可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的drd3基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，特點(diǎn)是該試劑盒包括一對(duì)DRD3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特異性測(cè)序引物如SEQIDNO.3所示，優(yōu)點(diǎn)是該診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)精神分裂癥及其亞型的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)，同時(shí)，以DRD3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化為靶點(diǎn)的藥物有望成為精神分裂癥輔助診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。
【專利說(shuō)明】可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的_3基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種個(gè)性化輔助診斷精神分裂癥的檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
精神分裂癥(Schizophrenia)是重大的精神類疾病之一，其可引起思考方式及情緒反應(yīng)的崩潰，具體表現(xiàn)有感覺、知覺、思維、情感以及意志行為等障礙。精神分裂癥是一種遺傳因素和環(huán)境心理因素共同作用引起的疾病。據(jù)了解，中國(guó)目前的精神分裂癥患者數(shù)量高達(dá)1300萬(wàn)。全中國(guó)每100人中就有一名精神分裂癥患者。當(dāng)前，雖然精神病學(xué)研究主要致力于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，但至今未找出合理的發(fā)病機(jī)制。因此，開展可行性的精神分裂癥研究具有很大的前景。
[0002]多巴胺受體D3 0--?)分布于中腦邊緣區(qū)的伏隔核和Calleja島，是由基因編碼的一種G蛋白耦聯(lián)受體，而/--?基因位于3ql3.3 (第3號(hào)染色體長(zhǎng)臂13區(qū)3帶)。目前國(guó)內(nèi)外的研究已經(jīng)證明“精神分裂癥的臨床癥狀是由于中樞多巴胺活動(dòng)過(guò)強(qiáng)造成的”。而且也有研究背景表明:基因的甲基化是在不改變DNA序列情況下，影響基因表達(dá)?；蚣谆途穹至寻Y之間是否存在相關(guān)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的/----基因甲基化程度的試劑盒的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的/--?基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)`用，該試劑盒通過(guò)各CpG點(diǎn)的差異顯著性分析，可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)精神分裂癥及精神分裂癥亞型的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括一對(duì)/--?基因甲基化特異性擴(kuò)增引物及甲基化特異性測(cè)序弓丨物，其中
所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG -3’ (SEQ ID N0.1)；
所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’ (SEQ ID N0.2)；
所述的甲基化特異性測(cè)序引物如SEQ ID N0.3所示:
5’ -Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3，(SEQ ID N0.3)。
[0005]一種可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的/--?基因甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用，在外周血檢測(cè)中，通過(guò)該試劑盒檢測(cè)得到的DRD3基因CpG2點(diǎn)甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執(zhí)型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過(guò)該試劑盒檢測(cè)得到的DRD3基因CpG3點(diǎn)甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執(zhí)型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過(guò)該試劑盒檢測(cè)得到的DRD3基因CpG5點(diǎn)甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷女性組患有偏執(zhí)型精神分裂癥。
[0006]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明首次公開了可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，DRD3基因的高甲基化水平導(dǎo)致/--?基因的低表達(dá)，從而影響/--?在腦部通路轉(zhuǎn)運(yùn)的循環(huán)量減少，最后導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生和發(fā)展。因此/--?基因甲基化水平在腦部與精神分裂癥患病率呈負(fù)相關(guān)。以檢測(cè)外周血/--?基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平為基礎(chǔ)的診斷試劑盒，可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)精神分裂癥及精神分裂癥亞型的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)。該試劑盒可用于男女各人群精神分裂癥亞型的輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物中，應(yīng)用前景廣泛。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1為/--?基因被檢測(cè)序列所在區(qū)域以及所檢測(cè)的5個(gè)CpG點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果；(例如CpGl與CpG2相關(guān)性為0.862，CpG3與CpG4相關(guān)性為0.193)
圖2為甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示例:表示甲基化程度，如圖示CpGl到CpG5的甲基化程度分別為 13%, 18%, 13%，8%，8%。
【具體實(shí)施方式】
[0008]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 具體實(shí)施例
[0009]1、研究對(duì)象的收集
從某醫(yī)院收集精神分裂癥患者，總共354例，同時(shí)收集300名正常者作為對(duì)照組，經(jīng)過(guò)年齡(最終選定樣本的年齡均在30歲上下)、性別、知識(shí)背景以及DNA相關(guān)濃度這些數(shù)據(jù)的分析，篩選出匹配指數(shù)(年齡，學(xué)歷，性別)較高的實(shí)驗(yàn)樣本量:30名精神分裂癥患者(15名男性+15名女性)，30名正常對(duì)照組(15名男性+15名女性)。
[0010]2、基因組DNA的提取
應(yīng)用Lab-Aid 820全自動(dòng)核酸提取儀(中國(guó)廈門致善生物科技有限公司，500ul體系)提取樣本的全血基因組DNA，再通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所得DNA的濃度，以供/--似基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的檢測(cè)。
[0011]3、DNA甲基化水平測(cè)定
本研究采用重亞硫酸鹽焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)/--?基因啟動(dòng)子區(qū)的5個(gè)CpG位點(diǎn)(如圖1)進(jìn)行了 DNA甲基化水平檢測(cè)。此技術(shù)的基本原理:用試劑盒中的重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶(U)，然后通過(guò)測(cè)序引物進(jìn)行PCR測(cè)序，從而得到哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),用于實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引物如下:
