性內(nèi)胚層的細胞培養(yǎng)物和細胞群以及產(chǎn)生該細胞培養(yǎng)物和細胞群的方法有利于模擬人發(fā)育的早期階段。此外，此處描述的組合物與方法也可用于疾病狀態(tài)(如糖尿病)的治療性干預。例如，因為PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層用作有限數(shù)量組織的來源，它可被用于發(fā)育純的組織或細胞類型。
從PDX1-陰性定形內(nèi)胚層產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層此處描述的包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物和細胞群由PDX1-陰性定形內(nèi)胚層產(chǎn)生，其中該PDX1-陰性定形內(nèi)胚層如上所述由多能性細胞產(chǎn)生。一個優(yōu)選的方法利用人胚胎干細胞作為起始材料。在一個實施方案中，hESC首先轉(zhuǎn)化為PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞，然后轉(zhuǎn)化為PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。但應了解用于PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞產(chǎn)生的起始材料并不限于用多能性細胞分化方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細胞。而且，任何PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞都可用于此處描述的方法，與它們的來源無關。
本發(fā)明一些實施方案中，包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群可用于進一步向包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和/或富集的細胞群分化。例如，可使用包含人PDX1-陰性、SOX17-陽性的定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。在一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群可能包含從前面分化步驟(即分化多能性細胞為定形內(nèi)胚層細胞的步驟)保留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其他實施方案中，在添加用于PDX1-陰性、SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的因子前，從細胞培養(yǎng)物或細胞群中去除前面分化步驟中的因子。其他實施方案中，用富集PDX1-陰性、SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞的細胞群作為產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的來源。
通過向包含PDX1-陰性、SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物中添加促進細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的分化因子(前腸分化因子)，培養(yǎng)基中的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞可分化為PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞。本發(fā)明一些實施方案中，前腸分化因子是類視黃醇，例如視黃酸(RA)。一些實施方案中，類視黃醇與成纖維細胞生長因子(例如FGF-4和FGF-10)聯(lián)合使用。其他實施方案中，類視黃醇與生長因子TGFβ超家族成員和/或條件培養(yǎng)基聯(lián)合使用。
如之前所定義的，“條件培養(yǎng)基”是指與基本培養(yǎng)基比較發(fā)生了改變的培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基的條件化可能造成從培養(yǎng)基的初始水平添加或去除分子，例如營養(yǎng)物和/或生長因子。在一些實施方案中，通過在一定條件下使一定類型的細胞在培養(yǎng)基中生長或維持一定時間段而使培養(yǎng)基條件化。例如，通過使hESC在一定溫度、一定組成的培養(yǎng)基中擴增、分化或維持一定的時間而使培養(yǎng)基條件化。本領域技術人員應了解的是，細胞、培養(yǎng)基類型、持續(xù)時間和環(huán)境條件的眾多組合可用于產(chǎn)生接近無窮排列的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的一些實施方案中，通過在包含約1％至約20％血清濃度的培養(yǎng)基中生長或維持分化的多能性細胞來條件化培養(yǎng)基。在其他實施方案中，通過使分化的多能性細胞在包含約1ng/ml至約1000ng/ml活化素A的培養(yǎng)基中的生長或維持來條件化培養(yǎng)基。在其他實施方案中，通過使分化的多能性細胞在包含約1ng/ml至約1000ng/ml BMP4的培養(yǎng)基中生長或維持來條件化培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實施方案中，通過使分化的hESC在包含約25ng/ml活化素A和約2μM RA的培養(yǎng)基(如RPMI)中生長或維持來制備條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的一些實施方案中，用于條件化培養(yǎng)基(這些培養(yǎng)基用于增強PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層的分化)的細胞是在含約0％至約20％血清和/或一種或多種TGFβ超家族生長/分化因子的培養(yǎng)基(例如RPMI)中從多能性細胞(如hESC)分化超過5天的細胞。添加分化因子(例如活化素A和BMP4)的濃度范圍從約1ng/ml至約1000ng/ml。本發(fā)明的某些實施方案中，用于條件化培養(yǎng)基的細胞在低血清RPMI中從hESC分化超過5天。根據(jù)一些實施方案，低血清RPMI指含有低血清的培養(yǎng)基，其中血清濃度在一定時間段內(nèi)逐漸增加。例如，在一個實施方案中，低血清RPMI在細胞生長第一天包含濃度約0.2％的胎牛血清(FBS)，細胞生長第二天約0.5％FBS，細胞生長第3至5天約2％FBS。在另一個實施方案中，低血清RPMI第一天包含血清濃度約0％，第二天約0.2％，第3-6天約2％。在某些優(yōu)選的實施方案中，低血清RPMI中添加一種或多種分化因子，方案如活化素A和BMP4。除了制備用于條件化培養(yǎng)基的細胞，低血清RPMI也可用作PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的培養(yǎng)基。
本領域的普通技術人員應了解用于制備條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基不只是RPMI，前提是這種培養(yǎng)基不干擾PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的生長或維持。還應了解用于條件化培養(yǎng)基的細胞可以是不同的類型。在使用新鮮分化的細胞來條件化培養(yǎng)基的實施方案中，這種細胞可以在不同于RPMI的培養(yǎng)基中分化，前提是這種培養(yǎng)基不會抑制這種細胞的生長或維持。此外，技術人員應了解條件化的持續(xù)時間或制備用于條件化的細胞的持續(xù)時間不是分別必須是24小時或5天，因為其他的時間長度也足以獲得此處報道的效果。
通常，類視黃醇與成纖維細胞生長因子(生長因子TGFβ超家族的成員)、條件培養(yǎng)基或任意這些前腸分化因子的組合聯(lián)合使用，都可以造成比單用類視黃醇更強的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層的分化。在優(yōu)選的實施方案中，添加RA和FGF-10到PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞在含有條件培養(yǎng)基、活化素A、活化素B和RA的培養(yǎng)基中分化。
