一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因、含有該基因的載體、重組株、重組蛋白、多抗隆抗體及其應用。發(fā)明公開了一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因，該基因是以尼羅羅非魚頭腎總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR和RACE方法而得到的具有尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因全長cDNA序列的基因片段；本發(fā)明構(gòu)建了含該基因的載體和重組株；本發(fā)明還運用大腸桿菌原核表達了來源穩(wěn)定、成本便宜的活性尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因重組蛋白，本發(fā)明還檢測了該尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因重組蛋白對Hela細胞的凋亡活性，可以進一步制備為抗癌藥物。制備了抗尼羅羅非魚凋亡因子FasL多抗隆抗體，并測定了其效價，為進一步開發(fā)為定量檢測羅非魚FasL試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種尼羅羅非魚調(diào)亡因子FasL基因及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及的是一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因及含有該基因的載體和重組株以及該基因在制備免疫佐劑或檢測試劑盒中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]FasL (⑶95L)是細胞凋亡系統(tǒng)中的外源凋亡途徑中的凋亡配體，與其靶細胞上的受體FasR(Alapo-l，⑶95)蛋白結(jié)合后，誘導靶細胞凋亡。FasL主要在活化的白血病細胞、外周血T細胞，巨噬細胞甚至一些非免疫組織有FasL的表達，F(xiàn)as可以在免疫細胞、實體組織細胞表面廣泛表達。
[0003]FasL是II型跨膜蛋白，它們能以膜結(jié)合形式或經(jīng)基質(zhì)溶解因子(金屬酶Matrilysin)切割成可溶形式與死亡受體結(jié)合，但凋亡活性比膜結(jié)合形式的FasL低。
[0004]Fas屬于I型跨膜蛋白，包括一個富含Cys區(qū)域，一個跨膜區(qū)，和一個胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域。
[0005]死亡配體和受體結(jié)合后導致受體三聚化，接頭分子通過與受體DDs的蛋白質(zhì)接觸被招募。接頭分子如FAlaDD含有DED結(jié)構(gòu)域能通過同種親和作用與起始caspases8, 10結(jié)合，被招募到受體復合物上，這種由受體，接頭分子，起始caspase組成的大復合物叫死亡誘導信號復合物(DISC),兩個線性的caspase8或10通過自身活化成為有活性的caspases。Caspase8或10能直接激活下游的執(zhí)行Caspases。執(zhí)行Caspases切割特異性的物質(zhì)導致細胞結(jié)構(gòu)的分解(如細胞骨架)，使蛋白質(zhì)失去功能(DNA損傷修復酶Ploy-ADP-核酸聚合酶)，或者是被激活(caspase依賴性的DNA酶)。
[0006]FasL/Fas凋亡途徑的功能:
T細胞穩(wěn)態(tài)維持=FasL隨T細胞的活化而在T細胞內(nèi)表達，在T細胞克隆性增殖過程中對Fas介導的凋亡有抵抗性，但隨活化時間增加，這種抵抗性逐漸減弱，最后啟動激活-誘導細胞死亡(ACD)，此工程有利于防止過強的免疫反應和清除自身反應性的T細胞。人類FasL/Fas系統(tǒng)發(fā)育不全會導致淋巴結(jié)病，脾腫大，全身性紅斑狼瘡。
[0007]毒性T細胞的活性(還有NK細胞):機體細胞被外來病原體感染時，毒性T細胞會通過激活FasL/Fas途徑介導被感染細胞凋亡。
[0008]此外，免疫赦免、腫瘤的抗性、產(chǎn)婦的耐受性等都與FasL/Fas凋亡途徑相關(guān)。
[0009]尼羅羅非魚是一 種全世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，被譽為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一。然而近年來，尼羅羅非魚病害嚴重，尤其是鏈球菌病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的困擾，這使得研究尼羅羅非魚病害治病機理以及隨后的預防治理工作顯得尤為重要。Fasl/Fas凋亡途徑是免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，尼羅羅非魚FasL凋亡因子的相關(guān)研究將為尼羅羅非魚病害治理提供依據(jù)。例如D.L.EVANS等證明羅非魚在海豚鏈球菌感染時，其自然殺傷細胞(NCC細胞)中的FasL蛋白的表達量增加，因此可以利用FasL作為一種監(jiān)測魚體受外來病原體感染的指標。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種重組尼羅羅非魚SFasL基因；
