一種人源annexin A2的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是指一種人源annexin?A2（膜聯(lián)蛋白A2)的生產(chǎn)純化方法及其應(yīng)用，具體闡述為膜聯(lián)蛋白A2（annexin?A2）cDNA的獲得與擴(kuò)增，表達(dá)annexin?A2的菌種的篩選擴(kuò)建，以及annexin?A2蛋白的純化、保存，最終以生物制劑的形式服務(wù)于醫(yī)療領(lǐng)域。本發(fā)明還描述了膜聯(lián)蛋白A2在制備人annexin?A2蛋白生物制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提出誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白A2表達(dá)的最佳溫度、時(shí)間及IPTG濃度。還包括提出純化膜聯(lián)蛋白A2的最佳咪唑濃度，以達(dá)到大規(guī)模純化生產(chǎn)用于醫(yī)療領(lǐng)域的目的。
【專利說(shuō)明】—種人源annexin A2的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是指一種人源annexin A2(膜聯(lián)蛋白A2)的生產(chǎn)純化方法及其應(yīng)用，具體闡述為膜聯(lián)蛋白A2 (annexin A2)cDNA的獲得與擴(kuò)增,表達(dá)annexinA2的菌種的篩選擴(kuò)建，以及annexin A2蛋白的純化、保存，最終以生物制劑的形式服務(wù)于醫(yī)療領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]Annexin A2,又名 P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、LPC2D、ANX2L4、PAP-1V0 其基因位于15q21_q22，蛋白分子量為36kD，在人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富。研究表明，annexin A2蛋白具有Ca2+依賴性結(jié)合磷脂、細(xì)胞骨架蛋白的重要特性，從而將其歸入annexins蛋白超家族的A亞家族中。盡管已發(fā)現(xiàn)annexins家族成員多在細(xì)胞生長(zhǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用，但annexin A2蛋白的具體生物學(xué)功能還不清楚。實(shí)驗(yàn)證明，annexin A2與人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，尤其是其在心血管、腫瘤性疾病中的作用機(jī)制成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在我們的前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表面的annexin A2可作為纖溶酶原與組織型纖溶酶原激活物(t_PA)的共受體，發(fā)揮著調(diào)節(jié)纖溶酶活性的作用。內(nèi)皮細(xì)胞磷脂膜上的annexin A2存在著Lys-PLG (PLG前體)和t-PA的結(jié)合位點(diǎn)，脂蛋白a和同型半胱氨酸能分別競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗Lys-PLG和t_PA與annexin A2的結(jié)合。在annexin A2基因敲除小鼠上發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞表面t_PA依賴的纖溶酶水平明顯下降，以至不能完全清除損傷后所形成的動(dòng)脈血栓。純化的annexin A2可增加纖溶酶原的激活效率約60倍。為了進(jìn)一步研究annexin A2蛋白在其他疾病中的作用，獲得該蛋白的成為當(dāng)前的首要任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種人源annexin A2的生產(chǎn)方法。
[0004]一種人源annexin A2的生產(chǎn)方法,包括如下步驟:
[0005]I)用Trizol RNA提取試劑盒提取人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的總RNA,提取的RNA用無(wú)RNAase的DEPC水溶解；將提取的細(xì)胞總RNA，用下游引物5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0006]2)將核苷酸序列插入原核表達(dá)載體pET_21b (+)中，構(gòu)建重組載體，并將重組載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌E.col1.BL21 (DE3)中，做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化處理，并抽提質(zhì)粒；
[0007]3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌E.col1.DH5a中，含AMP50 μ g/mL的LB培養(yǎng)基于37°C下培養(yǎng)3h后，篩選陽(yáng)性克隆添加終濃度為0.75-1.25mmol/L的IPTG于25_37°C下誘導(dǎo)3_6h，得至丨J annexin A2。
[0008]進(jìn)一步的，步驟I)中，提取的細(xì)胞總RNA，用下游引物5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系:下游引物I μ L，AMV反轉(zhuǎn)錄酶
0.5 μ L，5 倍 Buffer2 μ L，DNTPl μ L，RNA 酶抑制劑 0.5 μ L, RNA 與水合計(jì) 5 μ L，反應(yīng)條件:42°C，45min ；92°C,5min ;冰水浴5min ;反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系:2倍Taq pluslOyL，模板cDNA5yL，上游引物I μ L，下游引物I μ L，水3 μ L，反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 3min ；94°C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin, PCR 擴(kuò)增引物:5’ -AATGGGTCGGGATCCGTCTA G_3’，5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’。
[0009]進(jìn)一步的，步驟3)中，IPTG的終濃度為lmmol/L。
[0010]進(jìn)一步的，步驟3)中，添加IPTG于37°C下誘導(dǎo)。
[0011]進(jìn)一步的，步驟3)中，IPTG誘導(dǎo)6h。
[0012]進(jìn)一步的，步驟3)中，添加終濃度為lmmol/L的IPTG于37°C下誘導(dǎo)6h，得到人源annexin A2。
[0013]進(jìn)一步的，還包括純化步驟4)使用濃度為lOO-lOOOmmol/1的咪唑梯度洗脫進(jìn)行純化，用鎳親和柱純化獲得人源annexin A2蛋白。
[0014]更進(jìn)一步的,所述咪唑濃度為800mmol/l。
[0015]本發(fā)明還描述了膜聯(lián)蛋白A2在制備人annexin A2蛋白生物制劑中的應(yīng)用。
[0016]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明:
[0017]膜聯(lián)蛋白A2的生產(chǎn)方法，包括如下具體步驟:
[0018]1.Annexin A2表達(dá)載體的構(gòu)建
[0019]1.1細(xì)胞總RNA的提取
[0020]取人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)細(xì)胞，用Trizol RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，操作方法參照Trizol RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的RNA用無(wú)RNAase的DEPC水溶解。
[0021]1.2RT-PCR 擴(kuò)增 annexin A2 基因 cDNA