就此處描述的分化方法的一些實施方案而論，將上述前腸分化因子添加到細胞中，使細胞培養(yǎng)物或細胞群中前腸分化因子的濃度足以促進至少部分PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物或細胞群向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化。如之前所定義的，當涉及細胞培養(yǎng)物和/或細胞群時，術語“部分”表示細胞培養(yǎng)物或細胞群任意不為零的數(shù)量，范圍從單個細胞到整個細胞培養(yǎng)物或細胞群。
本發(fā)明的一些實施方案中，向培養(yǎng)物的細胞中添加類視黃醇使其濃度至少約0.01μM、至少約0.02μM、至少約0.04μM、至少約0.08μM、至少約0.1μM、至少約0.2μM、至少約0.3μM、至少約0.4μM、至少約0.5μM、至少約0.6μM、至少約0.7μM、至少約0.8μM、至少約0.9μM、至少約1μM、至少約1.1μM、至少約1.2μM、至少約1.3μM、至少約1.4μM、至少約1.5μM，、至少約1.6μM、至少約1.7μM、至少約1.8μM、至少約1.9μM、至少約2μM、至少約2.1μM、至少約2.2μM、至少約2.3μM、至少約2.4μM、至少約2.5μM、至少約2.6μM、至少約2.7μM、至少約2.8μM、至少約2.9μM、至少約3μM、至少約3.5μM、至少約4μM、至少約4.5μM、至少約5μM、至少約10μM、至少約20μM、至少約30μM、至少約40μM或至少約50μM。此處使用的“類視黃醇”指視黃醇、視黃醛或視黃酸以及這些化合物的任何衍生物。在優(yōu)選的實施方案中，類視黃醇是視黃酸。
本發(fā)明其他實施方案中，細胞培養(yǎng)物中存在一種或多種成纖維細胞生長因子家族的分化因子。例如，在一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物中FGF-4的濃度至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml或至少約1000ng/ml。本發(fā)明進一步實施方案中，細胞培養(yǎng)物中FGF-10的濃度至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、或至少約1000ng/ml。在一些實施方案中，從FGF-4和FGF-10中選擇一個與RA一起添加到細胞培養(yǎng)物中。優(yōu)選的實施方案中，細胞培養(yǎng)物中RA濃度為1μM，F(xiàn)GF-10濃度為50ng/ml。
本發(fā)明所述方法的一些實施方案中，在細胞培養(yǎng)物中存在TGFβ超家族的生長因子和/或條件培養(yǎng)基。這些分化因子可與RA和/或其它中前腸分化因子(包括但不限于FGF-4和FGF-10)聯(lián)合使用。例如，在一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物中可存在活化素A和/或活化素B，其濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml或至少約1000ng/ml。本發(fā)明的另一實施方案中，細胞培養(yǎng)物中存在條件培養(yǎng)基，其濃度是總培養(yǎng)基的至少約1％、至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或至少約100％。一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物中添加有活化素A、活化素B以及條件培養(yǎng)基和RA。在優(yōu)選實施方案中，在包含1μM RA、約25ng/ml活化素A和低血清RPMI培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已被分化的hESC條件化約24小時，其中分化的hESC已在包含100ng/ml活化素A的低血清RPMI中分化約5天)的培養(yǎng)物中PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞分化為PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。在另一優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)物中還存在活化素B和/或FGF-10，其濃度分別是25ng/ml和50ng/ml。
本發(fā)明的某些實施方案中，上述前腸分化因子在添加后從細胞培養(yǎng)物去除。例如，前腸分化因子可以在添加后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天內(nèi)去除。
PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可在含有降低血清濃度的培養(yǎng)基中生長。血清濃度范圍可從約0.05％(v/v)至約20％(v/v)。在一些實施方案中，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞生長在含血清替代物的條件下。例如，在某些實施方案中，培養(yǎng)基的血清濃度可低于約0.05％(v/v)、低于約0.1％(v/v)、低于約0.2％(v/v)、低于約0.3％(v/v)、低于約0.4％(v/v)、低于約0.5％(v/v)、低于約0.6％(v/v)、低于約0.7％(v/v)、低于約0.8％(v/v)、低于約0.9％(v/v)、低于約1％(v/v)、低于約2％(v/v)、低于約3％(v/v)、低于約4％(v/v)、低于約5％(v/v)、低于約6％(v/v)、低于約7％(v/v)、低于約8％(v/v)、低于約9％(v/v)、低于約10％(v/v)、低于約15％(v/v)或低于約20％(v/v)。在一些實施方案中，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可以在無血清的條件下生長。在其他實施方案中，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞在含血清替代物的條件下生長。
在其他實施方案中，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞在B27存在下生長。在這些實施方案中，B27可以從約0.1％(v/v)至約20％(v/v)的濃度范圍或者大于20％(v/v)的濃度添加到培養(yǎng)基中。在某些實施方案中，培養(yǎng)基中B27的濃度約0.1％(v/v)、約0.2％(v/v)、約0.3％(v/v)、約0.4％(v/v)、約0.5％(v/v)、約0.6％(v/v)、約0.7％(v/v)、約0.8％(v/v)、約0.9％(v/v)、約1％(v/v)、約2％(v/v)、約3％(v/v)、約4％(v/v)、約5％(v/v)、約6％(v/v)、約7％(v/v)、約8％(v/v)、約9％(v/v)、約10％(v/v)、約15％(v/v)或約20％(v/v)?；蛘?，添加的B27添加物的濃度可根據(jù)商品化的B27存儲液濃度的倍數(shù)來計算。例如，Invitrogen(Carlsbad，CA)提供50×的B27存儲液。向足夠體積的生長培養(yǎng)基中添加足量這種存儲液可以產(chǎn)生含所需量B27的培養(yǎng)基。例如，向90ml生長培養(yǎng)基中添加10ml 50×B27存儲液將得到添加了5×B27的生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中B27添加物的濃度可以是約0.1×、約0.2×、約0.3×、約0.4×、約0.5×、約0.6×、約0.7×、約0.8×、約0.9×、約1×、約1.1×、約1.2×、約1.3×、約1.4×、約1.5×、約1.6×、約1.7×、約1.8×、約1.9×、約2×、約2.5×、約3×、約3.5×、約4×、約4.5×、約5×、約6×、約7×、約8×、約9×、約10×、約11×、約12×、約13×、約14×、約15×、約16×、約17×、約18×、約19×、約20×和高于約20×。