本發(fā)明的另一目的在于提供含有該基因的載體，特別是克隆載體和表達載體；
本發(fā)明的另一目的在于提供上述載體轉(zhuǎn)化的微生物菌株；
本發(fā)明的另一目的在于提供利用上述大腸桿菌重組株得到重組尼羅羅非魚sFasL蛋白質(zhì)的方法。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供檢測上述重組尼羅羅非魚sFasL蛋白活性的方法。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供了一種生產(chǎn)尼羅羅非魚sFasL蛋白多抗隆抗體的方法，并用Elisa方法檢測了其效價，及檢測試劑盒開發(fā)中的應用。
[0013]發(fā)明首先提供了一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]發(fā)明提供了一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因編碼蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0015]發(fā)明還提供了尼羅羅非魚凋亡因子FasL胞外活性區(qū)基因sFasL，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。該段序列是FasL基因中最關(guān)鍵的序列，其對應的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)與FasL配體結(jié)合，激活細胞凋亡。
[0016]上述胞外活性區(qū)基因sFasL的克隆載體，該載體為大腸桿菌克隆載體PTZ57/R_T_sFasL0
[0017]發(fā)明還提供了一種重組株，由上述的克隆載體PTZ57/R-T-sFasL轉(zhuǎn)入大腸桿菌疋col1.DH5a中所形成的大腸桿菌重組株P(guān)TZ57/R-T-sFasL_DH5 a。
[0018]發(fā)明提供了一種克隆載體或表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求3所述尼羅羅非魚凋亡因子FasL胞外活性區(qū)基因序列。
[0019]一種表達載體，該載體為大腸桿菌表達載體PQE30- sFasL。
[0020]一種重組株，是由權(quán)利要求7所述的表達載體PQE30- sFasL轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中所形成的大腸桿菌重組株P(guān)QE30- sFasL-M15。
[0021]發(fā)明還提供給了一種尼羅羅非魚sFasL重組蛋白，由所述的大腸桿菌重組株P(guān)QE30- sFasL-M15在IPTG誘導下表達的蛋白。
[0022]發(fā)明還提供了一種多抗，其特征在于該多抗為用權(quán)利要求3的尼羅羅非魚凋亡因子sFasL的重組蛋白免疫動物得到的抗血清。上述尼羅羅非魚sFasL重組蛋白兔源多抗，其特點在于用羅非魚sFasL蛋白作為包被抗原的El isa檢測中，結(jié)合效價高達1:8192000，可以開發(fā)為檢測羅非魚體乃至其他物種體內(nèi)FasL蛋白水平的試劑盒，從而檢測魚體受外來病原體感染的情況。(D.L.EVANS等證明羅非魚在海豚鏈球菌感染時，其自然殺傷細胞(NCC細胞)中的FasL蛋白的表達量增加)。
[0023]發(fā)明還提供了上述的基因或蛋白在制備抗癌制劑中的應用。發(fā)明發(fā)現(xiàn)上述基因或蛋白可以促進人宮頸癌細胞(Hela細胞)凋亡，可以進一步開發(fā)為抗癌藥物。優(yōu)選將上述的基因或蛋白進一步與放線酮組合作為抗癌藥物。
[0024]以下進一步說明本發(fā)明的研究思路: 本發(fā)明的尼羅羅非魚FasL全長基因是以尼羅羅非魚頭腎總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR和RAlaCE方法擴增而得到的，最初的引物設(shè)計是源于GENBANK預測的尼羅羅非魚FasL mRNA序列。
[0025]本發(fā)明用于表達尼羅羅非魚sFasL重組蛋白的基因序列是以尼羅羅非魚FasL全長基因雙鏈DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴增而得到的，尼羅羅非魚FasL跨膜蛋白胞外區(qū)域所對應的基因片段。
[0026]按照上述的尼羅羅非魚sFasL重組蛋白對應的基因序列，它正好是尼羅羅非魚FasL全長基因199bp至696bp (相當于67位至132位氨基酸)的片段,其核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列如序列表所示。
