一種基于自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法。利用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶對(duì)K2ZrF6鋯前驅(qū)體仿生鋯化的誘導(dǎo)效應(yīng)，在誘導(dǎo)仿生鋯化的過程中實(shí)現(xiàn)蛋白酶的固定化，獲得以氧化鋯為載體的固定化蛋白酶。本發(fā)明克服了現(xiàn)有傳統(tǒng)固定化方法存在的固定化過程復(fù)雜、酶與載體的生物相容性差、其與載體之間的結(jié)合作用相對(duì)較弱、固定化酶的穩(wěn)定性差、使用壽命低以及固定化反應(yīng)條件通常較劇烈而造成酶的失活等缺陷，具有固定化過程簡單、無需額外的誘導(dǎo)劑、條件溫和、效率高、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種基于自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶制備【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶具有高選擇性、高催化活性、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。已在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而在自然狀態(tài)下，大多數(shù)酶是水溶性的，使得游離狀態(tài)下的酶在生物催化過程中的應(yīng)用受到很大的限制，主要表現(xiàn)在游離酶的穩(wěn)定性差、不能循環(huán)使用、生成的產(chǎn)物難于從反應(yīng)混合物中分離、純化等。進(jìn)行酶的固定化是解決上述問題的有效方法，所以探索酶的固定化載體和固定化方法，制備高活性、高穩(wěn)定性、高機(jī)械強(qiáng)度的固定化酶將有重要的理論和實(shí)際意義。
[0003]現(xiàn)有的常用酶固定化方法大致可分為4類:吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法。吸附法操作簡便，且對(duì)酶構(gòu)象的破壞小，但是酶與載體的結(jié)合力弱，酶固定化后易脫落；交聯(lián)法的反應(yīng)條件較激烈，酶分子中有些基團(tuán)被交聯(lián)，會(huì)導(dǎo)致酶活回收率降低較大；共價(jià)結(jié)合法則要求酶具有特殊的能夠與載體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的官能團(tuán)，但劇烈的化學(xué)反應(yīng)常會(huì)造成酶的失活，通常情況下酶活力回收率僅有30%左右；與吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法相比，包埋法用到的載體的制備方法具有所需反應(yīng)條件溫和、酶分子不易泄漏、對(duì)生物活性單元失活作用小及可固定高濃度的生物活性單元等優(yōu)點(diǎn)。酶被包在高聚物的網(wǎng)格中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微囊型兩種，又由于載體可將酶與外界環(huán)境隔開，所以還有助于提高酶的穩(wěn)定性。包埋法所具有得較普遍的適用性，使其近年來得到了廣泛的關(guān)注。
[0004]目前固定化酶載體價(jià)格昂貴，多數(shù)固定化酶的活力熱穩(wěn)定性還不夠高，操作半衰期也不夠長，很難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)上的連續(xù)化生產(chǎn)。在改進(jìn)傳統(tǒng)載體材料的同時(shí)，研究開發(fā)新型材料成為今后固定化酶載體研究的主要方向。隨著材料仿生學(xué)的不斷發(fā)展，固定化酶領(lǐng)域的研究人員將仿生的思想，特別是結(jié)構(gòu)仿生和過程仿生的思想引入到固定化酶載體這種特殊材料的設(shè)計(jì)和制備中，開發(fā)出了新型的固定化酶載體。
[0005]模擬生物礦化的仿生礦化就是將生物礦化的機(jī)理引入無機(jī)材料的合成，以有機(jī)物組裝體為模板，去控制無機(jī)物形成，制備具有特殊組裝方式和多級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的有機(jī)無機(jī)復(fù)合體，使材料具有優(yōu)異的物理化學(xué)性能。誘導(dǎo)仿生礦化的基本方法一般是利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)帶有負(fù)電的無機(jī)前驅(qū)體(如正硅酸乙酯、氟鋯酸鉀、二氫氧化二銨合鈦等)水解并縮聚生成氧化物，同時(shí)將酶包埋于氧化物顆粒之中，形成固定化酶，在材料學(xué)、工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應(yīng)用前景。
[0006]目前利用仿生礦化進(jìn)行酶固定化的一般方法是利用精蛋白等堿性蛋白作為誘導(dǎo)劑。由于體系中加入了額外的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑，該方法只適用于非蛋白質(zhì)水解酶類的固定化而不宜進(jìn)行蛋白質(zhì)水解酶類的固定化。本發(fā)明利用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)仿生鋯化的誘導(dǎo)作用實(shí)現(xiàn)仿生礦化固定化，體系中不需額外加入蛋白誘導(dǎo)劑，克服了上述方法的不足。目前利用自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法尚未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)固定化方法的缺陷，提供一種基于自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法。
[0008]具體步驟為:
室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入8~12 mL濃度為0.01、.05 mol/L的鋯前驅(qū)體溶液，然后加入8~24 mL用pH 6.0~8.0、濃度0.02 mol/L~0.12 mol/L的緩沖液配制的濃度為4 mg/mL~12 mg/mL游離蛋白酶溶液,使錯(cuò)前驅(qū)體溶液與游離蛋白酶溶液的體積比為1: 1~2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；沉淀用蒸懼水洗漆3次后,冷凍干燥,得到固定化酶。