監(jiān)控PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層的分化如同多能性細胞向定形內(nèi)胚層細胞分化的情況，PDX1-陰性、SOX17-陽性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層分化的進程可通過測定這些細胞類型特征性的標志物的表達來監(jiān)控。這種監(jiān)控使得能決定在不同條件下(例如一種或多種分化因子濃度和環(huán)境條件)足以產(chǎn)生所需量PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層需要的時間。優(yōu)選的實施方案中，通過檢測PDX1的表達來決定足以產(chǎn)生所需量PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層所需的時間。本發(fā)明的一些實施方案中，通過檢測標志物的存在與否來測定某些標志物的表達?；蛘撸ㄟ^測定細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞中標志物存在的水平來測定某些標志物的表達。在這些實施方案中，標志物表達的測量可以是定性或定量的。如上所述，優(yōu)選的定量檢測由標志物基因產(chǎn)生的標志物表達的方法是使用Q-PCR。在具體實施方案中，Q-PCR被用于通過定量檢測PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層特征性的標志物基因的表達和其他細胞類型特征性的標志物基因表達的缺失，來監(jiān)控PDX1-陰性、SOX17-陽性定形內(nèi)胚層培養(yǎng)物向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的進程。也可以用本領域其他公知的方法定量檢測標志物基因表達。例如，可利用對感興趣的標志物基因產(chǎn)物特異的抗體來檢測標志物基因產(chǎn)物的表達。本發(fā)明一些實施方案中，測定了PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層特征性的標志物基因的表達以及PDX-1陰性定形內(nèi)胚層、hESC和其他細胞類型特征性的標志物基因的顯著表達的缺失。
如以下實施方案的進一步描述，PDX1是與PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層相關的標志物基因。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中測定了PDX1的表達。在其他實施方案中，也測定了在PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層表達的其他標志物的表達，這些標志物包括但不限于SOX17、HOXA13和/或HOXC6。因為某些其他細胞類型(即內(nèi)臟內(nèi)胚層和某些神經(jīng)外胚層)也表達PDX1，所以本發(fā)明一些實施方案涉及證明與內(nèi)臟內(nèi)胚層和/或神經(jīng)外胚層有關的基因表達的缺失或基本上缺失。例如，在一些實施方案中，在內(nèi)臟內(nèi)胚層和/或神經(jīng)外胚層表達的標志物(包括但不限于SOX7、AFP、SOX1、ZIC1和/或NFM)的表達被測定。
在一些實施方案中，用此處所述方法產(chǎn)生的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物基本上不含表達SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM標志物基因的細胞。在某些實施方案中，用此處所述步驟產(chǎn)生的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物基本上不含內(nèi)臟內(nèi)胚層、體壁內(nèi)胚層和/或神經(jīng)細胞。
PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層的富集、分離和/或純化根據(jù)本發(fā)明的其他方面，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可以被富集、分離和/或純化。本發(fā)明的一些實施方案中，富集PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞群通過從細胞培養(yǎng)物中分離這種細胞來產(chǎn)生。
本發(fā)明的一些實施方案中，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞用熒光標記，然后用熒光激活細胞分選器(FACS)來與未標記細胞分離。在這類實施方案中，用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核苷酸或另一編碼可表達熒光標志物基因的核苷酸標記PDX1-陽性細胞。例如，在一些實施方案中，至少一個拷貝的編碼GFP或其生物學活性片段的核苷酸被導入多能性細胞(優(yōu)選的是人胚胎干細胞)PDX1啟動子的下游，以便GFP基因產(chǎn)物或其生物學活性片段的表達受PDX1啟動子的控制。在一些實施方案中，編碼PDX1的核苷酸的整個編碼區(qū)域被編碼GFP或其生物學活性片段的核苷酸替換。在其他實施方案中，編碼GFP或其生物學活性片段的核苷酸與編碼PDX1的核苷酸的至少一部分進行框內(nèi)(inframe)融合，從而產(chǎn)生融合蛋白。在這類實施方案中，融合蛋白保留與GFP相似的熒光能力。
如上所述，熒光標記的細胞(例如上述的多能性細胞)分化為定形內(nèi)胚層，然后是PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層。因為PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞表達熒光標志物基因，而PDX1-陰性細胞不表達，這兩種細胞類型可被分離。在一些實施方案中，用FACS分選包含熒光標記的PDX1-陽性細胞和未標記的PDX1-陰性細胞的混合物的細胞懸浮物。PDX1陽性細胞從PDX1-陰性細胞分離后收集，從而分離這種細胞類型。如果需要，可使用相同的或不同的對PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層特異的標志物增加分選次數(shù)，以進一步純化分離的細胞組合物。
除了剛剛描述的步驟，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞也可用細胞分離的其他技術進行分離。此外，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞也可使用在促進上述PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞選擇性存活或選擇性擴增的生長條件下進行系列傳代培養(yǎng)的方法富集或分離定形內(nèi)胚層細胞。
應了解上述富集、分離和純化步驟可用于這類培養(yǎng)物的任意分化階段。
使用此處描述的方法，富集的、分離的和/或純化的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的群和/或組織可在體外從已經(jīng)進行至少部分分化的PDX1-陰性、SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)物或細胞群得到。在一些實施方案中，細胞進行隨機分化。但在優(yōu)選的實施方案中，細胞主要定向分化為PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外從人胚胎干細胞產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。
使用此處描述的方法，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，細胞群或細胞培養(yǎng)物中的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞含量可被富集至少約2至約1000倍。一些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可被富集至少約5至約500倍。其他實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可被富集至少約10至約200倍。其他實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可被富集至少約20至約100倍。其他實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可被富集至少約40至約80倍。某些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞可被富集至少約2至約20倍。
包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層的組合物本發(fā)明的一些實施方案涉及包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞是多潛能細胞(PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層)，可以分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官。根據(jù)某些實施方案，PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層是哺乳動物細胞，在優(yōu)選實施方案中，這些細胞是人細胞。