[0027]本發(fā)明還構(gòu)建了含有上述尼羅羅非魚sFasL重組蛋白的基因序列的載體；特別是含有該基因的大腸桿菌克隆載體以及表達載體。這些載體的構(gòu)建方法是按常規(guī)方法，將通過PCR方法合成的尼羅羅非魚sFasL基因經(jīng)酶切和分離純化后，接入到已有的相應載體的相應酶切位點(即HindIII和BamH/)之間，即構(gòu)建成所需的含有尼羅羅非魚sFasL基因的表達載體。[0028]上述含尼羅羅非魚sFasL的大腸桿菌表達載體優(yōu)選由本發(fā)明合成的尼羅羅非魚sFasL與大腸桿菌表達載體PQE-30構(gòu)建成的重組表達載體，命名為PQE30- sFasL。
[0029]本發(fā)明還用上述含有尼羅羅非魚sFasL基因的相應表達載體構(gòu)建了能高效表達尼羅羅非魚sFasL基因的大腸桿菌重組株。
[0030]本發(fā)明的上述能表達尼羅羅非魚sFasL大腸桿菌重組菌株優(yōu)選由含有尼羅羅非魚sFasL的表達載體PQE30- sFasL轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15而得到的菌株，命名為PQE30-sFasL_M150
[0031]本發(fā)明還提供了利用上述大腸桿菌重組株生產(chǎn)尼羅羅非魚sFasL的方法。先將菌種接種在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中，并經(jīng)IPTG誘導，28°C，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，6小時后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組尼羅羅非魚sFasL產(chǎn)品。
[0032]尼羅羅非魚具有重大的經(jīng)濟價值，采用常規(guī)的基因工程技術(shù)，可利用本發(fā)明的尼羅羅非魚FasL基因和重組株P(guān)QE30- sFasL_M15，生產(chǎn)重組尼羅羅非魚sFasL蛋白，并可進一步用作制備免疫佐劑或開發(fā)試劑盒。
[0033]本發(fā)明還提供了利用MTT法和DNAladder法檢測重組尼羅羅非魚sFasL蛋白活性的方法。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)尼羅羅非魚sFasL蛋白多抗隆抗體的方法，并用Elisa方法檢測了其效價。
[0034]細胞中存在促凋亡途徑和抗凋亡途徑，兩者協(xié)調(diào)作用控制細胞是否走向凋亡。抗凋亡途徑要發(fā)揮作用，需要新合成一些蛋白質(zhì)分子，而促凋亡途徑中的蛋白質(zhì)在細胞中有儲備，無需新合成。放線酮可以抑制抗凋亡途徑中的蛋白質(zhì)合成，在放線酮和凋亡因子Fasl(sFasL)作用下，細胞的凋亡途徑被啟動，而抗凋亡途徑被抑制，細胞走向凋亡。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是以尼羅羅非魚頭腎總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板的FasL基因中間片段PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖，其中:M.分子量標準；1.2為PCR擴增產(chǎn)物。
[0036]圖2是尼羅羅非魚FasL基因3’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析圖。其中:M.分子量標準；1.PCR擴增產(chǎn)物。[0037]圖3是尼羅羅非魚FasL基因5’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析圖。其中:M.分子量標準；1.PCR擴增產(chǎn)物。
[0038]圖4是尼羅羅非魚全長驗證PCR凝膠電泳分析圖。其中:M.分子量標準；1.PCR擴增產(chǎn)物。
[0039]圖5是以尼羅羅非魚全長DNA為模板，用KOD高保真酶，含有酶切片段的引物克隆的sFasL PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖。其中:M.分子量標準；1.PCR擴增產(chǎn)物。
[0040]圖6-1是表達載體PQE30- sFasL Bam H I和Hind III雙酶切前后電泳示意圖，其中:M.分子量標準；1:酶切前；2:酶切后。
[0041]圖6-2是重組表達載體PQE30- sFasL的構(gòu)建過程示意圖。
[0042]圖7是尼羅羅非魚sFasL重組表達菌株未加IPTG和加IPTG誘導的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜。其中，M:蛋白分子量；1:未用IPTG誘導的PQE30- sFasL-M15總菌；2 =IPTG誘導的 PQE30- sFasL-M15 總菌；3:1PTG 誘導的 PQE30- sFasL_M15 破碎后上清；4:sFasL純化后的蛋白樣。
[0043]圖8是尼羅羅非魚sFasL基因表達產(chǎn)物的Western blot鑒定圖譜。其中，M:蛋白分子量；1:未用 IPTG 誘導的 PQE30- sFasL-M15 總菌；2 =IPTG 誘導的 PQE30- sFasL_M15總菌；3 =IPTG誘導的PQE30- sFasL-M15破碎后上清；4:sFasL純化后的蛋白樣。