[0009]所述游離蛋白酶為菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種。
[0010]所述鋯前驅(qū)體溶液為K2ZrF6溶液。
[0011]所述緩沖液為磷酸鹽(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合)緩沖液。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于:游離酶的固定化過程簡單，條件溫和，時(shí)間縮短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的酶活回收率和包埋率較高；固定化的酶穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1仿生鋯化固定化菠蘿蛋白酶、二氧化鋯標(biāo)準(zhǔn)參照及K2ZrF6的紅外光譜圖。
[0014]圖中:A- 二氧化鋯；B-固定化菠蘿蛋白酶；C_ K2ZrF6。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下述磷酸鹽緩沖液為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合配制的緩沖液。
[0016]實(shí)施例1:
室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入10 mL 0.02 mol/L K2ZrF6溶液，再向固定化反應(yīng)器中加入20 mL用pH 7.5、濃度為0.10 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的濃度為6 mg/mL菠蘿蛋白酶溶液，使K2ZrF6溶液與菠蘿蛋白酶溶液的體積比為1:2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀。蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24小時(shí)，所得的固定化酶酶活回收率為59.52%，菠蘿蛋白酶包埋率為63.03%,同批固定化酶重復(fù)使用6次后酶活仍可保持60%以上。
[0017]所獲的固定化菠蘿蛋白酶，樣品研細(xì)后，溴化鉀壓片，采用傅立葉紅外光譜儀測定其紅外光譜，如圖1所示。對(duì)比固定化菠蘿蛋白酶(圖1-B)與鋯前驅(qū)體K2ZrF6 (圖1-C)可知，經(jīng)菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)鋯前驅(qū)體K2ZrF6鋯化后，在3360 cm'2977 cm'1667 cm'1557cm'537 cnT1等波數(shù)處出現(xiàn)新的譜峰,其中3360 cnT1歸屬于菠蘿蛋白酶分子中的酰胺基中的胺基基團(tuán)，2977 cnT1歸屬于烷基，1667 cnT1和1557 cnT1是由酰胺基中的羰基伸縮振動(dòng)引起的，表明菠蘿蛋白酶誘導(dǎo)K2ZrF6鋯化產(chǎn)生的沉淀中確實(shí)包埋有菠蘿蛋白酶。對(duì)比固定化菠蘿蛋白酶(圖1-B)與二氧化鋯(圖1)可知，在500飛00 cnT1范圍內(nèi)均有明顯吸收，這是由Zr-O-Zr伸縮振動(dòng)引起的，表明在菠蘿蛋白酶的誘導(dǎo)下，K2ZrFf-g化確實(shí)生成了二氧化鋯。結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶可作為模板誘導(dǎo)K2ZrF6鋯化生成二氧化鋯且菠蘿蛋白酶分子本身被包埋在沉淀中從而實(shí)現(xiàn)固定化。
[0018]實(shí)施例2:
室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入10 mL 0.035 mol/L K2ZrF6溶液，再向固定化反應(yīng)器中加入10 mL用pH 8.0、濃度為0.08 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的濃度為8 mg/mL胰蛋白酶溶液，使K2ZrF6溶液與胰蛋白酶溶液的體積比為1:1 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24小時(shí)，所得的固定化酶酶活回收率為46.69%，胰蛋白酶包埋率為63.03%,同批固定化酶重復(fù)使用5次后酶活仍可保持60%以上。[0019]實(shí)施例3:
室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入10 mL 0.02 mol/L K2ZrF6溶液，再向固定化反應(yīng)器中加入20 mL用pH 6.5、濃度為0.08 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的濃度為8 mg/mL木瓜蛋白酶溶液，使K2ZrF6溶液與木瓜蛋白酶溶液的體積比為1:2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24小時(shí)，所得的固定化酶酶活回收率為54.45%，木瓜蛋白酶包埋率為89.15%，同批固定化酶重復(fù)使用6次后酶活仍可保持60%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種基于自誘導(dǎo)仿生鋯化固定化蛋白酶的方法，其特征在于具體步驟為: 室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入8-12 mL濃度為0.01、.05 mo I/L的鋯前驅(qū)體溶液，然后加入8-24 mL用pH 6.0-8.0、濃度0.02 mol/L-0.12 mol/L的緩沖液配制的濃度為4 mg/mL-12 mg/mL游離蛋白酶溶液,使錯(cuò)前驅(qū)體溶液與游離蛋白酶溶液的體積比為1: 1-2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；沉淀用蒸懼水洗漆3次后,冷凍干燥,得到固定化酶； 所述游離蛋白酶為菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種； 所述鋯前驅(qū)體溶液為K2ZrF6溶液； 所述緩沖液為磷酸鹽 緩沖液，為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合制成。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK103451176SQ201310427882
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月21日
【發(fā)明者】李海云, 余艷葵, 阮貴華, 李子院 申請(qǐng)人:桂林理工大學(xué)