本發(fā)明的其他實施方案涉及包含一種或多種選自hESC、PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞、PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞和中胚層細胞的細胞類型的細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群。一些實施方案中，培養(yǎng)物中hESC少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的全部細胞。其他實施方案中，培養(yǎng)物中PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞少于約90％、少于約85％、少于約80％、少于約75％、少于約70％、少于約65％、少于約60％、少于約55％、少于約50％、少于約45％、少于約40％、少于約35％、少于約30％、少于約25％、少于約20％、少于約15％、少于約12％、少于約10％、少于約8％、少于約6％、少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的全部細胞。其他實施方案中，培養(yǎng)物中中胚層細胞少于約90％、少于約85％、少于約80％、少于約75％、少于約70％、少于約65％、少于約60％、少于約55％、少于約50％、少于約45％、少于約40％、少于約35％、少于約30％、少于約25％、少于約20％、少于約15％、少于約12％、少于約10％、少于約8％、少于約6％、少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的全部細胞。
本發(fā)明的其他實施方案涉及用此處描述的方法產(chǎn)生的包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層作為主要細胞類型的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群。一些實施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生包含至少約99％、至少約98％、至少約97％、至少約96％、至少約95％、至少約94％、至少約93％、至少約92％、至少約91％、至少約90％、至少約85％、至少約80％、至少約75％、至少約70％、至少約65％、至少約60％、至少約55％、至少約54％、至少約53％、至少約52％或至少約51％的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和/或細胞群。優(yōu)選的實施方案中、細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞包含人細胞。其他實施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生包含至少約50％、至少約45％、至少約40％、至少約35％、至少約30％、至少約25％、至少約24％、至少約23％、至少約22％、至少約21％、至少約20％、至少約19％、至少約18％、至少約17％、至少約16％、至少約15％、至少約14％、至少約13％、至少約12％、至少約11％、至少約10％、至少約9％、至少約8％、至少約7％、至少約6％、至少約5％、至少約4％、至少約3％、至少約2％或至少約1％的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物和/或細胞群。優(yōu)選實施方案中，細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞包含人細胞。一些實施方案中，計算細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的比例時不考慮殘留在培養(yǎng)物中的飼養(yǎng)細胞。
本發(fā)明的其他實施方案涉及包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞和PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞的混合物的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含約每95個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約5個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。其他實施方案中，能夠產(chǎn)生包含約每5個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約95個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群。此外，預期可以得到包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞和PDX1-陰性定形內(nèi)胚層其他比例的細胞培養(yǎng)物或細胞群。例如，預期可以得到包含約每1,000,000個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每100,000個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每10,000個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1000個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每500個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每100個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每10個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每5個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每4個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每2個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約2個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約4個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約5個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約10個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約20個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約50個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約100個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1000個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約10,000個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約100,000個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞、和約每1個PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞對應至少約1,000,000個PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的組合物。
本發(fā)明一些實施方案中，用于產(chǎn)生PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞衍生自人多能性細胞，例如人多能性干細胞。某些實施方案中，人多能性細胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細胞團或胚胎生殖嵴。某些其他實施方案中，人多能性細胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過胚胎期的多細胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。