[0044]圖9是放線酮共刺激條件下下MTT法檢測sFasL細胞毒性中藥物濃度與細胞存活率的柱狀圖。
[0045]注:無放無BSA無Fa:刺激液中不含放線酮、不含BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 有放無BSA無Fa:刺激液中含20mM放線酮、不含BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 有放有BSA無Fa:刺激液中含20mM放線酮、含200ug/mL BSA不含sFasL蛋白質(zhì)實驗
組
有放Fa25:刺激液中含20mM放線酮，不含BSA，含25ug/mlsFasL蛋白質(zhì)的實驗組 有放Fa50:刺激液中含20mM放線酮，不含BSA，含50ug/mlSFaSL蛋白質(zhì)的實驗組 有放FalOO:刺激液中含20mM放線酮，不含BSA，含lOOug/mlsFasL蛋白質(zhì)的實驗組 有放Fa200:刺激液中含20mM放線酮，不含BSA，含200ug/mlSFaSL蛋白質(zhì)的實驗組 圖10是無放線酮條件下用MTT法檢測sFasL細胞毒性中，藥物濃度與細胞存活率間的 柱狀圖。
[0046]注:無放無BSA:刺激液中不含放線酮、不含BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 無放無BSA25:刺激液中不含放線酮、含25 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 無放無BSA50:刺激液中不含放線酮、含50 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 無放無BSA100:刺激液中不含放線酮、含100 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 無放無BSA200:刺激液中不含放線酮、含200 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白質(zhì)的實驗組 無放Fa25:刺激液中不含放線酮，不含BSA，含25ug/mlsFasL蛋白質(zhì)的實驗組 無放Fa50:刺激液中不含放線酮,不含BSA,含50ug/mlsFasL蛋白質(zhì)的實驗組無放FalOO:刺激液中不含放線酮，不含BSA，含lOOug/mlsFasL蛋白質(zhì)的實驗組無放Fa200:刺激液中不含放線酮，不含BSA，含200ug/mlSFaSL蛋白質(zhì)的實驗組圖11是DNA ladder法檢測FasL凋亡活性的電泳圖，其中M=DS2000 marker ;1=含sFasL與放線酮雙抗MEM培養(yǎng)基處理HeLa細胞IOh ；2=含sFasL與放線酮雙抗MEM培養(yǎng)基處理HeLa細胞13h ;3=含sFasL與放線酮雙抗MEM培養(yǎng)基處理HeLa細胞16h ；4=含sFasL與放線酮雙抗MEM培養(yǎng)基處理HeLa細胞19h ；5=含放線酮雙抗MEM培養(yǎng)基處理HeLa細胞19h ；6=無sFasL無放線酮雙抗MEM培養(yǎng)基對照組HeLa細胞19h。
【具體實施方式】
[0047]以下實施例是對
【發(fā)明內(nèi)容】
的闡釋，而非限制。
實施例1:尼羅羅非魚FasL基因中間片段的合成
根據(jù)GENBANK上預測的尼羅羅非魚FasL mRNA序列為引物設(shè)計模板，設(shè)計合成兩對引物，第一對引物中的上游引物(Sense)是從第342位堿基起20個堿基【5’ -GTGGGACACGACGCAITCTG】，下游引物(Ant1-sense)是從第575位堿基起17個堿基【5’ -ATCTCCCTGAGTGGCTGTGC】。第二對引物中的上游引物(Sense)是從第128位堿基起17個堿基【5’ - TGGTTGGCGTAGTGGTGCTG】，下游引物(Ant1-sense)是從第448位堿基起20個堿基【5’- ACCTTAGAATCGCCCTTGGA】。Touch-down PCR尼羅羅非魚頭腎臟總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴增原第342位至591位和第128位至467位的核苷酸序列，反應條件為:95°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)，分為兩個階段:(I )95°C變性30秒，從61°C向52 °C每兩個循環(huán)降0.3 °C，退火20秒，共30循環(huán)，72 V延伸50秒；(2 ) 95 °C變性20秒，52°C退火20秒，共10循環(huán)，72°C延伸50秒；最后72°C延伸5分鐘。最后將兩端片段拼接為464bp序列。
[0048]PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖1。從圖1可見PCR擴增的第一個片段長約340bp的序列，第二個片段長約250bp的序列。將兩個擴增產(chǎn)物分別連接到PTZ57/R-T載體上得到重組質(zhì)粒PTZ57/R-T-FasL-l, PTZ57/R-T-FasL_2。將重組質(zhì)粒PTZ57/R-T-FasL_l，PTZ57/R-T-FasL-2用PTZ57/R-T的一對通用引物進行序列測定，測序結(jié)果與GENBANK的序列進行比較，結(jié)果表明克隆的PCR產(chǎn)物是尼羅羅非魚FasL基因的中間片段。
