專利名稱：可溶性t細(xì)胞受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可溶性T細(xì)胞受體(TCRs)。
如在WO 99/60120中所描述的，TCRs介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)特異的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-肽復(fù)合體的識(shí)別，并由此對(duì)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫功能至關(guān)重要。
抗體和TCRs是以特異性方式識(shí)別抗原的僅有的兩類分子，且因此TCR為呈現(xiàn)在MHC上的特定肽抗原的唯一受體，處源肽通常為細(xì)胞內(nèi)異常性的唯一指征。T細(xì)胞識(shí)別發(fā)生于T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)出現(xiàn)直接的物理接觸時(shí)，并由抗原特異的TCRs與pMHC復(fù)合體的結(jié)合啟動(dòng)。
TCR為免疫球蛋白超家族的異源二聚體細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，所述超家族與參與介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD3復(fù)合體的恒定蛋白質(zhì)有關(guān)。TCRs以αβ和γδ形式存在，這兩種形式受體的結(jié)構(gòu)類似，但表達(dá)它們的T細(xì)胞具有截然不同的解剖學(xué)定位且功能也可能不同。受體的胞外部分由兩個(gè)近膜的恒定結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)遠(yuǎn)膜的可變結(jié)構(gòu)域組成，所述可變結(jié)構(gòu)域具有與抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)類似的多態(tài)性環(huán)。正是這些環(huán)形成了TCR分子的結(jié)合位點(diǎn)并決定肽特異性。MHC I類和II類配體也為免疫球蛋白超家族蛋白質(zhì)，但其特異用于抗原呈遞，具有的多態(tài)性肽結(jié)合位點(diǎn)使其可在APC細(xì)胞表面呈遞不同排列的短肽片段。
可溶性TCRs不僅可用于研究特異的TCR-pMHC相互作用，也可用作檢測感染或檢測自身免疫性疾病標(biāo)志的潛在診斷工具?？扇苄訲CRs也可用于染色，例如將細(xì)胞染色以確定在MHC中呈現(xiàn)的特異肽抗原的存在。類似地，可溶性TCRs可用于將治療劑如細(xì)胞毒素化合物或免疫刺激性化合物遞送到呈遞特異抗原的細(xì)胞?？扇苄訲CRs也可用于抑制T細(xì)胞，例如，抑制那些與自身免疫性肽抗原反應(yīng)的細(xì)胞。
由于在許多情形下，蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域穩(wěn)定蛋白質(zhì)，因此可能很難以可溶形式生成由多于一個(gè)多肽亞單位組成且具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。對(duì)TCR而言也是如此，這在科學(xué)文獻(xiàn)中有所體現(xiàn)，所述文獻(xiàn)描述了截短形式的TCR，其僅含有胞外結(jié)構(gòu)域或含有胞外結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域，可被TCR特異的抗體識(shí)別(表明由抗體識(shí)別的重組TCR部分已正確折疊)，但其不能以高產(chǎn)量生成且在低濃度時(shí)不穩(wěn)定和/或不能識(shí)別MHC-肽復(fù)合體。WO99/60120對(duì)此文獻(xiàn)進(jìn)行了評(píng)述。
許多論文描述了具有連接各亞單位的天然二硫橋的TCR異源二聚體的產(chǎn)生(Garboczi等，(1996)，自然(Nature)384(6605)134-41；Garboczi等，(1996)，免疫學(xué)雜志(J Immunol)157(12)5403-10；Chang等，(1994)，PNAS USA 9111408-11412；Davodeau等，(1993)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)268(21)15455-15460；Golden等，(1997)，免疫學(xué)方法雜志(J.Imm.Meth.)206163-169；美國專利6080840號(hào))。但是，盡管此類TCRs可由TCR特異的抗體識(shí)別，但其僅能在相對(duì)高的濃度下顯示出對(duì)天然配體的識(shí)別且/或不穩(wěn)定。
在WO 99/60120中，描述的可溶性TCR經(jīng)過正確折疊以使其能夠識(shí)別其天然配體，經(jīng)過一段時(shí)間后仍穩(wěn)定，且可以可觀的數(shù)量產(chǎn)生。該TCR包含的TCRα或γ鏈的胞外結(jié)構(gòu)域分別與TCRβ或δ鏈的胞外結(jié)構(gòu)域二聚化，所述二聚化通過一對(duì)C-末端二聚化肽例如亮氨酸拉鏈實(shí)現(xiàn)。生成TCRs的該策略通?？蓱?yīng)用于所有TCRs中。
Reiter等，免疫學(xué)(Immunity)，1995，2281-287中詳細(xì)說明了包含二硫鍵穩(wěn)定的TCRα和β可變結(jié)構(gòu)域的可溶性分子的構(gòu)建，其中的一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域與截短形式的假單胞菌外毒素(PE38)連接。產(chǎn)生該分子的一個(gè)原因是為了克服單鏈TCRs固有的不穩(wěn)定性。TCR可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)已前期導(dǎo)入的新二硫鍵的位置通過與抗體可變結(jié)構(gòu)域的同源性得以鑒定(例如參見Brinkmann等(1993)，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)907538-7542，和Reiter等(1994)生物化學(xué)(Biochemistry)335451-5459)。但是，由于在抗體恒定結(jié)構(gòu)域和TCR恒定結(jié)構(gòu)域間不存在此類同源性，該技術(shù)不能用于鑒定TCR恒定結(jié)構(gòu)域間新鏈間二硫鍵的合適位點(diǎn)。
鑒于可溶性TCRs的重要性，需要提供產(chǎn)生該分子的備選方法。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了可溶性T細(xì)胞受體(sTCR)，其包含(i)除其跨膜結(jié)構(gòu)域外的全部或部分的TCRα鏈，以及(ii)除其跨膜結(jié)構(gòu)域外的全部或部分的TCRβ鏈，其中(i)和(ii)中的每一鏈均包含TCR鏈的一功能性可變結(jié)構(gòu)域和至少一部分的恒定結(jié)構(gòu)域，并通過不存在于天然TCR的恒定結(jié)構(gòu)域殘基間的二硫鍵進(jìn)行連接。
另一方面，本發(fā)明提供了可溶性αβ形式的T細(xì)胞受體(sTCR)，其中免疫球蛋白區(qū)α鏈恒定結(jié)構(gòu)域的殘基與免疫球蛋白區(qū)β鏈恒定結(jié)構(gòu)域的殘基通過共價(jià)二硫鍵連接。
本發(fā)明sTCRs的優(yōu)點(diǎn)在于其不含異源多肽，所述異源多肽可能具有免疫原性或可導(dǎo)致TCR從體內(nèi)快速清除。此外，本發(fā)明的TCRs的三維結(jié)構(gòu)與其來源的天然TCRs結(jié)構(gòu)非常類似，由于該結(jié)構(gòu)類似性，本發(fā)明的TCRs產(chǎn)生免疫原性的可能性較低。根據(jù)本發(fā)明的sTCRs可用于識(shí)別I類MHC-肽復(fù)合體或II類MHC-肽復(fù)合體。