本發(fā)明的進一步實施方案涉及包含人細胞(包括人PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約2％的人細胞中PDX1標志物的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。其他實施方案中，至少5％的人細胞中、至少10％的人細胞中、至少15％的人細胞中、至少20％的人細胞中、至少25％的人細胞中、至少30％的人細胞中、至少35％的人細胞中、至少40％的人細胞中、至少45％的人細胞中、至少50％的人細胞中、至少55％的人細胞中、至少60％的人細胞中、至少65％的人細胞中、至少70％的人細胞中、至少75％的人細胞中、至少80％的人細胞中、至少85％的人細胞中、至少90％的人細胞中、至少95％的人細胞中或至少98％的人細胞中，PDX1標志物的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。一些實施方案中，計算細胞培養(yǎng)物或群中人細胞(其中PDX1的表達高于AFP、SOX7、SOX1，ZIC1和/或NFM的表達)的比例時不考慮飼養(yǎng)細胞。
應了解本發(fā)明的一些實施方案涉及包含人PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中從至少約2％到超過約98％的人細胞中一種或多種選自SOX17、HOXA13或HOXC6的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。一些實施方案中，至少約5％的人細胞中、至少約10％的人細胞中、至少約15％的人細胞中、至少約20％的人細胞中、至少約25％的人細胞中、至少約30％的人細胞中、至少約35％的人細胞中、至少約40％的人細胞中、至少約45％的人細胞中、至少約50％的人細胞中、至少約55％的人細胞中、至少約60％的人細胞中、至少約65％的人細胞中、至少約70％的人細胞中、至少約75％的人細胞中、至少約80％的人細胞中、至少約85％的人細胞中、至少約90％的人細胞中、至少約95％的人細胞中或至少約98％的細胞中，一種或多種選自SOX17、HOXA13或HOXC6的表達高于AFP、SOX7、SOX1，ZIC1和/或NFM的表達。一些實施方案中，計算細胞培養(yǎng)物或群中人細胞(一種或多種選自SOX17、HOXA13或HOXC6的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表達)的比例時不考慮飼養(yǎng)細胞。
本發(fā)明的其他實施方案涉及包含哺乳動物內(nèi)胚層細胞(例如人內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約2％的內(nèi)胚層細胞中PDX1標志物的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。其他實施方案中，至少約5％的內(nèi)胚層細胞中、至少約10％的內(nèi)胚層細胞中、至少約15％的內(nèi)胚層細胞中、至少約20％的內(nèi)胚層細胞中、至少約25％的內(nèi)胚層細胞中、至少約30％的內(nèi)胚層細胞中、至少約35％的內(nèi)胚層細胞中、至少約40％的內(nèi)胚層細胞中、至少約45％的內(nèi)胚層細胞中、至少約50％的內(nèi)胚層細胞中、至少約55％的內(nèi)胚層細胞中、至少約60％的內(nèi)胚層細胞中、至少約65％的內(nèi)胚層細胞中、至少約70％的內(nèi)胚層細胞中、至少約75％的內(nèi)胚層細胞中、至少約80％的內(nèi)胚層細胞中、至少約85％的內(nèi)胚層細胞中、至少約90％的內(nèi)胚層細胞中、至少約95％的內(nèi)胚層細胞中或至少約98％的內(nèi)胚層細胞中，PDX1標志物的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。
本發(fā)明的其他實施方案涉及包含哺乳動物內(nèi)胚層細胞(例如人內(nèi)胚層細胞)的組合物，例如細胞培養(yǎng)物或細胞群，其中至少約2％的胚胎細胞中一種或多種選自SOX17、HOXA13和HOXC6的標志物的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。其他實施方案中，至少約5％的內(nèi)胚層細胞中、至少約10％的內(nèi)胚層細胞中、至少約15％的內(nèi)胚層細胞中、至少約20％的內(nèi)胚層細胞中、至少約25％的內(nèi)胚層細胞中、至少約30％的內(nèi)胚層細胞中、至少約35％的內(nèi)胚層細胞中、至少約40％的內(nèi)胚層細胞中、至少約45％的內(nèi)胚層細胞中、至少約50％的內(nèi)胚層細胞中、至少約55％的內(nèi)胚層細胞中、至少約60％的內(nèi)胚層細胞中、至少約65％的內(nèi)胚層細胞中、至少約70％的內(nèi)胚層細胞中、至少約75％的內(nèi)胚層細胞中、至少約80％的內(nèi)胚層細胞中、至少約85％的內(nèi)胚層細胞中、至少約90％的內(nèi)胚層細胞中、至少約95％的內(nèi)胚層細胞中或至少約98％的內(nèi)胚層細胞中，一種或多種選自SOX17、HOXA13和HOXC6的標志物的表達高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。
使用此處描述的方法，可產(chǎn)生基本上不含其他細胞類型的包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的組合物。本發(fā)明的一些實施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生的PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞群或細胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標志物基因的細胞。
本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)標志物基因的表達對PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的描述如下PDX1高、AFP低、SOX7低、SOX1低、ZIC1低和NFM低。
增加SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞中PDX1的表達本發(fā)明所述方法的一些方面涉及增加包含SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1基因產(chǎn)物表達的方法。在這類實施方案中，向SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞中添加足以增加PDX1基因產(chǎn)物表達量的分化因子。與分化因子接觸的SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞可以是PDX1-陰性或PDX1-陽性。在一些實施方案中，分化因子可以是類視黃醇。某些實施例中，使SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞與濃度范圍約0.01μM至約50μM的類視黃醇接觸。在優(yōu)選的實施方案中，所述類視黃醇是RA。
在本發(fā)明所述方法的其他實施方案中，通過使SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞與成纖維細胞生長因子家族的分化因子接觸來增加包含SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1基因產(chǎn)物的表達。這類分化因子可單獨使用或與RA聯(lián)合使用。一些實施方案中，使SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞與濃度范圍約10ng/ml至約1000ng/ml的成纖維細胞生長因子接觸。一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)GF生長因子是FGF-10。
本發(fā)明的一些實施方案中，通過使SOX17-陽性細胞與B27接觸來增加包含SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1基因產(chǎn)物的表達。這類分化因子可以單獨使用或與FGF家族分化因子和類視黃醇中的一種或兩種聯(lián)合使用。一些實施方案中，使SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞與濃度范圍約0.1％(v/v)至約20％(v/v)的B27接觸。在優(yōu)選的實施方案中，使SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞與RA、FGF-10和B27接觸。
