聾病易感基因線粒體12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突變比例檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了聾病易感基因線粒體12SrDNA1555A>G、1494C>T突變比例檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和一系列標準品；所述擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增線粒體12SrDNA：1494C>T、1555A>G的引物混合物；所述一系列標準品包括：1494C>T、1555A>G突變比例標準品。本發(fā)明以上述2個聾病易感基因位點為檢測對象，通過上述耳聾易感基因位點的擴增和熒光定量檢測，與突變比例標準品的對比，即可篩選出含有上述位點突變的個體，同時確定各種突變的比例。對聾病易感基因的檢測，尤其是對新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義。
【專利說明】聾病易感基因線粒體12SrDNA 1555A > GJ494C > T突變
比例檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聾病易感基因線粒體12SrDNA1555A>G、1494C>T突變比例檢測試劑盒，屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]世界范圍內(nèi)對聽力語言殘疾者進行的致病因素研究表明，約60-80%患者的病因與遺傳因素有關(guān)，其中發(fā)達國家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%。因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發(fā)病機制及其分子流行病學(xué)的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進步，聾病的分子遺傳學(xué)研究和分子流行病學(xué)的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認識到聾病易感基因突變在維護聽力健康和發(fā)現(xiàn)聽力異常中的重要性。
[0003]藥物的耳毒性是導(dǎo)致語前聽力損失的一個重要因素，部分與線粒體12S rRNA基因1555A>G突變有關(guān)，該突變可以增加耳蝸對氨基糖甙類藥物的敏感性。在美國，耳毒性藥物相關(guān)的聽力損失患者中，10%的具有12S rRNA基因1555A>G突變，美國語前聽力損失患者中，1555A>G突變患者的發(fā)病率約為1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A>G突變與15-20%的家族性非綜合征型聽力損失有關(guān)，許多年老的家族成員即使沒有使用氨基糖甙類藥物也可發(fā)生因此突變導(dǎo)致的聽力下降。而在中國，藥物性耳聾的發(fā)病率超出了原有的想象，在一系列的文章報道中，發(fā)現(xiàn)在門診發(fā)現(xiàn)的耳聾患者中，約5%的患者是由于12S rRNA基因1555A>G突變導(dǎo)致的，而在聾啞學(xué)校這樣一個特殊群體，則高達12 %的患者是由于12S rRNA基因1555A>G突變接觸氨基糖甙類藥物而致聾。同時在中國群體中還發(fā)現(xiàn)了 12S rRNA基因1494C>T突變與藥物性耳聾的關(guān)系，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個大的家系是由于1494C>T突變導(dǎo)致的。1555A>G突變和1494CXT突變者在出生時往往聽力正常，很難通過聽力篩查而被提前發(fā)現(xiàn)和預(yù)測，卻存在因耳毒性藥物的使用而發(fā)生聽力損失的隱患。由于線粒體的異質(zhì)性特征，不同的個體表現(xiàn)出的線粒體突變的比例不同。大量研究表明，1555A>G和1494CXT突變線粒體所占有的比例高低與病情存在一定的相關(guān)性，通常突變線粒體所占比例高的個體表現(xiàn)出重度耳聾，而占比低的則表現(xiàn)出輕度耳聾或正常。但是即使突變占比很低，仍存在藥物致聾的危險。因此，一方面需要能夠分辨出突變比例的試劑盒來為線粒體聾病相關(guān)突變提供更方便的研究手段，另一方面要求這些試劑能夠?qū)Φ屯蛔儽壤龢吮居泻芎玫臋z出能力。