(I)甲基化特異性上游引物(Forward primer)
5’ - AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG -3’ (SEQ ID N0.1),(2)甲基化特異性下游引物(Reverseprimer)
5’ - GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’ (SEQ ID N0.2)；
(3)甲基化特異性測(cè)序引物(Sequencingprimer)
5’ -Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3，(SEQ ID N0.3)。
[0012]上述擴(kuò)增的具體步驟為:
A.采用QIAGEN EpiTect? 亞硫酸氫鹽處理試劑盒(EpiTech Bisulfite Kits;Qiagen; #59104)對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；
B.取步驟A中轉(zhuǎn)化過(guò)的DNA樣本20ng加入到PyromarkPCR試劑盒(Pyromark PCRKit; Qiagen; #978703),并加入上述一對(duì)/--?基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:首先950C 15min的變性；接著95°C 15s, Tm 30s, 72°C 20s，共50個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C 5min (注:Tm在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)跑PCR梯度溫度確定)；
C.焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備:在PSQ96板中預(yù)先加入45ii I含有0.3 ii M上述甲基化特異性測(cè)序引物的退火緩沖液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen; #979009);將需要使用的混勻的瓊脂糖珠總量(每樣本3iU)轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液(PyroMark Binding Buffer; Qiagen; #979006),使得平均每個(gè)樣品約有50 u I的體積,將混合物混勻；將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50 ii I反應(yīng)體積)中，每樣本50 ii I ;將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗漆緩沖液(PyroMark Wash Buffer; Qiagen; #979008)和 120ml的變性緩沖液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen; #979007);打開真空預(yù)備工作站的泵，將真空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具(PyroMark Vacuum PrepFilter Probes; Qiagen; #979010)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作)；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70%乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 - 10秒；關(guān)掉泵；將真空準(zhǔn)備工具放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠(測(cè)序引物也可最后加入);使用高純水清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)；
D.焦磷酸測(cè)序:在PyroMarkQ24焦磷酸測(cè)序儀上,采用Pyromark Gold Q24試劑盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)對(duì)步驟 C 中的 PSQ96 板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用PyroMark CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析(甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示例見圖2)。
[0013]4、數(shù)據(jù)分析
本次研究采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。我們發(fā)現(xiàn):被檢測(cè)的5個(gè)CpG位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)(CpGl、CpG2、CpG4和CpG5)之間存在相關(guān)性(r > 0.6，且/7 < 0.001，見圖1)，因此我們用/MW各CpG位點(diǎn)的甲基化程度，分別作了性別與亞型之間的比較。
[0014]結(jié)果(見表1，表2)發(fā)現(xiàn):在分亞型與性別及其CpG位點(diǎn)間的甲基化水平比較中，CpG2，CpG3在男性中與未定型及偏執(zhí)型精神分裂癥都存在關(guān)聯(lián)(/7 < 0.05，但男性中偏執(zhí)型與未定型差異不顯著，無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行區(qū)分);而CpG2在女性中與未定型精神分裂癥患者存在關(guān)聯(lián)(/? = 0.004 < 0.05)，CpG3在女性中與未定型精神分裂癥也存在關(guān)聯(lián)(p = 0.040
<0.05)，而CpG5在女性中卻與偏執(zhí)型精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)(/7 = 0.024 < 0.05)。
[0015]表1男性亞型中CpG位點(diǎn)的甲基化情況
【權(quán)利要求】
1.一種可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的/----基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括一對(duì)/--?基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及甲基化特異性測(cè)序引物，其中所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG _3’ ； 所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’ ； 所述的甲基化特異性測(cè)序引物如SEQ ID N0.3所示:
5’ -Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3’ 。
2.一種如權(quán)利要求1所述的可用于檢測(cè)與精神分裂癥相關(guān)的/--?基因甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:在外周血檢測(cè)中，通過(guò)該試劑盒檢測(cè)得到的DRD3基因CpG2點(diǎn)甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執(zhí)型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過(guò)該試劑盒檢測(cè)得到的DRD3基因CpG3點(diǎn)甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執(zhí)型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過(guò)該試劑盒檢測(cè)得到的DRD3基因CpG5點(diǎn)甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷女性組患有偏執(zhí)型精 神分裂癥。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602722SQ201310319417
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】周科娜, 段世偉, 高樹貴, 成佳, 章凱, 鄭榮炯, 莊起東, 戴東君 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)