[0022]取提取的細(xì)胞總RNA，用下游引物(5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’ )進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系:下游引物IyL, AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ L，5倍Buffer2 μ L，DNTPl μ L，RNA酶抑制劑0.5μ L，RNA與水合計(jì)5μ L。反應(yīng)條件:42°C，45min ；92°C,5min ;冰水浴5min。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系:2倍Taq pluslO μ L，模板cDNA5 μ L，上游引物I μ L，下游引物lyLjjC3yL。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性3min ；94°C 30s, 57 °C 30s，72 °C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72 °C IOmin0 PCR 擴(kuò)增引物:5，-AATGGGTCGGGATCCGTCTA G_3，，5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’。
[0023]1.3Annexin A2基因的克隆及鑒定
[0024]將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體相連接，連接產(chǎn)物為pGM_T_ANXA2。并轉(zhuǎn)化E.col1.BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)菌培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA用Bam HI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，并將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。
[0025]1.4融合表達(dá) 載體的構(gòu)建及其DNA序列分析
[0026]表達(dá)載體名稱:Pet21b，結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0027]酶切位點(diǎn)為BamHI，XhoI，具有氨芐青霉素抗性，N末端融合有His標(biāo)簽。
[0028]質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果表明，基因序列與GeneBank上anneixn A2的序列完全符合，閱讀框沒(méi)有發(fā)生移碼，融合表達(dá)載體構(gòu)建成功。大小約為37kDa。(圖2所示)
[0029]Sequencing:
[0030]GGAGGGGTAAATTTTCCCCTCTAAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT ACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGTCTACTGTTCAC GAAATCCTGTGCAAGCTCAGCTTGGAGGG
【權(quán)利要求】
1.一種人源annexin A2的生產(chǎn)方法,其特征在于:包括如下步驟:1)用TrizolRNA提取試劑盒提取人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的總RNA，提取的總RNA用無(wú)RNAase的DEPC水溶解；將提取的細(xì)胞總RNA，用下游引物5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將核苷酸序列插入原核表達(dá)載體pET-21b(+)中，構(gòu)建重組載體，并將重組載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌E.col1.BL21 (DE3)中，做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化處理，并抽提質(zhì)粒；3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌E.col1.DH5a中，含AMP50 μ g/mL的LB培養(yǎng)基于37°C下培養(yǎng)3h后，篩選陽(yáng)性克隆添加終濃度為0.75-1.25mmol/L的IPTG于25_37°C下誘導(dǎo)3_6h，得到annexin A2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源annexinA2的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟I)中，提取的細(xì)胞總RNA，用下游引物5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系:下游引物 I μ L，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ L，5 倍 Buffer2 μ L, DNTPl μ L, RNA 酶抑制劑 0.5 μ L, RNA 與水合計(jì)5 μ L，反應(yīng)條件:42°C，45min ；92°C,5min ;冰水浴5min ;反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系:2倍Taq PIuslO μ L，模板cDNA5 μ L，上游引物I μ L，下游引物I μ L，水3μ L，反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 2min,30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin,PCR 擴(kuò)增引物:5’ -AATGGGTCGGGATCCGTCTA G_3’，5’ -CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源annexinA2的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟3)中，IPTG的終濃度為lmmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 所 述的人源annexinA2蛋白的生產(chǎn)方法,其特征在于:步驟3)中，添加IPTG于37°C下誘導(dǎo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的任一人源annexinA2蛋白的生產(chǎn)方法,其特征在于:步驟3)中，IPTG 誘導(dǎo) 6h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源annexinA2蛋白的生產(chǎn)方法,其特征在于:步驟3)中，添加終濃度為lmmol/L的IPTG于37°C下誘導(dǎo)6h,得到人源annexin A2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的人源annexinA2的生產(chǎn)方法,其特征在于:還包括純化步驟4)使用濃度為lOO-lOOOmmol/1的咪唑梯度洗脫進(jìn)行純化，用鎳親和柱純化獲得人源annexin A2 蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人源annexinA2蛋白的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述咪唑濃度為 800mmol/l。
9.如權(quán)利要求1或6所述的人源annexinA2蛋白在制備人annexin A2蛋白生物制劑中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8所述的人源annexinA2蛋白在制備人annexin A2蛋白生物制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103436552SQ201310410574
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】戴海斌, 李汶潞, 徐慧敏, 何萍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)