增加包含SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1基因產(chǎn)物表達的方法可在降低血清濃度或無血清的生長培養(yǎng)基中進行。一些實施方案中，血清濃度范圍從約0.05％(v/v)至約20％(v/v)。一些實施方案中，SOX17-陽性定形內(nèi)胚層細胞在含血清替代物的條件下生長。
能夠促進定型內(nèi)胚層細胞分化的因子的鑒定本文所述的某些篩選方法涉及鑒定至少一種能夠促進定型內(nèi)胚層細胞分化的因子的方法。這些方法的一些實施方案中，獲得包含定型內(nèi)胚層細胞(如人定型內(nèi)胚層細胞)的細胞群。向細胞群提供候選分化因子。在第一時間點，即在向細胞群提供候選分化因子之前或大約同時，確定標志物的表達?；蛘撸梢栽谙蚣毎禾峁┖蜻x分化因子之后確定標志物的表達。在第二時間點，即在第一時間點和向細胞群提供候選分化因子的步驟之后，確定同一標志物的表達。通過比較標志物在第一時間點和第二時間點的表達確定候選分化因子是否能夠促進定型內(nèi)胚層細胞的分化。如果標志物在第二時間點的表達與其在第一時間點的表達相比增加或減少，則候選分化因子能夠促進定型內(nèi)胚層細胞的分化。
本文所述篩選方法的一些實施方案使用包含人定型內(nèi)胚層細胞的細胞群或細胞培養(yǎng)物。例如，該細胞群可以是基本上純的人定型內(nèi)胚層細胞群。或者，該細胞群可以是富集的人定型內(nèi)胚層細胞群，其中細胞群中至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％或多于至少約97％的人細胞是人定型內(nèi)胚層細胞。本發(fā)明的其它實施方案中，細胞群包含人細胞，其中至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％或多于至少約85％的人細胞是人定型內(nèi)胚層細胞。一些實施方案中，細胞群包含非人細胞，如非人飼養(yǎng)細胞。其它實施方案中，細胞群包含人飼養(yǎng)細胞。在這些實施方案中，除所述飼養(yǎng)細胞外，至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或多于至少約95％的人細胞是人定型內(nèi)胚層細胞。本文描述的篩選方法的一些實施方案中，細胞群進一步包含PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞，其包括但不限于PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。
本文所述的篩選方法的實施方案中，使細胞群接觸或向其提供候選(測試)分化因子。候選分化因子可以包含可能促進人定型內(nèi)胚層細胞分化的任何分子。本文描述的一些實施方案中，候選分化因子包含已知是一種或多種類型細胞的分化因子的分子。其它實施方案中，候選分化因子包含未知能促進細胞分化的分子。優(yōu)選實施方案中，候選分化因子包含未知的能促進人定型內(nèi)胚層細胞分化的分子。
本文所述的篩選方法的一些實施方案中，候選分化因子包括小分子。優(yōu)選實施方案中，小分子是分子量約為或低于10,000amu的分子。一些實施方案中，小分子包含類視黃醇。一些實施方案中，小分子包含視黃酸。
本文所述的其它實施方案中，候選分化因子包含多肽。該多肽可以是包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、細胞因子、趨化因子、肽類激素、白介素或生長因子的任何多肽。優(yōu)選的多肽包括生長因子。一些優(yōu)選實施方案中，候選分化因子包含一種或多種選自FGF10、FGF4、FGF2和Wnt3B的生長因子。
本文所述篩選方法的一些實施方案中，候選分化因子包含一種或多種選自雙調(diào)蛋白、B-淋巴細胞刺激因子、IL-16、胸腺生成素、TRAIL/Apo-2、前B細胞集落增強因子、內(nèi)皮分化相關因子1(EDF1)、內(nèi)皮單核細胞活化多肽II、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、自然殺傷細胞增強因子(NKEFA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神經(jīng)內(nèi)分泌分化因子)、細胞因子A3(巨噬細胞炎性蛋白1-α)、神經(jīng)膠母細胞分化相關蛋白(GBDR1)、肝癌衍生生長因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽U-25前體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)、T細胞特異RANTES前體、胸腺樹突狀細胞衍生因子1、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白介素-1(IL 1)、白介素-2(IL 2)、白介素-3(IL 3)、白介素-4(IL 4)、白介素-5(IL 5)、白介素6(IL-6)、白介素-7(IL 7)、白介素-8(IL 8)、白介素-9(IL 9)、白介素-10(IL 10)、白介素-11(IL 11)、白介素-12(IL 12)、白介素-13(IL 13)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、紅細胞生成素、血小板生成素、維生素D3、表皮生長因子(EGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、甲狀腺激素、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、aFGF、FGF-4、FGF-6、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板衍生生長因子BB、β神經(jīng)生長因子、活化素A、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、爆裂刺激活性物(BPA)、紅細胞系刺激活性物(EPA)、PGE2、胰島素生長因子(IGF-1)、IGF-II、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)源性連接蛋白(Glial-derivednexin)、地塞米松(Dexamethasone)、β-巰基乙醇、視黃酸、叔丁對甲氧酚、5-氮雜胞苷、兩性霉素B、抗壞血酸、抗壞血酸鹽、異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸鹽、煙酰胺、DMSO、噻唑烷二酮類、TWS119、催產(chǎn)素、血管升壓素、促黑素細胞激素、促皮質(zhì)激素、促脂解素、促甲狀腺素、生長激素、促乳素、黃體生成素、人絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促性腺激素釋放因子、促乳素釋放因子、促乳素抑制因子、生長激素釋放因子、促生長素抑制素、促甲狀腺素釋放因子、降鈣素基因相關肽、甲狀旁腺激素、胰高血糖素樣肽、葡萄糖依賴性促胰島多肽、胃泌素、腸促胰液素、縮膽囊素、促胃動素、血管活性腸肽、P物質(zhì)、胰多肽、酪酪肽、酪神經(jīng)肽(神經(jīng)肽Y，neuropeptide tyrosine)、胰島素、胰高血糖素、胎盤促乳素、松弛素、血管緊張素II、鈣三醇、心房鈉尿肽、褪黑激素、甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、降鈣素、雌二醇、雌酮、孕酮、睪酮、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、醛固酮、腎上腺素、去甲腎上腺素、雄甾烯(androstene)、鈣三醇、膠原蛋白、地塞米松、β-巰基乙醇、視黃酸、叔丁對甲氧酚、5-氮雜胞苷、兩性霉素B、抗壞血酸、抗壞血酸鹽、異丁基黃嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸鹽、煙酰胺、DMSO、噻唑烷二酮和TWS119的生長因子。