本發(fā)明的TCRs為可溶性。在此申請(qǐng)的上下文中，溶解性定義為TCR以1mg/ml濃度在磷酸鹽緩沖液(PBS)(KCL 2.7mM、KH2PO41.5mM、NaCl137mM及Na2PO48mM，pH7.1-7.5.Life Technologies，Gibco BRL)中純化為單分散二聚體形式的能力，且在25℃孵育1個(gè)小時(shí)后＞90％的該TCR仍保持為單分散二聚體形式。為評(píng)估TCR的溶解性，首先如實(shí)施例2中的描述進(jìn)行純化。純化后，100μg的TCR通過分析用大小排阻色譜法進(jìn)行分析，例如應(yīng)用PBS平衡的Pharmacia Superdex 75 HR柱進(jìn)行分析。另將100μg的TCR在25℃孵育1小時(shí)然后用如前的大小排阻色譜進(jìn)行分析。然后通過積分法分析大小排阻圖并比較與單分散異源二聚體對(duì)應(yīng)的峰下面積。通過與已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的洗脫位置進(jìn)行比較可對(duì)相關(guān)峰進(jìn)行鑒定。單分散異源二聚可溶性TCR的分子量約為50kDa。如以上所提及，本發(fā)明的TCRs為可溶的。但是，如在以下詳細(xì)解釋的，TCRs可與另一分子偶聯(lián)以使產(chǎn)生的復(fù)合體為不溶的，或可呈現(xiàn)在不溶性固體支持物的表面。
此處應(yīng)用的TCR氨基酸編號(hào)方式按照，T Cell Receptor Factsbook，2001，LeFranc & LeFranc，Academic Press一書中描述的IMGT系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中，α鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下的符號(hào)TRAC*01，其中“TR”表示T細(xì)胞受體基因；“A”表示α鏈基因；C表示恒定區(qū)；且“*01”表示等位基因1。β鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下的符號(hào)TRBC1*01。在此例子中，存在兩個(gè)可能的恒定區(qū)基因“C1”和“C2”。由每一等位基因編碼而翻譯的結(jié)構(gòu)域可由來自幾個(gè)外顯子的遺傳密碼組成；因此它們也是特異的。根據(jù)其存在的特定結(jié)構(gòu)域的外顯子對(duì)氨基酸進(jìn)行編號(hào)。
天然TCR的胞外部分由兩條多肽(αβ或γδ)組成，每一條多肽均具有一近膜恒定結(jié)構(gòu)域和一遠(yuǎn)膜可變結(jié)構(gòu)域(參見

圖1)。每一恒定和可變結(jié)構(gòu)域均包括一鏈內(nèi)二硫鍵?？勺兘Y(jié)構(gòu)域包含類似于抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的高度多態(tài)性環(huán)。TCR的CDR3與MHC呈遞的肽相互作用，且CDRs1和2與肽和MHC相互作用。TCR序列的多樣性通過連接的可變基因(V)、多樣性基因(D)、連接基因(J)和恒定基因的體細(xì)胞重排得以產(chǎn)生。經(jīng)重排的V-J-C區(qū)形成功能性α鏈多肽，而β鏈由V-D-J-C區(qū)組成。胞外恒定結(jié)構(gòu)域具有一近膜區(qū)和一免疫球蛋白區(qū)。近膜區(qū)由跨膜結(jié)構(gòu)域和近膜的半胱氨酸殘基間的氨基酸組成。恒定免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域由其余的恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基組成，其從近膜的半胱氨酸延伸至連接區(qū)的起始，且其特征在于存在免疫球蛋白型的折疊。存在一單獨(dú)的α鏈恒定結(jié)構(gòu)域，稱作Cα1或TRAC*01，以及兩個(gè)不同的β恒定結(jié)構(gòu)域，稱作Cβ1或TRBC1*01以及Cβ2或TRBC2*01。這些不同β恒定結(jié)構(gòu)域間的差異與外顯子1的4、5和37位氨基酸殘基有關(guān)。因此，TRBC1*01在其外顯子1中具有4N、5K和37，且TRBC2*01在其外顯子1中具有4K、5N和37Y。每一TCR胞外結(jié)構(gòu)域長度均存在一定程度的變化。
在本發(fā)明中，在位于各條鏈恒定結(jié)構(gòu)域(或其部分)內(nèi)的殘基間導(dǎo)入二硫鍵。TCR的各條鏈中包含足夠的能與pMHC復(fù)合體相互作用的可變結(jié)構(gòu)域。此類相互作用可應(yīng)用BIAcore 3000TM或BIAcore 2000TM儀器進(jìn)行測定，如在此處的實(shí)施例3或在WO 99/6120中分別描述的。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明sTCR的各條鏈也包含其鏈內(nèi)二硫鍵。本發(fā)明的TCR可包含各條TCR鏈的所有胞外恒定Ig區(qū)，且優(yōu)選地包含各條鏈的所有胞外結(jié)構(gòu)域，即包括近膜區(qū)。在天然TCR中，存在連接各條鏈的保守近膜區(qū)的二硫鍵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方中，不存在該二硫鍵?？赏ㄟ^將適宜的半胱氨酸殘基(分別來自TRAC*01基因外顯子2的第4位氨基酸以及來自TRBC1*01和TRBC2*01基因的第2位氨基酸)突變?yōu)榱硪话被峄蛲ㄟ^將相應(yīng)鏈截短以使其不包括半胱氨酸殘基來達(dá)到缺失二硫鍵的目的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的可溶性TCR包含C末端截短的天然α和βTCR鏈，這樣其不含可形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基，即，在距半胱氨酸殘基N末端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)殘基處截短。但應(yīng)當(dāng)指出，天然鏈間二硫鍵可存在于本發(fā)明的TCRs中，并且在某些實(shí)施例中，僅一條TCR鏈具有形成天然鏈間二硫鍵的天然半胱氨酸殘基。該半胱氨酸用于將另外的分子與TCR連接。
但是，各條TCR鏈可更短。由于恒定結(jié)構(gòu)域并不直接參與與肽-MHC配體的接觸，因此可改變C末端的截短位點(diǎn)而基本不喪失其功能。
備選地，恒定結(jié)構(gòu)域可存在大于此處優(yōu)選的片段，即不需在緊挨著形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸前截短恒定結(jié)構(gòu)域。例如，可包括除跨膜結(jié)構(gòu)域外的完整恒定結(jié)構(gòu)域(即胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。在此情況下將細(xì)胞TCR中形成鏈間二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基突變?yōu)椴粎⑴c二硫鍵形成的另一氨基酸殘基，或?qū)⑦@些殘基中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行缺失，可能也是有利的。
如果在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)中表達(dá)可溶性TCR，可省略信號(hào)肽，這是因?yàn)樾盘?hào)肽在成熟TCR中對(duì)其配體結(jié)合能力不行使任何功能，并在一些情況下可阻止功能性可溶TCR的形成。多數(shù)情況下，信號(hào)肽從成熟TCR鏈移除的切割位點(diǎn)為預(yù)測得出而不是經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的。對(duì)表達(dá)的TCR鏈進(jìn)行操作，以使其在N末端具有略長或略短的氨基酸(例如約10個(gè)氨基酸)，這樣的操作對(duì)可溶性TCR的功能(即識(shí)別pMHC的能力)并無顯著的影響?？杉尤朐谠嫉鞍踪|(zhì)序列中并不存在的某些序列。例如，可加入有助于純化TCR鏈的短標(biāo)簽序列，條件是該序列并不干擾TCR抗原結(jié)合位點(diǎn)的正確結(jié)構(gòu)及正確折疊。
在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，可將蛋氨酸殘基加到預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)序列的N末端起始位點(diǎn)，以啟動(dòng)翻譯。
并非TCR鏈可變結(jié)構(gòu)域中所有殘基均對(duì)抗原特異性和功能性至關(guān)重要。因此，可在此結(jié)構(gòu)域?qū)胂喈?dāng)數(shù)量的突變而不影響抗原特異性和功能性。并非TCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域中所有殘基均對(duì)抗原特異性和功能性至關(guān)重要。因此，可在此區(qū)域?qū)胂喈?dāng)數(shù)量的突變而不影響抗原特異性。