[0004]目前常用的基因檢測方法有:直接測序(direct sequencing，DS)、連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態(tài)性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽性多等問題。對于染色體突變的基因分型，一般的熒光定量試劑盒往往需要對同一個標本進行多管檢測，才能獲得2個以上的分型信息。對于線粒體DNA的突變比例檢測，質(zhì)譜法能檢出5%左右的突變，而測序和基因芯片對于突變線粒體的選擇能力只能達到20%左右，難以分辨出更低突變比例的標本。
[0005]本發(fā)明以上述線粒體12SrDNA1555A>G、1494C>T位點為檢測對象，通過上述耳聾易感基因位點的擴增和熒光定量檢測，與突變比例標準品的對比，即可篩選出含有上述位點突變的個體，同時確定各種突變的比例。對聾病易感基因的檢測，尤其是對新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義；首次利用熒光定量PCR檢測的方法實現(xiàn)了 1494C>T、1555A>G的突變比例檢測的目標，大大節(jié)約了人力物力和時間。高靈敏度高特異性同時檢測，提供染色體相關(guān)突變的分型信息，對于線粒體1555A>G和1494C>T突變的選擇能力達到了 0.1%。閉管檢測防止了開蓋檢測操作而產(chǎn)生的污染，為臨床診斷和相關(guān)領(lǐng)域科研提供可靠方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種可在I個小時內(nèi)同時檢測聾病易感基因線粒體12SrDNA1555A>G、1494C>T突變，同時報告各種突變的比例的熒光檢測試劑盒。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案:一種聾病易感基因線粒體12SrDNA1555A>G、1494C>T突變比例檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和一系列標準品；
[0008]所述擴增試劑包括:PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增線粒體12SrDNA:1494C>TU555A>G突變的引物混合物，對上述位點進行特異性檢測的探針混合物，對人線粒體DNA進行檢測的通用探針混合物，內(nèi)對照及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針混合物；
[0009]所述一系列標準品包括:1494C>T突變比例標準品、1555A>G突變比例標準品。標準品的制備方法(以1555A> G突變比例標準品的制備為例):篩選得到1555A>G突變的標本DNA，通過測序、質(zhì)譜等方法確認其1555G的DNA占全部線粒體DNA的比例為100%，稀釋定量至5ng/uL，作為100%突變的標準品①；取正常人標本提取DNA，通過測序、質(zhì)譜等方法確認其1555位點不存在突變，稀釋定量至5ng/uL ;取標準品①和5ng/uL正常人標本提取DNA等比例混合，得到50%突變的標準品②；取標準品②與5ng/uL正常人標本提取DNA按I: 4的比例混合，得到10 %突變的標準品③；取標準品③與5ng/uL正常人標本提取DNA按1: 9的比例混合,得到I %突變的標準品④；取標準品④與5ngAL正常人標本提取DNA按1: 9的比例混合，得到0.1 %突變的標準品⑤。每次取各標準品2uL加入到20uL PCR反應(yīng)體系中。
[0010]所述用于對線粒體12SrDNA: 1494C>T、1555A>G突變進行特異性檢測的探針，對人線粒體DNA進行檢測的通用探針，對內(nèi)對照進行檢測的探針被分為四組，分別采用四種不同的發(fā)光基團對各組探針的5’端進行標記，3’端的淬滅基團可以為相同或不同的熒光染料。
[0011]所述探針所分為的四組為:用于對內(nèi)對照進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；線粒體12SrDNA:1494C>T突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；1555A>G突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；對人線粒體DNA進行檢測的通用探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團。
[0012]所述5’端不同的發(fā)光基團所使用的熒光染料可以為:ALEXA Fluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3、TAMRA, ROX, /Texas Red、Cy5 ;3’端相同或不同的淬滅基團所使用的熒光染料可以為:BHQ1、BHQ2、TAMRA, DABCYL?