本文所述篩選方法的一些實施方案中，以一個或多個濃度向細胞群提供候選分化因子。一些實施方案中，向細胞群提供候選分化因子使圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約0.1ng/ml到約10ng/ml。一些實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約1ng/ml到約1mg/ml。其它實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約10ng/ml到約100μg/ml。其它實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度范圍為從約100ng/ml到約10μg/ml。優(yōu)選實施方案中，圍繞細胞的培養(yǎng)基中候選分化因子的濃度為約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約75ng/ml、約100ng/ml、約125ng/ml、約150ng/ml、約175ng/ml、約200ng/ml、約225ng/ml、約250ng/ml、約275ng/ml、約300ng/ml、約325ng/ml、約350ng/ml、約375ng/ml、約400ng/ml、約425ng/ml、約450ng/ml、約475ng/ml、約500ng/ml、約525ng/ml、約550ng/ml、約575ng/ml、約600ng/ml、約625ng/ml、約650ng/ml、約675ng/ml、約700ng/ml、約725ng/ml、約750ng/ml、約775ng/ml、約800ng/ml、約825ng/ml、約850ng/ml、約875ng/ml、約900ng/ml、約925ng/ml、約950ng/ml、約975ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml、約10μg/ml、約11μg/ml、約12μg/ml、約13μg/ml、約14μg/ml、約15μg/ml、約16μg/ml、約17μg/ml、約18μg/ml、約19μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50μg/ml、約75μg/ml、約100μg/ml、約125μg/ml、約150μg/ml、約175μg/ml、約200μg/ml、約250μg/ml、約300μg/ml、約350μg/ml、約400μg/ml、約450μg/ml、約500μg/ml、約550μg/ml、約600μg/ml、約650μg/ml、約700μg/ml、約750μg/ml、約800μg/ml、約850μg/ml、約900μg/ml、約950μg/ml、約1000μg/ml或大于1000μg/ml。
本文所述篩選方法的某些實施方案中，向細胞群提供包含除前腸分化因子之外的任何分子的候選分化因子。例如，一些實施方案中，向細胞群提供包含除類視黃醇、生長因子TGFβ超家族的成員、FGF10或FGF4之外的任何分子的候選分化因子。一些實施方案中，向細胞群提供包含除視黃酸之外的任何分子的候選分化因子。
一些實施方案中，本文所述篩選方法的步驟包括確定至少一個標志物在第一時間點和第二時間點的表達。一些實施方案中，該第一時間點可以在向細胞群提供候選分化因子之前或與之大約同時?；蛘?，一些實施方案中，該第一時間點在向細胞群提供候選分化因子之后。一些實施方案中，確定多個標志物在第一時間點的表達。
除在第一時間點確定至少一個標志物的表達之外，本文所述篩選方法的一些實施方案考慮在第二時間點確定至少一個標志物的表達，其在第一時間點之后，也在向細胞群提供候選分化因子之后。這些實施方案中，確定同一標志物在第一時間點和第二時間點的表達。一些實施方案中，確定多個標志物在第一時間點和第二時間點的表達。這些實施方案中，確定相同的多個標志物在第一時間點和第二時間點的表達。一些實施方案中，在多個時間點確定標志物的表達，其中每一個都在第一時間點之后，并且每一個都在向細胞群提供候選分化因子之后。某些實施方案中，用Q-PCR確定標志物的表達。其它實施方案中，用免疫細胞化學確定標志物的表達。
本文所述篩選方法的某些實施方案中，在第一時間點和第二時間點確定其表達的標志物是與人定型內(nèi)胚層細胞分化為特定細胞相關的標志物，該特定細胞為組成衍生自腸管的組織和/或器官的細胞的前體。一些實施方案中，衍生自腸管的組織和/或器官包含終分化的細胞。一些實施方案中，標志物指示胰細胞或胰前體細胞。優(yōu)選實施方案中，標志物是胰-十二指腸同源框因子-1(PDX1)。其它實施方案中，標志物是同源框A13(HOXA13)或同源框C6(HOXC6)。另外，其它實施方案中，標志物指示肝細胞或肝前體細胞。某些優(yōu)選實施方案中，標志物是白蛋白、肝細胞特異性抗原(HSA)和普洛斯彼羅-相關同源框1(PROX1)。其它實施方案中，標志物指示肺或肺前體細胞。一些優(yōu)選實施方案中，標志物是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TITF1)。其它實施方案中，標志物指示腸或腸前體細胞。其它優(yōu)選實施方案中，標志物是絨毛蛋白、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT2)、載脂蛋白A1(APOA1)、血管細胞粘附分子(VACM1)、血管性血友病因子(VMF)、CXC型趨化因子受體4(CXCR4)或尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)。其它實施方案中，標志物指示胃或胃前體細胞。其它優(yōu)選實施方案中，標志物是VACM1、VMF或CXCR4。其它實施方案中，標志物指示甲狀腺或甲狀腺前體細胞。這些實施方案中，標志物是TITF1。其它實施方案中，標志物指示胸腺或胸腺前體細胞。
本文所述篩選方法的一些實施方案中，向細胞群提供候選趨化因子和在第二時間點確定標記物的表達之間經(jīng)過足夠長的時間。該向細胞群提供候選趨化因子和在第二時間點確定標記物的表達之間的足夠的時間間隔可以從最短約1小時到最長約10天。一些實施方案中，向細胞群提供候選趨化因子后多次確定至少一個標志物的表達。一些實施方案中，該足夠長的時間是至少約1小時、至少約6小時、至少約12小時、至少約18小時、至少約24小時、至少約30小時、至少約36小時、至少約42小時、至少約48小時、至少約54小時、至少約60小時、至少約66小時、至少約72小時、至少約78小時、至少約84小時、至少約90小時、至少約96小時、至少約102小時、至少約108小時、至少約114小時、至少約120小時、至少約126小時、至少約132小時、至少約138小時、至少約144小時、至少約150小時、至少約156小時、至少約162小時、至少約168小時、至少約174小時、至少約180小時、至少約186小時、至少約192小時、至少約198小時、至少約204小時、至少約210小時、至少約216小時、至少約222小時、至少約228小時、至少約234小時或至少約240小時。
本文所述方法的一些實施方案中，進一步確定標志物在第二時間點的表達與該標志物在第一時間點的表達相比是否增加或減少。至少一個標志物表達的增加或減少表明候選分化因子能夠促進定型內(nèi)胚層細胞的分化。類似地，如果確定了多個標志物表達，進一步確定該多個標志物在第二時間點的表達與該多個標志物在第一時間點的表達相比是否增加或減少?？梢酝ㄟ^測量或評估細胞群中標志物在第一和第二時間點的數(shù)量、水平或活性確定標志物表達的增加或減少。這種確定可以是與其它標志物(如看家基因的表達)相比較的，或絕對的。其中標志物在第二時間點的表達比其在第一時間點的表達增加了的某些實施方案中，增加的數(shù)量為至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。一些實施方案中，增加的數(shù)量為少于2倍。標志物在第二時間點的表達比其在第一時間點的表達減少的實施方案中，減少的數(shù)量為至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或多于至少約100倍。一些實施方案中，減少的數(shù)量為少于2倍。
本文所述篩選方法的一些實施方案中，向細胞群提供候選趨化因子之后，人定型內(nèi)胚層細胞分化成一種或多種定型內(nèi)胚層譜系的細胞類型。一些實施方案中，向細胞群提供候選趨化因子之后，人定型內(nèi)胚層細胞分化成衍生自腸管的細胞。這些細胞包括但不限于，胰腺、肝、肺、胃、腸、甲狀腺、胸腺、咽、膽囊和膀胱的細胞和這些細胞的前體。此外，這些細胞可以進一步發(fā)育為更高級的結(jié)構(gòu)如組織和/或器官。
應理解與上述方法相似的篩選方法可用于鑒定一種或多種分化因子，該分化因子能夠促進包含人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的細胞群中的人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的分化。某些實施方案中，該人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是PDX1-陽性前腸/中腸內(nèi)胚層細胞。優(yōu)選實施方案中，該人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞。其它優(yōu)選實施方案中，該人PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞是前腸后部的PDX1陽性內(nèi)胚層細胞。特別優(yōu)選的實施方案中，該人PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞是可以分化成衍生自腸管前端部分的細胞、組織或器官的多潛能細胞。