TCRβ鏈含有一個(gè)在細(xì)胞或天然TCR中不配對(duì)的半胱氨酸殘基。如果將此半胱氨酸殘基移除或突變成另一殘基以避免不正確的鏈內(nèi)或鏈間配對(duì)時(shí)為優(yōu)選。該半胱氨酸殘基替換成另一殘基，例如替換成絲氨酸或丙氨酸，可對(duì)體外折疊效率產(chǎn)生顯著的正面影響。
可將各條鏈上的非半胱氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼岵⒁鹜蛔儦埢g可形成二硫鍵。在天然TCR中，其相應(yīng)β碳相距約6(0.6nm)或更小，且優(yōu)選地在3.5(0.35nm)到5.9(0.59nm)范圍內(nèi)的殘基是優(yōu)選的，這樣代替天然殘基而導(dǎo)入的半胱氨酸殘基間可形成二硫鍵。如果二硫鍵位于免疫球蛋白恒定區(qū)的殘基間時(shí)為優(yōu)選，盡管該鍵可能位于近膜區(qū)的殘基間?？蓪腚装彼釋?dǎo)入以形成二硫鍵的優(yōu)選位點(diǎn)為以下TCRα鏈TRAC*01外顯子1中的殘基以及TCRβ鏈TRBC1*01或TRBC2*01中的殘基TCRα鏈TCRβ鏈 天然β碳間隔(nm)Thr48 Ser570.473Thr45 Ser770.533Tyr10 Ser170.359Thr45 Asp590.560Ser15 Glu150.59本發(fā)明的一個(gè)sTCR源自A6 Tax TCR(Garboczi等，自然(Nature)，1996，384(6605)134-141)。在一實(shí)施方案中，sTCR包含的完整TCRα鏈為外顯子2的N端、TRAC*01的殘基4(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為α鏈的1-182位氨基酸殘基)且包含的完整TCRβ鏈為外顯子2的N端、TRBC1*01及TRBC2*01的殘基2(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為β鏈的1-210位氨基酸殘基)。為形成二硫鍵，TRAC*01外顯子1的48位蘇氨酸(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為α鏈的158位蘇氨酸)以及TRBC1*01和TRBC2*01二者中外顯子1的57位絲氨酸(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為β鏈的172位絲氨酸)可各自突變?yōu)榘腚装彼?。這些氨基酸分別位于α和βTCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域的β鏈D。
需指出的是，圖3a和3b中的殘基1(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式)分別為K和N。N末端蛋氨酸殘基并不存在于天然A6 Tax TCR中，且如上所提及，當(dāng)相關(guān)鏈在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生時(shí)有時(shí)可存在N末端蛋氨酸殘基。
由于已鑒定出人類TCRs中可突變成半胱氨酸殘基用以形成新鏈間二硫鍵的殘基，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將能夠以相同的方法突變?nèi)魏蔚腡CR以產(chǎn)生具有新鏈間二硫鍵的該TCR的可溶性形式。在人類，技術(shù)人員僅需要在相應(yīng)TCR鏈中尋找以下的基序以確定出待突變的殘基(陰影處的殘基為用以突變成半胱氨酸的殘基)α鏈Thr 48DSDVYITDK VLDMRSMDFK(TRAC*01基因外顯子1的39-58位氨基酸)α鏈Thr45QSKDSDVYI DKTVLDMRSM(TRAC*01基因外顯子1的36-55位氨基酸)α鏈Tyr10DIQNPDPAV QLRDSKSSDK(TRAC*01基因外顯子1的1-20位氨基酸)α鏈Ser15DPAVYQLRD KSSDKSVCLF(TRAC*01基因外顯子1的6-25位氨基酸)β鏈Ser57NGKEVHSGV TDPQPLKEQP(TRBC1*01和TRBC2*01基因外顯子1的48-67位氨基酸)
β鏈Ser77ALNDSRYAL SRLRVSATFW(TRBC1*01和TRBC2*01基因外顯子1的68-87位氨基酸)β鏈Ser17PPEVAVFEP EAEISHTQKA(TRBC1*01和TRBC2*01基因外顯子1的8-27位氨基酸)β鏈Asp59KEVHSGVST PQPLKEQPAL(TRBC1*01和TRBC2*01基因外顯子1的50-69位氨基酸)β鏈Glu15VFPPEVAVF PSEAEISHTQ(TRBC1*01和TRBC2*01基因外顯子1的6-25位氨基酸)在其他物種中，TCR鏈可能并不具有與以上基序100％相同的區(qū)域。但是，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將能夠應(yīng)用以上的基序鑒定出TCRα或β鏈的等同部分并因此鑒定出待突變成半胱氨酸的殘基。比對(duì)技術(shù)可用于此方面。例如，可在歐洲生物信息學(xué)學(xué)院網(wǎng)站(http//www.ebi.ac.uk/index.html)獲得的ClustalW可用于將以上的基序與特定TCR鏈序列進(jìn)行比較以定位用于TCR序列突變的相應(yīng)部分。
本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括人的二硫鍵連接的αβTCRs，以及其他哺乳動(dòng)物的二硫鍵連接的αβTCRs，所述其他哺乳動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、豬、山羊和綿羊。如以上所提及，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將能夠確定與以上描述的人的位點(diǎn)相當(dāng)?shù)目蓪?dǎo)入半胱氨酸殘基以形成鏈間二硫鍵的位點(diǎn)。例如，以下顯示了小鼠Cα和Cβ可溶性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，以及顯示了具有與以上提及的人的殘基相當(dāng)?shù)氖髿埢幕?，所述鼠殘基可突變?yōu)榘腚装彼嵋孕纬蒚CR鏈間二硫鍵(其中相關(guān)殘基以陰影顯示)小鼠Cα可溶性結(jié)構(gòu)域PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP小鼠Cβ可溶性結(jié)構(gòu)域EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRAD
人α鏈Thr48的鼠等同物ESGTFITDK VLDMKAMDSK人α鏈Thr45的鼠等同物KTMESGTFI DKTVLDMKAM人α鏈Tyr10的鼠等同物YIQNPEPAV QLKDPRSQDS人α鏈Ser15的鼠等同物AVYQLKDPR QDSTLCLFTD人β鏈Ser57的鼠等同物NGREVHSGV TDPQAYKESN人β鏈Ser77的鼠等同物KESNYSYCL SRLRVSATFW人β鏈Ser17的鼠等同物PPKVSLFEP KAEIANKQKA人β鏈Asp59的鼠等同物REVHSGVST PQAYKESNYS人β鏈Glu15的鼠等同物VTPPKVSLF PSKAEIANKQ在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，TCR的(i)和(ii)的每一鏈包含的第一TCR的功能可變結(jié)構(gòu)域與第二TCR的全部或部分的恒定結(jié)構(gòu)域融合，其中所述第一和第二TCRs來自相同物種且鏈間二硫鍵存在于該相關(guān)的全部或部分恒定結(jié)構(gòu)域的殘基間而不存在于天然TCR中。在一實(shí)施方案中，第一和第二TCRs來自人類。換言之，二硫鍵連接的恒定結(jié)構(gòu)域充當(dāng)可變結(jié)構(gòu)域與之融合的構(gòu)架。產(chǎn)生的TCR與第一TCR來源的天然TCR基本相同。該系統(tǒng)使得任何功能可變結(jié)構(gòu)域可在穩(wěn)定的恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)架上容易地進(jìn)行表達(dá)。