[0049]實施例2:尼羅羅非魚FasL基因5’端片段的合成
依據(jù)已測序的FasL中間片段的序列設(shè)計了兩條下游引物Fa-5’ -Rl和Fa_5’ -R4以進行嵌套PCR。第一條下游引物(Fa-5’-Rl)是從已測序的FasL中間片段的序列第199位堿基起22個堿基【5’ - CCACTGAAGACAACCCGATA】，第二條下游引物(Fa_5，-R4)是從第4位堿基起22個堿基【5’ - AATAAATGCAGCACCACTACGC】。第一次PCR以上述例I得到的PCR產(chǎn)物稀釋產(chǎn)物(1:10)為模板，經(jīng)降落PCR方法擴增中間片段第218位至5’端的核苷酸序列，反應條件為:94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)，分為兩個階段:(I) 94°C變性20秒，從570C向47°C每個循環(huán)降0.5°C，退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸50秒；(2) 94°C變性20秒，47°C退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸50秒；最后72°C延伸10分鐘。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物稀釋產(chǎn)物(1:10)為模板，經(jīng)PCR方法擴增中間片段第25位至5’端的核苷酸序列，反應條件為:94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)，分為兩個階段:(1) 94°C變性20秒，從59 °C向53 °C每個循環(huán)降0.3 °C，退火20秒，共20循環(huán)，72 °C延伸50秒；(2 )94 V變性20秒，53°C退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸50秒；最后72°C延伸10分鐘。二次PCR擴增在257bp出現(xiàn)了預期條帶，電泳鑒定圖見圖2。
[0050]將257bp的擴增產(chǎn)物連接到PTZ57/R-T載體上得到重組質(zhì)粒PTZ57/R-T -5’-257。將重組質(zhì)粒PTZ57/R-T -5’ -257用PTZ57/R-T的一對通用引物進行序列測定，測序結(jié)果與GENE BANK的序列進行比較，結(jié)果表明克隆的257bp產(chǎn)物是尼羅羅非魚FasL5’端基因。
[0051]實施例3:尼羅羅非魚FasL基因3’端片段的合成
依據(jù)已測序的FasL中間片段的序列設(shè)計了兩條下游引物Fa-3’ _Fl，F(xiàn)a_3’ -F2以進行嵌套PCR。第一條下游引物(Fa-3’-Fl)是從已測序的FasL中間片段的序列第320位堿基起20個堿基【5’- TCCAAGGGCGATTCTAAGGT】，第二條下游引物(F Race F2)是從第344位堿基起20個堿基【5’ - ACTAGCCAGCAAGGTCCAGC】。第一次PCR以上述例I得到的PCR產(chǎn)物稀釋產(chǎn)物(1: 10)為模板，經(jīng)降落PCR方法擴增中間片段第320位至5’端的核苷酸序列，反應條件為:94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)，分為兩個階段:(1)94°C變性20秒，從60°C向52 0C每個循環(huán)降0.4°C，退火20秒，共20循環(huán)，72 °C延伸60秒；(2 )94 V變性20秒，52 °C退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸60秒；最后72°C延伸10分鐘。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物稀釋產(chǎn)物(1: 10)為模板，經(jīng)PCR方法擴增中間片段第344位至5’端的核苷酸序列，反應條件為:94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)，分為兩個階段:(1)94°C變性20秒，從59°C向53°C每個循環(huán)降0.3°C，退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸60秒；(2)94°C變性20秒，53°C退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸60秒；最后72°C延伸10分鐘。二次PCR擴增在514bp出現(xiàn)了預期條帶，電泳鑒定圖見圖3。