[0013]使用所述的試劑盒進行PCR復(fù)合擴增反應(yīng)的條件:PCR擴增體系的pH值為
8.0-9.0，鎂離子濃度為1.5-3.5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300 iiM，Taq酶的用量為
0.1-0.4U/ii L，引物探針混合物中的引物、探針的終濃度為0.2-0.4 u M0
[0014]使用所述試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應(yīng)在一個復(fù)合擴增反應(yīng)體系中同時擴增12SrDNA: 1494C>T、1555A>G，人線粒體DNA目標序列，內(nèi)對照目標序列。
[0015]用于GJB2:235delC、299delAT，SLC26A4:2168A>G、IVS7_2A>G，線粒體 12SrDNA:1494C>T、1555A>G檢測，人線粒體DNA序列檢測的引物為:
[0016]SEQ N0.1:5’ -GTAAGTTGGGTGCTTTGTGTTAAG-3’
[0017]SEQ N0.2:5，-GCCCTGAAGCGCGTACA-3，；
[0018]用于線粒體12SrDNA1555A>G突變檢測的探針為:
[0019]SEQ N0.3:5’ -AGTACACTTACCATGTTACGACTTGcCTCCTC-3’
[0020]用于線粒體12SrDNA1494C>T突變檢測的探針為:
[0021]SEQ N0.4:5’ -GTGAAGTATACTTGAGGAGaGTGACGGGAC-3’ ；
[0022]用于對人線粒體DNA進行檢測的通用探針為:
[0023]SEQ N0.5:5’ -TGCGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCT-3’
[0024]其中LNA核苷以黑體字表示。
[0025]內(nèi)對照為一段人工合成的序列裝載到PMD18-T的質(zhì)粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ N0.6)經(jīng)過NCBI網(wǎng)站Blast沒有找到高相關(guān)的同源區(qū)。擴增序列及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針為:
[0026]SEQ N0.6:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
[0027]SEQ N0.7:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
[0028]SEQ N0.8:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
[0029]SEQ N0.9:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
[0030]所述各位點的復(fù)合擴增采用聚合酶鏈式反應(yīng)來實現(xiàn)，采用熒光定量PCR進行實時檢測，通過與標準品的同步擴增和分析，得出所測標本的分型信息或突變比例信息。
[0031]其中所檢測的人基因組DNA為:使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對來源樣本進行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為:來源于人類的:濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。
[0032]使用所述的試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應(yīng)在任何型號的PCR儀上進行，擴增程序:94-980C l-5min ；45 個循環(huán)的 94-98°C 5-10s, 55-65°C 30_50s。
[0033]使用的帶熒光標記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了探針的Tm值，縮短了探針長度，增強了探針對點突變的識別力，從而增加了探針的靈敏度和特異性，防止假陽性和假陰性的出現(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明的試劑盒對IOngDNA背景下12S rRNA1555A>G突變比例標準品的檢測圖譜；
[0035]圖2是本發(fā)明的試劑盒對IOng DNA背景下12S rRNA1494C>T突變比例標準品的檢測圖譜；
[0036]圖3是根據(jù)圖1、圖2數(shù)據(jù)作出的標準曲線圖；
[0037]圖4是本發(fā)明的試劑盒對正常個體血斑來源DNA(10ng/20uL體系)的檢測圖譜；
[0038]圖5是本發(fā)明的試劑盒對12S rRNA1555A>G突變的個體血斑來源DNA(10ng/20uL體系)的檢測圖譜；
[0039]圖6是本發(fā)明的試劑盒對12S rRNA1494C>T突變個體血斑來源DNA (2.5ng/20uL體系)的檢測圖譜。 【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0041]實施例1本發(fā)明的試劑盒檢測突變及正常個體的DNA樣本
[0042]用于12S rRNA1494C>T突變檢測的探針5’端采用FAM熒光染料標記，用于1555A>G突變檢測的探針5’端采用HEX熒光染料標記，用于人線粒體DNA檢測的探針5’端采用Cy5熒光染料標記，用于內(nèi)對照檢測的探針5’端采用ROX熒光染料標記。
[0043]1、待測樣本1000份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴增-測序”的技術(shù)方法對各位點進行過測序檢測。其中，12S rRNA1555A>G突變樣本10份，14940T突變樣本I份。
[0044]2、檢材的基因組DNA提取
[0045]Chelex提取法:剪下I-3mm血斑(標本來自于XX醫(yī)院檢驗科)置于1.5mL尚心管中，加入SdH2OlmL,振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5% Chelex-1OO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后,振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴IOmin,輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min,上清中為提取的 DNA。
[0046]3、擴增和擴增產(chǎn)物的檢測分析
[0047](I) PCR 擴增體系:
[0048]
【權(quán)利要求】