以上描述的A6 Tax sTCR的恒定結(jié)構(gòu)域，或甚至具有以上描述的新鏈間二硫鍵的任何突變?chǔ)力耇CRs的恒定結(jié)構(gòu)域，均可用作異源可變結(jié)構(gòu)域的融合構(gòu)架。如果融合蛋白質(zhì)保留盡可能多的異源可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象為優(yōu)選。因此，優(yōu)選地，異源可變結(jié)構(gòu)域在對(duì)恒定結(jié)構(gòu)域?qū)氲陌腚装彼釟埢秃愣ńY(jié)構(gòu)域N末端間的任何位點(diǎn)與恒定結(jié)構(gòu)域連接。對(duì)于A6 Tax TCR，α和β鏈上導(dǎo)入的半胱氨酸殘基優(yōu)選地分別位于TRAC*01外顯子1的48位蘇氨酸(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為α鏈的158位蘇氨酸)及TRBC1*01和TRBC2*01兩者的外顯子1的57位絲氨酸(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為β鏈的172位絲氨酸)。因此如果異源α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域連接位點(diǎn)分別位于α或β恒定結(jié)構(gòu)域的48位殘基(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為159位)或58位殘基(根據(jù)Garboczi等應(yīng)用的編號(hào)方式為173位)和α和β恒定結(jié)構(gòu)域的N末端之間為優(yōu)選。
可通過序列同源性鑒定出異源α和β鏈的恒定結(jié)構(gòu)域中與A6 Tax TCR中連接位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的殘基。構(gòu)建的融合蛋白質(zhì)優(yōu)選地包括從N末端到連接點(diǎn)的所有異源序列。
如在以下更為詳細(xì)說明的，本發(fā)明的sTCR可在其C或N末端與另外的分子衍生化或融合。優(yōu)選地為C末端，因?yàn)槠湮挥诮Y(jié)合結(jié)構(gòu)域的遠(yuǎn)端。在一實(shí)施方案中，一條或兩條TCR鏈在其C和/或N末端具有可與該另一分子融合的半胱氨酸殘基。
本發(fā)明的可溶性TCR(優(yōu)選地為人)可以相當(dāng)純化的形式提供，或以純化的或分離的制備物提供。例如，可以基本不含其他蛋白質(zhì)的形式提供。
本發(fā)明的多個(gè)可溶性TCRs可以多價(jià)復(fù)合體的形式提供。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面中提供了多價(jià)T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合體，其包含此處描述的多個(gè)可溶性T細(xì)胞受體。優(yōu)選地多個(gè)可溶性TCRs中的每一個(gè)均相同。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測MHC-肽復(fù)合體的方法，該方法包括(i)提供如此處描述的可溶性T細(xì)胞受體或多價(jià)T細(xì)胞受體復(fù)合體；(ii)將可溶性T細(xì)胞受體或多價(jià)TCR復(fù)合體與MHC-肽復(fù)合體接觸；以及(iii)檢測可溶性T細(xì)胞受體或TCR復(fù)合體與MHC-肽復(fù)合體的結(jié)合。
在本發(fā)明的多價(jià)復(fù)合體中，TCRs可為多聚體形式，和/或可呈現(xiàn)在脂雙分子層上或與之相連，所述脂雙分子層如脂質(zhì)體。
在其最簡單的形式中，根據(jù)本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體包含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)與另一分子相連的T細(xì)胞受體分子(例如共價(jià)或其他形式連接)，所述相連優(yōu)選地通過接頭分子實(shí)現(xiàn)。適宜的接頭分子包括但不限于多價(jià)連接分子，例如親和素、鏈親和素、neutravidin和extravidin，其中的每一個(gè)均具有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。這樣，生物素化TCR分子可用于形成具有多個(gè)TCR結(jié)合位點(diǎn)的T細(xì)胞受體多聚體。多聚體中TCR分子的數(shù)目將取決于與用于形成多聚體的連接分子數(shù)量相關(guān)的TCR的數(shù)量，并且也取決于任何其他生物素化分子的存在或缺失。優(yōu)選的多聚體為二聚體、三聚體或四聚體TCR復(fù)合體。
較TCR四聚體大出許多的結(jié)構(gòu)可用于跟蹤或靶向表達(dá)特異MHC-肽復(fù)合體的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)的直徑在10nm到10μm的范圍內(nèi)。每一結(jié)構(gòu)可在足夠遠(yuǎn)的距離間隔呈現(xiàn)多個(gè)TCR分子，其中所述間隔使結(jié)構(gòu)上的兩個(gè)或更多的TCR分子同時(shí)與細(xì)胞上的兩個(gè)或更多的MHC-肽復(fù)合體結(jié)合，并因此提高了多聚體結(jié)合部分與細(xì)胞的親和力。
用于本發(fā)明的適宜結(jié)構(gòu)包括膜結(jié)構(gòu)(例如脂質(zhì)體)和固體結(jié)構(gòu)，所述固體結(jié)構(gòu)優(yōu)選地為顆粒如珠，例如乳膠珠?？稍谕獗戆挥蠺細(xì)胞受體分子的其他結(jié)構(gòu)也是適宜的。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)包被以T細(xì)胞受體多聚體而不是單個(gè)的T細(xì)胞受體分子。
在為脂質(zhì)體的情況下，T細(xì)胞受體分子或其多聚體可吸附到或連接到膜上。用于此的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知。
標(biāo)記或另一分子，例如毒性的或治療性的部分，可包括在本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體中。例如，標(biāo)記或其他部分可包括在混合的分子多聚體內(nèi)。該多聚體分子的實(shí)例為含三個(gè)TCR分子和一個(gè)過氧化物酶分子的四聚體?？赏ㄟ^將TCR和酶以3∶1的摩爾比混合以產(chǎn)生四聚體復(fù)合體，并將所需的復(fù)合體從不含正確比例分子的任何復(fù)合體中分離出來而獲得該四聚體。如果位阻未妨礙或未顯著妨礙分子所需的功能，這些混合分子可含有分子的任何組合。鏈親和素分子上結(jié)合位點(diǎn)的定位適于混合的四聚體，這是由于其不大可能產(chǎn)生位阻。
生物素化TCR的備選方法也是可能的。例如可應(yīng)用化學(xué)生物素化?？蓱?yīng)用備選的生物素化標(biāo)簽，盡管生物素標(biāo)簽序列中的某些氨基酸是必需的(Schatz，(1993).Biotechnology N Y 11(10)1138-43)。用于生物素化混合物也是多樣的。酶需要Mg-ATP和低離子強(qiáng)度，盡管這兩個(gè)條件均可改變，例如應(yīng)用較高的離子強(qiáng)度和較長的反應(yīng)時(shí)間也是可能的。也可應(yīng)用親和素或鏈親和素之外的分子來形成TCR的多聚體。以多價(jià)形式結(jié)合生物素的任何分子均是適宜的。備選地，可設(shè)計(jì)完全不同的連接，例如多聚組氨酸標(biāo)簽與鎳離子螯合的連接(Quiagen產(chǎn)品指南1999(Quiagen Product Guide1999)，第3章，“蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測和試驗(yàn)”(“Protein Expression，Purification，Detection and Assay”)，35-37頁)。優(yōu)選地，標(biāo)簽定位于接近蛋白質(zhì)的C末端以在與肽-MHC復(fù)合體相互作用時(shí)將位阻程度減至最小。
TCR鏈的一條或兩條可用可檢測標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，例如用適于診斷目的的標(biāo)記物標(biāo)記。這樣，本發(fā)明提供了用于檢測MHC-肽復(fù)合體的方法，該方法包括將MHC-肽復(fù)合體與MHC-肽復(fù)合體特異的本發(fā)明TCR或多聚體TCR接觸；以及檢測TCR或多聚體TCR復(fù)合體與MHC-肽復(fù)合體的結(jié)合。在應(yīng)用生物素化異源二聚體形成的四聚體TCR中，可應(yīng)用熒光鏈親和素(可商業(yè)提供)以提供可檢測的標(biāo)記物。熒光標(biāo)記的四聚體適用于FACS分析，例如用來檢測攜帶TCR特異的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
可檢測本發(fā)明可溶性TCRs的另一方法是應(yīng)用TCR特異的抗體，特別是單克隆抗體。有許多商售的抗TCR抗體，例如分別識(shí)別α和β鏈恒定區(qū)的αF1和βF1。