[0052]將2514bp的擴增產(chǎn)物連接到PTZ57/R-T載體上得到重組質(zhì)粒PTZ57/R-T-3’ -514。將重組質(zhì)粒PTZ57/R-T -3’ -514用PTZ57/R-T的一對通用引物進行序列測定，測序結(jié)果與GENE BANK的序列進行比較，結(jié)果表明克隆的514bp產(chǎn)物是尼羅羅非魚FasL3’
端基因。
`[0053]實施例4:尼羅羅非魚FasL基因全長序列的拼接及ORF (開放閱讀框)驗證 將已經(jīng)測序的FasL中間片段、5’ RACE片段和3’ RACE片段進行拼接，得到尼羅羅非魚
FasL基因的全長，為1028bp，并從71bp處的起始密碼開始，到其終止密碼結(jié)束，推測出其氨基酸序列。FasL基因全長和推測的氨基酸序列見序列表。
[0054]根據(jù)拼接好的尼羅羅非魚FasL基因cDNA全序列，設(shè)計合成引物，上游引物是在ORF前端第20位堿基起的19個堿基【5’ -TGTCACCGCTCCGCTCTAT】;下游引物是ORF后第87位堿基起的20個堿基，【5’ -TCCACGAAGATGTTTGAGCC】。用高保真KOD酶，及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR驗證FasL 0RF，根據(jù)驗證的ORF序列，PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖4，從圖4可見PCR擴增了一段長約，823bp的序列。
[0055]將擴增產(chǎn)物回收測序，測序結(jié)果與GENE BANK的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)GENE BANK預測序列完全符合本實驗結(jié)果。
[0056]實施例5:尼羅羅非魚sFasL基因的合成
設(shè)計合成兩段引物合成sFasL基因，上游引物是在ORF第199位堿基起的25個堿基前加上BamHI的限制酶切位點以及保護堿基【5’ - CGCGGATCCGAAAAACATTTCTCAGCAGAAGATA],共34bp ;下游引物是在第673位堿基起的27個含有終止密碼子的堿基，加上HandIII的限制酶切位點和保護堿基【5’ - CCCAAGCITTTATAGITTGTATATCCCAAAGnTGT】，共36bp。以尼羅羅非魚FasL基因全長克隆PCR產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR方法擴增尼羅羅非魚FasL基因第67位至第232位氨基酸序列相應的DNA序列即尼羅羅非魚sFasL基因，PCR反應條件為:94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán):94°C變性20秒，51.5°C退火20秒，72°C延伸55秒；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖5。從圖5可見PCR擴增了一段長約516bp的序列。
[0057]將516bp的擴增產(chǎn)物連接到PTZ57/R-T載體上得到重組質(zhì)粒PTZ57/R-T -sFasL。將重組質(zhì)粒PTZ57/R-T -sFasL用PTZ57/R-T的一對通用引物進行序列測定，測序結(jié)果與已測序的ORF序列及兩端位點序列進行比較，結(jié)果表明克隆的516bp產(chǎn)物是尼羅羅非魚sFasL表達基因。
[0058]實施例6:含尼羅羅非魚FasL基因的大腸桿菌表達載體PQE30-sFasL的構(gòu)建 質(zhì)粒PTZ57/R-T -sFasL經(jīng)限制酶BamHI和HindIII酶切后，酶切產(chǎn)物用E.Z.N.A.?
Gel Extraction Kit回收。接著再將PQE30空載體用限制酶BamHI和HindIII酶切后，分離純化3.5kb的大片段，與516bp的尼羅羅非魚FasL基因片段按1:3混合，用Ferment T4連接酶4°C連接過夜后用標準氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15大腸桿菌感受態(tài)細胞中，篩選具氨芐青霉素和卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，以標準方法提取質(zhì)粒，用限制酶Kpn I及Not I雙酶切重組質(zhì)粒，得到516bp和3.5kb的兩個片段，大小分別與尼羅羅非魚FasL基因和表達載體PQE30大小相同，證明尼羅羅非魚FasL基因已克隆入大腸桿菌表達載體PQE30中，重組質(zhì)粒命名為PQE30-sFasL。質(zhì)粒酶切分析圖和構(gòu)建圖分別見圖6_1及圖6_2。 [0059]實施例7:能高效表達尼羅羅非魚FasL的大腸桿菌重組株P(guān)QE30-sFasL_M15的構(gòu)建
CaCl2法將PQE30-sFasL轉(zhuǎn)化E coli Ml 5菌株，在含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測和酶切分析獲得含PQE30-sFasL的重組轉(zhuǎn)化子PQE30_sFasL_M15。
[0060]實施例8:利用大腸桿菌基因工程菌PQE30-sFasL_M15生產(chǎn)重組尼羅羅非魚凋亡因子sFasL