1.聾病易感基因線粒體12SrDNA1555A>G、1494C>T突變比例檢測試劑盒，其特征在于包括擴增試劑和一系列標準品；所述擴增試劑包括:PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增線粒體12SrDNA: 1494C>T、1555A>G的引物混合物，對上述位點進行特異性檢測的探針混合物，對人線粒體DNA進行檢測的通用探針混合物，內(nèi)對照及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針混合物；所述一系列標準品包括:1494C>T突變比例標準品、1555A>G突變比例標準品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 用于線粒體12SrDNA:1494C>T、1555A>G檢測，人線粒體DNA序列檢測的引物為:
SEQ N0.1:5’ -GTAAGTTGGGTGCTTTGTGTTAAG-3’
SEQ N0.2:5’ -GCCCTGAAGCGCGTACA-3’ ； 用于線粒體12SrDNA1555A>G突變檢測的探針為:
SEQ N0.3:5’ -AGTACACTTACCATGTTACGACTTGCCTCCTC-3’ 用于線粒體12SrDNA1494C>T突變檢測的探針為:
SEQ N0.4:5’ -GTGAAGTATACTTGAGGAGaGTGACGGGAC-3’ ； 用于對人線粒體DNA進行檢測的通用探針為:
SEQ N0.5:5’ -TGCGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCT-3’ 其中LNA核苷以黑體字表示。`
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)對照為一段人工合成的序列裝載到PMD18-T的質(zhì)粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ N0.6)經(jīng)過NCBI網(wǎng)站Blast沒有找到高相關(guān)的同源區(qū)。擴增序列及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針為:
SEQ N0.6:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
SEQ N0.7:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
SEQ N0.8:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
SEQ N0.9:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3，
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的用于線粒體12SrDNA:1494C>T、1555A>G突變檢測的探針，對人線粒體DNA進行檢測的通用探針，內(nèi)對照探針，每條探針的5’端和3’端均進行熒光染料標記，5’端為發(fā)光基團和3’端為淬滅基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述用于對線粒體12SrDNA:1494C>T、1555A>G突變進行特異性檢測的探針，對人線粒體DNA進行檢測的通用探針，內(nèi)對照探針分為四組，分別采用四種不同的發(fā)光基團對各組探針的5’端進行標記，3’端的淬滅基團可以為相同或不同的熒光染料。
6.根據(jù)權(quán)利4要求所述的試劑盒，其特征在于:探針所分為的四組為:用于對內(nèi)對照進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；線粒體12SrDNA:1494C>T突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；1555A>G突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；對人線粒體DNA進行檢測的通用探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團。
7.根據(jù)權(quán)利4要求所述的試劑盒，其特征在于:5’端不同的發(fā)光基團所使用的熒光染料可以為:ALEXA Fluor350、FAM、TET、HEX/J0E/VIC、Cy3、TAMRA、R0X、/Texas Red、Cy5;3，端相同或不同的淬滅基團所使用的熒光染料可以為:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
8.根據(jù)權(quán)利I要求所述的試劑盒，其特征在于:包括一系列標準品:1494C>T突變比例標準品、1555A>G突變比例標準品。
9.根據(jù)權(quán)利I或7要求所述的試劑盒，其特征在于:1494C>T突變比例標準品為:7管10ng/uL的人DNA標本，各管的1494CXT突變比例為100 % ,50 % ,20 % UO % ,5 % U % >0.5%，其制備方法為將10ng/uL100% 1494C>T突變的DNA標本按一定比例摻入10ng/uL未含有1494C>T突變的DNA標本中。
10.根據(jù)權(quán)利I或7要求所述的試劑盒，其特征在于:1555A>G突變比例標準品為:7管10ng/uL的人DNA標本，各管的1555A>G突變比例為100% ,50 % ,20% UO % ,5% U % >0.5%，其制備方法為將10ng/uL100% 1555A>G突變的DNA標本按一定比例摻入10ng/uL未含有1555A>G突變的DNA標本中。
11.權(quán)利要求1所述試劑盒應(yīng)用于聾病易感基因的檢測，其特征在于通過熒光定量PCR特異性檢測聾病易感基因線粒體12SrDNA:1494C>TU555A>G ;用于12S rRNA1555A>G突變檢測的引物探針為:SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3 ;用于12S rRNA1494C>T突變檢測的引物探針為:SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.4 ;用于對人線粒體DNA檢測的引物探針為=SEQ N0.1、SEQ N0.2,SEQ N0.5 ;用于對內(nèi)對照檢測的引物探針為:SEQ N0.5,SEQ N0.6,SEQ N0.6。所述各位點的復(fù)合擴增采用聚合酶鏈式反應(yīng)來實現(xiàn)，采用熒光定量PCR進行實時檢測，通過與標準品的同步擴增和分 析，得出所測標本的突變比例信息。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451302SQ201310410840
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】步迅, 夏子芳, 張全芳, 劉艷艷 申請人:步迅, 夏子芳