本發(fā)明的TCR(或其多價(jià)復(fù)合體)可備選地或另外地與治療劑或免疫刺激劑連接(例如以共價(jià)或以其他形式連接)，所述治療劑為如用于殺傷細(xì)胞的有毒部分，所述免疫刺激劑如白細(xì)胞介素或細(xì)胞因子。與非多聚體的T細(xì)胞受體異源二聚體相比，本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體也可提高對(duì)pMHC的結(jié)合能力。因此，本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體特別用于示蹤或靶向體外或體內(nèi)呈遞特定抗原的細(xì)胞，且也用作產(chǎn)生具有此功用的進(jìn)一步的多價(jià)TCR復(fù)合體的中間體。因此TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體可以體內(nèi)應(yīng)用的可藥用制劑形式提供。
本發(fā)明也提供了用于將治療劑遞送到靶細(xì)胞的方法，該方法包括將潛在靶細(xì)胞與本發(fā)明的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體在允許TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體與靶細(xì)胞結(jié)合的條件下進(jìn)行接觸，其中所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體為MHC-肽復(fù)合體特異的并具有與其相連的治療劑。
特別是，可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體也可用于將治療劑遞送到呈遞特定抗原的細(xì)胞所在的位置。這可用于多種情形，且特別地用于抗腫瘤?？蛇f送治療劑，這樣使治療劑不僅僅是作用于與其結(jié)合的細(xì)胞而且可在局部發(fā)揮作用。這樣，一個(gè)具體的策略正是設(shè)計(jì)為將抗腫瘤分子與腫瘤抗原特異的T細(xì)胞受體或多價(jià)TCR復(fù)合體連接。
許多治療劑可用于此用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化療劑(例如順鉑)。為確保毒性作用僅在所需的位置發(fā)生，可將毒素包括在與鏈親和素連接的脂質(zhì)體內(nèi)以使化合物緩慢釋放。這樣可防止在體內(nèi)運(yùn)輸過程中的破壞作用并保證TCR與相關(guān)的抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合后毒素具有最大的功效。
其他的治療劑包括●小分子細(xì)胞毒試劑，即具有殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力且分子量小于700道爾頓的化合物。此類化合物也可含有具有細(xì)胞毒作用的有毒金屬。此外，應(yīng)理解這些小分子細(xì)胞毒劑也包括前體藥物，即，在生理?xiàng)l件下分解或轉(zhuǎn)化以釋放細(xì)胞毒劑的化合物。此類細(xì)胞毒劑的示例包括順鉑、美登素衍生物、rachelmycin、卡奇霉素(calicheamicin)、泰索帝(docetaxel)、依托泊苷、吉西他濱(gemcitabine)、異環(huán)磷酰胺、伊立替康(irinotecan)、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、卟吩姆鈉(sorfimer sodium)(光敏素II)、替莫唑胺(temozolmide)、托泊替堪、曲美沙特葡糖醛酸、auristatin E、長春新堿和阿霉素；●肽細(xì)胞毒素，即具有殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的蛋白質(zhì)或其片段。示例包括蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素A、DNAase和RNAase；●放射性核素，即，同時(shí)放射一種或多種α或β粒子或γ射線而衰減的元素的不穩(wěn)定同位素。示例包括碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210和213、錒225和砹213；●前體藥物，例如抗體定向的酶前體藥物；●免疫刺激物，即，刺激免疫反應(yīng)的分子。示例包括細(xì)胞因子如IL-2、趨化因子如IL-8、血小板因子4、黑素瘤生長刺激蛋白等、抗體或其片段、補(bǔ)體活化劑、異基因蛋白結(jié)構(gòu)域、同種異體蛋白結(jié)構(gòu)域、病毒/細(xì)菌蛋白結(jié)構(gòu)域和病毒/細(xì)菌肽。
本發(fā)明的可溶性TCRs或多價(jià)TCR復(fù)合體可與能夠?qū)⑶绑w藥物轉(zhuǎn)化為藥物的酶連接。這樣前體藥物僅在需要其的位點(diǎn)(即由sTCR靶向)轉(zhuǎn)化為藥物。
本發(fā)明TCR的適宜MHC-多肽靶的示例包括但不限于病毒抗原表位，例如HTLV-1表位(例如HLA-A2限制的Tax肽；HTLV-1與白血病有關(guān))、HIV表位、EBV表位、CMV表位；黑素瘤表位(例如MAGE-1 HLA-A1限制性的表位)和其他癌癥特異的表位(例如HLA-A2限制的腎細(xì)胞癌相關(guān)抗原G250)；以及與自身免疫紊亂例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的表位。適用于本發(fā)明的其它疾病相關(guān)的pMHC靶在HLA Factbook(Barclay(編輯)Academic Press)中列出，且其他的許多靶正在進(jìn)行鑒定。
通過可溶性TCRs的特異性將藥物定位可潛在地提高多種疾病的治療效果。
對(duì)于已存在藥物的病毒性疾病，例如HIV、SIV、EBV、CMV，藥物在感染細(xì)胞區(qū)域附近釋放或激活也是有益的。對(duì)于癌癥，定位于腫瘤或轉(zhuǎn)移癌的附近可提高毒素或免疫刺激物的效果。在自身免疫病中，可緩慢釋放免疫抑制藥，使其在更長的時(shí)間范圍內(nèi)產(chǎn)生更多的局部效果而對(duì)受試者的整體免疫能力的影響減至最小。在防止移植排斥中，可以同樣的方式優(yōu)化免疫抑制藥的作用。對(duì)于疫苗遞送，可將疫苗抗原定位在抗原呈遞細(xì)胞附近，由此提高抗原的功效。本方法也可用于成象目的。
本發(fā)明的可溶性TCRs可用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活，前者通過結(jié)合特異的pMHC并由此抑制T細(xì)胞活化。涉及T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和/或組織損傷的自身免疫病可適于此方法，例如I型糖尿病。用于此應(yīng)用時(shí)需要知道由相關(guān)pMHC呈遞的特異肽表位。
根據(jù)本發(fā)明的藥物通常以無菌藥物組合物的部分提供，一般包括可藥用載體。該藥物組合物可為任何的適宜形式，(依賴于給患者施用所需的方法)?？梢詥挝粍┬吞峁?，通常在密封的容器內(nèi)提供且可為藥盒的一部分提供。此類藥盒一般(盡管并非必需)包括使用說明書。藥盒可包括多個(gè)該劑量單位形式。
藥物組合物可適合任何適宜的施用途徑，例如經(jīng)口(包括口腔或舌下)、直腸、鼻腔、局部(包括口腔、舌下或經(jīng)皮)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑。此類組合物可通過制藥領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合而制備。
適于經(jīng)口施用的藥物組合物可以分立的單位劑型提供，例如膠囊劑或片劑；粉劑或顆粒劑；溶液、糖漿或懸液(在含水或不含水溶液中；或可食用泡沫；或乳劑)。片劑或硬明膠膠囊的適宜賦形劑包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。用于軟明膠膠囊的適宜賦形劑包括植物油、蠟、脂肪、半固態(tài)或液態(tài)多元醇等。
制備溶液和糖漿時(shí)，可應(yīng)用的賦形劑包括如水、多元醇和糖。制備懸液時(shí)，可應(yīng)用油(例如植物油)以提供水包油或油包水懸液。適合經(jīng)皮施用的藥物組合物可為分開的貼劑，意在保持與接受者表皮長時(shí)間密切接觸。例如，可通過離子電滲法從貼劑遞送活性成分，基本如在藥物研究(Pharmaceutical Research)，3(6)318(1986)中描述的。適合局部施用的藥物組合物可以制劑為藥膏、霜?jiǎng)乙?、洗液、粉劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油。用于眼或其他外部組織例如口或皮膚的感染時(shí)，組合物優(yōu)選地以藥膏或霜?jiǎng)┬问骄植渴┯?。?dāng)以藥膏形式制劑時(shí)，活性成分可用石蠟或水混溶的藥膏基質(zhì)進(jìn)行施用。備選地，活性成分可用水包油基質(zhì)或油包水基質(zhì)制成霜?jiǎng)?。適合眼局部施用的藥物組合物包括眼藥滴，其中活性成分溶解或懸浮在適宜的載體內(nèi)，特別是在含水溶劑中。適合口的局部施用的藥物組合物包括糖錠、錠劑和洗口液。