能夠促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的因子的鑒定本發(fā)明描述的篩選方法的方面涉及鑒定一種或多種能夠促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的分化因子的方法。在這類方法中，獲得包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群，并測定細胞培養(yǎng)物或細胞群中PDX1的表達。在測定PDX1表達后，使細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞與候選分化因子接觸。在一些實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸時或與候選分化因子接觸后不久檢測PDX1的表達。然后在使細胞與候選分化因子接觸后的一個或多個時間點檢測PDX1表達。與接觸候選分化因子前的PDX1的表達相比，如果在接觸候選分化因子后PDX1的表達增加，候選分化因子可被鑒定為能夠促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化。
一些實施方案中，上述鑒定能夠促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的分化因子的方法還包括測定細胞培養(yǎng)物或細胞群中HOXA13和/或HOXC6基因的表達。在這類實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸前后分別測定HOXA13和/或HOXC6基因的表達。與接觸分化因子前PDX1和HOXA13的表達相比，如果在接觸候選分化因子后，PDX1和HOXA13的表達增加，就可鑒定候選分化因子能夠促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化。相似地，與接觸分化因子前比較，如果在接觸候選分化因子后，PDX1和HOXC6的表達增加，就可鑒定候選分化因子能夠促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化。在優(yōu)選的實施方案中，通過在使細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞與候選分化因子接觸前后分別測定PDX1、HOXA13和HOXC6的表達來鑒定可以促進PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細胞向PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的候選分化因子。優(yōu)選實施方案中，用Q-PCR檢測PDX1、HOXA13和HOXC6的表達。
應了解在一些實施方案中，在使細胞培養(yǎng)物或細胞群中的細胞與候選分化因子接觸時或在接觸候選分化因子后不久檢測PDX1、HOXA13和HOXC6中一種或多種的表達，而不是在細胞接觸候選分化因子之前檢測。在這類實施方案中，將在使細胞與候選分化因子接觸時或在接觸候選分化因子后不久PDX1、HOXA13和HOXC6中的一種或多種的表達與在細胞接觸候選分化因子后的一個或多個時間點的PDX1、HOXA13和HOXC6中的一個或多個表達進行比較。
在上述方法的一些實施方案中，在細胞與候選分化因子接觸后檢測PDX1表達的一個或多個時間點的范圍可以從約1小時至約10天。例如，可以在細胞與候選分化因子接觸后約1小時、細胞與候選分化因子接觸后約2小時、細胞與候選分化因子接觸后約4小時、細胞與候選分化因子接觸后約6小時、細胞與候選分化因子接觸后約8小時、細胞與候選分化因子接觸后約10小時、細胞與候選分化因子接觸后約12小時、細胞與候選分化因子接觸后約16小時、細胞與候選分化因子接觸后約24小時，細胞與候選分化因子接觸后約2天、細胞與候選分化因子接觸后約3天、細胞與候選分化因子接觸后約4天、細胞與候選分化因子接觸后約5天、細胞與候選分化因子接觸后約6天、細胞與候選分化因子接觸后約7天、細胞與候選分化因子接觸后約8天、細胞與候選分化因子接觸后約9天、細胞與候選分化因子接觸后約10天或細胞與候選分化因子接觸后超過10天檢測PDX1的表達。
用于此處描述的方法的候選分化因子可以選自化合物，例如多肽和小分子。例如，候選多肽包括但不限于生長因子、細胞因子、趨化因子、胞外基質(zhì)蛋白和合成肽。在優(yōu)選的實施方案中，生長因子來自FGF家族，例如FGF-10。候選小分子包括但不限于從組合化學合成的化合物和天然產(chǎn)物，例如類固醇、類異戊二烯、萜類化合物、類苯基丙烷(phenylpropanoid)、生物堿類和黃酮類。本領域技術人員應了解有數(shù)千種天然和合成的小分子可以利用，預期可用于此處描述的方法的小分子不限于以上舉例的種類。代表性地，小分子的分子量低于10,000amu。在優(yōu)選的實施方案中，小分子是類視黃醇，例如RA。能夠促進PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的因子的鑒定本發(fā)明的篩選方法的其他方面涉及鑒定一種或多種能夠促進PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞分化的分化因子的方法。在這類方法中，獲得包含PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的細胞培養(yǎng)物或細胞群，并測定細胞培養(yǎng)物或細胞群中標志物的表達。在測定標志物的表達后，使細胞培養(yǎng)物或細胞群的細胞與候選分化因子接觸。在一些實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸時或在接觸候選分化因子后不久檢測標志物的表達。然后在細胞與候選分化因子接觸后的一個或多個時間點檢測相同標志物的表達。與接觸分化因子前比較，如果在接觸候選分化因子后，標志物的表達增加或降低，就可鑒定候選分化因子能夠促進PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞的分化。在優(yōu)選的實施方案中，用Q-PCR檢測標志物的表達。
在上述方法的一些實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸后檢測標志物表達的一個或多個時間點的范圍可以從約1小時至約10天。例如，可以在使細胞與候選分化因子接觸后約1小時、使細胞與候選分化因子接觸后約2小時，使細胞與候選分化因子接觸后約4小時，使細胞與候選分化因子接觸后約6小時，使細胞與候選分化因子接觸后約8小時，使細胞與候選分化因子接觸后約10小時，使細胞與候選分化因子接觸后約12小時，使細胞與候選分化因子接觸后約16小時，使細胞與候選分化因子接觸后約24小時，使細胞與候選分化因子接觸后約2天，使細胞與候選分化因子接觸后約3天，使細胞與候選分化因子接觸后約4天，使細胞與候選分化因子接觸后約5天，使細胞與候選分化因子接觸后約6天，使細胞與候選分化因子接觸后約7天，使細胞與候選分化因子接觸后約8天，使細胞與候選分化因子接觸后約9天，使細胞與候選分化因子接觸后約10天或使細胞與候選分化因子接觸后超過10天檢測標志物的表達。
如前面所述，用于此處描述的方法的候選分化因子可以選自例如多肽或小分子的化合物。
盡管此處公開的每種方法都關于PDX1-陽性前腸內(nèi)胚層細胞，應了解在某些實施方案中，該方法可用于產(chǎn)生包含此處描述的PDX1-陽性前腸/中腸內(nèi)胚層細胞和/或此處描述的前腸后部的PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞的組合物。此外，本說明書中公開的任何PDX1-陽性內(nèi)胚層細胞類型都可用在此處描述的篩選方法中。
以上概括描述了本發(fā)明，可通過參照此處提供的某些具體實施例進一步理解本發(fā)明，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發(fā)明。
實施例以下很多實施例描述了人多能性細胞的使用。產(chǎn)生人多能性細胞的方法在現(xiàn)有技術中是公知的，在許多科學出版物中都有描述，包括第5,453,357、5,670,372、5,690,926、6,090,622、6,200,806和6,251,671號美國專利及
發(fā)明者凱文·艾倫·達穆爾, 艾倫·D·阿古尼克, 蘇珊·埃利澤, 伊曼紐爾·貝特格 申請人:賽瑟拉公司