挑取大腸桿菌基因工程菌PQE30-sFasL-M15單菌落接種在含有50ug/ml氨芐青霉素和30ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日按1:50接種量接種于適當體積的相同培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至A_為0.5~0.6，加入IPTG (終濃度為0.4mmol/I )，于28°C誘導培養(yǎng)6小時后收菌。合成的尼羅羅非魚凋亡因子sFasL在大腸桿菌基因工程菌PQE30-sFasL-M15中已獲得高效表達。
[0061]取少量細胞加5 X電泳上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標準方法跑SDS-PAGE凝膠電泳，顯示經(jīng)誘導的PQE30-sFasL-M15在約20.3kD的位置上出現(xiàn)一條蛋白帶，未誘導的PQE30-sFasL-M15幾乎不出現(xiàn)此帶，證明尼羅羅非魚凋亡因子sFasL在PQE30-sFasL-M15中誘導表達，將超聲破碎后的誘導菌液離心收集上清，電泳后發(fā)現(xiàn)目的蛋白大部分存在于上清中，以可溶形式表達，目的蛋白經(jīng)純化后得到單一條帶如圖7。
[0062]將重組尼羅羅非魚凋亡因子sFasL采用免疫印跡(Western blot)方法進行免疫活性鑒定。一抗為鼠抗與sFasL融合表達的His標簽單抗，二抗為羊抗鼠IgG_AP。結(jié)果見圖8，顯示鼠抗His標簽單克隆抗體能識別與His標簽融合表達的sFasL蛋白，結(jié)合PQE30-sFasL重組子的DNA測序結(jié)果，證明得到的蛋白是重組尼羅羅非魚凋亡因子sFasL。
[0063]實施例9:利用MTT法和DNA ladder法檢測重組尼羅羅非魚凋亡因子sFasL的蛋白活性
1.MTT 法
接種HeLa細胞:將對數(shù)期的HeLa細胞調(diào)整濃度至I X IO5,將稀釋的細胞接種至96孔板的3-11列，每孔IOOuL,板四周孔加入PBS，消除水分蒸發(fā)引起的誤差。將板置于37度，5% co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h。
[0064]sFasL孵育HeLa細胞:配置孵育液:取20mLMEM培養(yǎng)基，加入200uL雙抗配成MK，取出15mL加入15ul 20mM放線酮儲備液(終濃度20um/mL=5.6ug/mL配成MK放，在2mL MK加8uL50ug/uL的sFasL原液,配置成含200ug/mL sFasL的MK放F,用0.22um微孔濾膜過濾除菌，取出ImL于另一管中，加入ImL無FBS加雙抗的MEM培養(yǎng)基配成100ug/mL孵育液，依次濃度為50ug/mL和25ug/mL孵育液。如下加入96孔板:
【權(quán)利要求】
1.一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因，該基因其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種尼羅羅非魚凋亡因子FasL基因編碼蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.—種尼羅羅非魚凋亡因子FasL胞外活性區(qū)基因sFasL，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；或其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
4.如權(quán)利要求3所述基因的克隆載體或表達載體，其特征在于所述克隆載體為大腸桿菌克隆載體PTZ57/R-T-sFasL ;所述表達載體為PQE30- sFasL。
5.一種重組株，其特征在于是由權(quán)利要求4所述的克隆載體PTZ57/R-T-sFasL轉(zhuǎn)入大腸桿菌疋col1.0冊0中所形成的大腸桿菌重組株？了257/1?-1'-8?381-0冊0。
6.一種克隆載體或表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求3所述尼羅羅非魚凋亡因子FasL胞外活性區(qū)基因序列。
7.一種重組株，其特征在于是由權(quán)利要求7所述的表達載體PQE30- sFasL轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中所形成的大腸桿菌重組株P(guān)QE30- sFasL-M15。
8.—種尼羅羅非魚sFasL重組蛋白，其特征在于是由權(quán)利要求8所述的大腸桿菌重組株P(guān)QE30- sFasL-M15在IPTG誘導下表達的蛋白。
9.如權(quán)利要求1或3所述基因，或權(quán)利要求2或9所述蛋白，在制備抗癌制劑中的應用，所述癌為宮頸癌。
10.一種抗癌藥物，其特征在于含有權(quán)利要求2或9所述蛋白，并含有放線酮。
【文檔編號】C12N15/70GK103642812SQ201310438243
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】吳金英, 馬太洋, 李文笙 申請人:中山大學