適合直腸施用的藥物組合物可以栓劑或灌腸劑形式呈現(xiàn)。載體為固體的適合鼻腔施用的藥物組合物包括例如粒度在20到500μm范圍內(nèi)的粗粉，其施用以吸氣方式進(jìn)行，即通過接近鼻的藥粉容器通過鼻通道快速吸入。載體為液體的例如以鼻噴霧劑或滴鼻劑施用的適宜組合物包括活性成分的水性或油性溶液。適合吸入施用的藥物組合物包括細(xì)粒粉末或霧，所述粉末或霧可通過多種類型的計(jì)量劑量的加壓氣霧器、噴霧器或粉末噴射器產(chǎn)生。適合陰道施用的藥物組合物可以陰道栓劑、棉塞、霜?jiǎng)?、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧劑形式呈現(xiàn)。適合腸胃外施用的藥物組合物包括水性和非水性無菌注射液，所述注射液可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與目的接受患者的血液基本等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸液，其可包括懸浮劑和增稠劑?？捎糜谧⑸湟旱馁x形劑包括，例如水、醇類、多元醇、甘油和植物油。組合物可以單劑量或多劑量的容器呈現(xiàn)，例如密封的安瓿和小瓶，且可以冷凍干燥(凍干)狀況儲(chǔ)存，在使用前僅需要加入無菌液體例如立即加入水用于注射?？捎脽o菌粉末、顆粒和片劑制備臨時(shí)注射液和懸液。
藥物組合物可含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、加濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、增味劑、鹽(本發(fā)明的物質(zhì)自身可以可藥用鹽的形式提供)、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。除了本發(fā)明的物質(zhì)，組合物也可含治療活性劑。
本發(fā)明物質(zhì)的劑量可根據(jù)治療的疾病或紊亂、待治療個(gè)體的年齡和狀況等在很寬的范圍內(nèi)變化，且醫(yī)生將最終決定應(yīng)用的適宜劑量?？筛鶕?jù)需要重復(fù)使用劑量。根據(jù)常規(guī)臨床實(shí)踐，如出現(xiàn)副作用，可減少劑量的數(shù)量和/或頻率。
可應(yīng)用基因克隆技術(shù)提供本發(fā)明的sTCR，所述sTCR優(yōu)選地為相當(dāng)純的形式。已公開了這些技術(shù)，如J.Sambrook等，分子克隆(MolecularCloning)，第二版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)。因此，在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明可溶性TCR鏈的序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子?？赏ㄟ^從T細(xì)胞克隆中分離編碼TCR的核酸并進(jìn)行適宜的突變(通過插入、缺失或替換)獲得該核酸序列。
核酸分子可為分離或重組形式。核酸分子可導(dǎo)入載體且載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞。而該載體和適宜宿主構(gòu)成了本發(fā)明進(jìn)一步的方面。
本發(fā)明也提供了用于獲得TCR鏈的方法，該方法包含將宿主細(xì)胞在導(dǎo)致TCR鏈表達(dá)的條件下孵育以及隨后對(duì)多肽的純化。
可通過在細(xì)菌如大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)以及隨后的體外重折疊來獲得本發(fā)明的可溶性TCRs。
TCR鏈的重折疊可在適宜的重折疊條件下于體外進(jìn)行。在一特定實(shí)施方案中，通過在重折疊緩沖液中重折疊溶解的TCR鏈獲得具有正確構(gòu)象的TCR，所述緩沖液包含溶解劑如尿素。有利地是，尿素的濃度可為至少0.1M、至少1M、至少2.5M或約5M?？蓱?yīng)用的備選溶解劑為胍，其濃度在0.1M和8M之間，優(yōu)選地為至少1M或至少2.5M。在重折疊前優(yōu)選地應(yīng)用還原劑以保證半胱氨酸殘基徹底還原。如需要可應(yīng)用進(jìn)一步的變性劑如DTT和胍。重折疊步驟前可應(yīng)用不同的變性和還原試劑(例如尿素、β-巰基乙醇)。在重折疊過程中可應(yīng)用備選的氧化還原偶，例如胱胺/半胱胺氧化還原偶、DTT或β-巰基乙醇/大氣氧以及以還原和氧化形式的半胱氨酸。
通過將某些其它蛋白質(zhì)成分(例如伴侶蛋白)加入到重折疊混合物中也可提高折疊效率。將蛋白質(zhì)通過固定有小伴侶分子的柱可獲得折疊效率的提高(Altamirano等(1999)自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)17187-191；Altamirano等(1997)美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)94(8)3576-8)。
備選地，可通過在真核細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)以獲得本發(fā)明的可溶性TCR，所述細(xì)胞如昆蟲細(xì)胞。
可通過多種不同的方法對(duì)TCR進(jìn)行純化?？蓱?yīng)用離子交換的備選模式，或可應(yīng)用蛋白質(zhì)純化的其他模式，例如凝膠過濾層析或親和層析。
本發(fā)明的可溶性TCRs和多價(jià)TCR復(fù)合體也可用于篩選具有抑制TCR與其pMHC復(fù)合體結(jié)合的能力的試劑，例如小化學(xué)化合物。這樣，在一進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了用于篩選抑制T細(xì)胞受體與肽-MHC復(fù)合體結(jié)合的試劑的方法，其包括監(jiān)測在試劑存在條件下本發(fā)明可溶性T細(xì)胞受體與肽-MHC復(fù)合體的結(jié)合，以及選擇抑制該結(jié)合的試劑。
用于此篩選方法的適宜技術(shù)包括在WO 01/22084中描述的基于表面胞質(zhì)共振的方法?？蓸?gòu)成該篩選方法基礎(chǔ)的其他公知技術(shù)為閃爍鄰近分析(SPA)和擴(kuò)大發(fā)光鄰近試驗(yàn)(Amplified Luminescent Proximity Assay)。
通過本發(fā)明篩選方法選擇的試劑可用作藥物，或可用作藥物開發(fā)計(jì)劃的基礎(chǔ)，通過修飾或其他改進(jìn)以使其獲得更適于作為藥物施用的特征。該藥物可用于治療這樣的疾病，所述疾病包括不需要的T細(xì)胞反應(yīng)組份。所述疾病包括癌癥(例如腎癌、卵巢癌、頭和頸癌、睪丸癌、肺癌、胃癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌或黑素瘤)、自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主病。
本發(fā)明每一方面的優(yōu)選特征也用于已作必要修正的每一其他方面。此處提及的現(xiàn)有的本領(lǐng)域內(nèi)文獻(xiàn)通過法律允許全文于此引用。
實(shí)施例本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
以下為參照附圖的說明，其中圖1為本發(fā)明的具有導(dǎo)入的鏈間二硫鍵的可溶性TCR的示意性圖表；圖2a和2b分別顯示可溶性A6 TCR的α和β鏈的核酸序列，所述序列經(jīng)過突變以導(dǎo)入半胱氨酸密碼子。陰影處表示導(dǎo)入的半胱氨酸密碼子；圖3a顯示A6 TCRα鏈的胞外氨基酸序列，其包括用以產(chǎn)生新鏈間二硫鍵的T48→C突變(下劃線處)，且圖3b顯示A6 TCRβ鏈的胞外氨基酸序列，其包括用以產(chǎn)生新鏈間二硫鍵的S57→C突變(下劃線處)；圖4為可溶性A6 TCR陰離子交換層析后獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖5-A.在圖4中所過柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。B.在圖4中所過柱的級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。峰1主要包含非二硫鍵連接的β-鏈，峰2包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體，且肩峰的出現(xiàn)是由于與鏈間二硫鍵連接的sTCR混合的大腸桿菌污染物，該污染物在此操作中幾乎不可見；圖6為圖5中峰1收集的合并級(jí)分進(jìn)行的大小排阻層析獲得的曲線圖。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)；
圖7為二硫鍵連接的A6可溶性TCR與HLA-A2-tax復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線。插入圖顯示與單獨(dú)注射二硫鍵連接的A6可溶性TCR的對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)合反應(yīng)；圖8a顯示包含新半胱氨酸殘基的A6 TCRα鏈序列，對(duì)其進(jìn)行突變以導(dǎo)入一BamH1限制性位點(diǎn)。陰影指出形成BamH1限制性位點(diǎn)所導(dǎo)入的突變。圖8b和8c顯示突變的JM22 TCR的α和β鏈的DNA序列，所述序列經(jīng)過突變以包括額外的半胱氨酸殘基用以形成非天然二硫鍵；圖9a和9b分別顯示由圖8a和8b的DNA序列產(chǎn)生的JM22 TCRα和β鏈的胞外氨基酸序列；圖10為可溶性二硫鍵連接的JM22 TCR經(jīng)陰離子交換層析后獲得的曲線圖，顯示應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖11a顯示在圖10中所過柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示，且圖11b顯示在圖10中所過柱的級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。峰1明確地包含經(jīng)鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體。
圖12為圖10中峰1收集的合并級(jí)分的大小排阻層析獲得的曲線圖。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)。產(chǎn)率為80％；圖13-A.二硫鍵連接的JM22可溶性TCR與HLA-Flu復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線。B，與單獨(dú)注射二硫鍵連接的JM22可溶性TCR的對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)合反應(yīng)；圖14a和14b顯示經(jīng)突變的NY-ESO TCRα和β鏈的DNA序列，序列經(jīng)過突變以包含額外的半胱氨酸殘基用以形成非天然二硫鍵；圖15a和15b分別顯示由圖14a和14b的DNA序列產(chǎn)生的NY-ESOTCR的α和β鏈胞外氨基酸序列；圖16為二硫鍵連接的可溶性NY-ESO TCR經(jīng)陰離子交換層析后獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖17-A.顯示在圖16中所過柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。B顯示在圖16中所過柱的級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。峰1和峰2明確地包含經(jīng)鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體；圖18.為圖17中峰1和峰2收集的合并級(jí)分的大小排阻層析獲得的曲線圖。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)；圖19顯示二硫鍵連接的可溶性NY-ESO TCR與HLA-NYESO復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線。A.峰1，B.峰2；圖20a和20b分別顯示突變的可溶性NY-ESO TCR的α和β鏈的DNA序列，序列經(jīng)過突變以導(dǎo)入新的半胱氨酸密碼子(以陰影顯示)。序列包括參與天然鏈間二硫鍵形成的半胱氨酸(密碼子以黑體顯示)；圖21a和21b分別顯示由圖20a和21b的DNA序列產(chǎn)生的NY-ESOTCRα和β鏈的胞外氨基酸序列；圖22顯示可溶性NY-ESO TCRαcysβcys經(jīng)陰離子交換層析獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖23顯示可溶性NY-ESO TCRαcys經(jīng)陰離子交換層析獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖24顯示可溶性NY-ESO TCRβcys經(jīng)陰離子交換層析獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖25分別顯示在圖22-24中經(jīng)過陰離子交換柱的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)。1泳道和7泳道為MW標(biāo)記物，2泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ峰(EB/084/033)；3泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ小峰(EB/084/033)，4泳道為NYESOdsTCR1g4αβ-cys(EB/084/034)，5泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys小峰(EB/084/035)，且6泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys峰(EB/084/035)；
圖26分別顯示在圖22-24中經(jīng)過陰離子交換柱的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)。1泳道和7泳道為MW標(biāo)記物，2泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ峰(EB/084/033)；3泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ小峰(EB/084/033)，4泳道為NYESOdsTCR1g4αβ-cys(EB/084/034)，5泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys小峰(EB/084/035)，且6泳道為NYESOdsTCR1g4α-cysβ-cys峰(EB/084/035)；圖27為可溶性NY-ESO TCRαcysβcys經(jīng)大小排阻交換層析獲得的曲線圖，顯示了圖22收集的合并級(jí)分的蛋白質(zhì)洗脫。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)；圖28為可溶性NY-ESO TCRαcys經(jīng)大小排阻交換層析獲得的曲線圖，顯示了圖22收集的合并級(jí)分的蛋白質(zhì)洗脫。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)；圖29為可溶性NY-ESO TCRβcys經(jīng)大小排阻交換層析獲得的曲線圖，顯示了圖22收集的合并級(jí)分的蛋白質(zhì)洗脫。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)；圖30為NY-ESO TCRαcysβcys與HLA-NY-ESO復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線；圖31為NY-ESO TCRαcys與HLA-NY-ESO復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線；圖32為NY-ESO TCRβcys與HLA-NY-ESO復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線；圖33a和33b分別顯示突變的可溶性AH-1.23 TCR的α和β鏈的DNA序列，所述序列經(jīng)過突變以導(dǎo)入新的半胱氨酸密碼子(以陰影顯示)。序列包括參與形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸(密碼子以黑體顯示)；圖34a和34b分別顯示由圖33a和33b的DNA序列產(chǎn)生的AH-1.23TCRα和β鏈的胞外氨基酸序列；圖35為可溶性AH-1.23 TCR經(jīng)陰離子交換層析獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖36為在圖35中過柱的AH-1.23 TCR級(jí)分的還原SDS-PAGE(10％Bis-Tris膠，考馬斯染色)。所測試的蛋白質(zhì)為來自重折疊3的TCR 1.23S-S陰離子交換級(jí)分。1泳道為MW標(biāo)記物，2泳道為B4，3泳道為C2，4泳道為C3，5泳道為C4，6泳道為C5，7泳道為C6，8泳道為C7，9泳道為C8且10泳道為C9；圖37為在圖35中過柱的AH-1.23 TCR級(jí)分的非還原SDS-PAGE(10％Bis-Tris膠，考馬斯染色)。所測試的蛋白質(zhì)為來自重折疊3的TCR 1.23S-S的陰離子交換級(jí)分。1泳道為MW標(biāo)志物，2泳道為B4，3泳道為C2，4泳道為C3，5泳道為C4，6泳道為C5，7泳道為C6，8泳道為C7，9泳道為C8且10泳道為C9；圖38為可溶性AH-1.23 TCR的大小排阻交換層析獲得的曲線圖，顯示了來自圖35收集的合并級(jí)分的蛋白質(zhì)洗脫。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)；圖39a和39b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的48位殘基處導(dǎo)入新的半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖40a和40b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的45位殘基處導(dǎo)入新的半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖41a和41b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的61位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖42a和42b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的50位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖43a和43b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的10位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖44a和44b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的15位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖45a和45b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的12位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖46a和46b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的22位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖47a和47b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的52位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖48a和48b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的43位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖49a和49b分別顯示突變的可溶性A6 TCRα鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRAC*01外顯子1的57位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖50a和50b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的77位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖51a和51b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的17位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖52a和52b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的13位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖53a和53b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的59位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖54a和54b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的79位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖55a和55b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的14位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖56a和56b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的55位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖57a和57b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的63位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖58a和58b分別顯示突變的可溶性A6 TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列，所述序列經(jīng)過突變以在TRBC2*01外顯子1的15位殘基處導(dǎo)入新半胱氨酸。陰影處的核苷酸表示導(dǎo)入的新半胱氨酸密碼子且下劃線處的氨基酸表示導(dǎo)入的半胱氨酸；圖59-64為可溶性A6 TCR經(jīng)陰離子交換層析獲得的曲線圖，顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫，其中所述可溶性A6 TCR在以下殘基間含有新鏈間二硫鍵分別為，TRAC*01外顯子1的48位殘基和TRBC2*01外顯子1的57位殘基；TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的77位殘基；TRAC*01外顯子1的10位殘基和TRBC2*01外顯子1的17位殘基；TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的59位殘基；TRAC*01外顯子1的52位殘基和TRBC2*01外顯子1的55位殘基；TRAC*01外顯子1的15位殘基和TRBC2*01外顯子1的15位殘基；圖65a和65b分別為可溶性A6 TCR的還原和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的48位殘基和TRBC2*01外顯子1的57位殘基間包含新鏈間二硫鍵，電泳的級(jí)分收集自圖59中所過的陰離子交換柱；圖66a和66b分別為可溶性A6 TCR的還原和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的77位殘基間包含新鏈間二硫鍵，電泳的級(jí)分收集自圖60中所過的陰離子交換柱；
圖67a和67b分別為可溶性A6 TCR的還原和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的10位殘基和TRBC2*01外顯子1的17位殘基間包含新鏈間二硫鍵，電泳的級(jí)分收集自圖61中所過的陰離子交換柱；圖68a和68b分別為可溶性A6 TCR的還原和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的59位殘基間包含新鏈間二硫鍵，電泳的級(jí)分收集自圖62中所過的陰離子交換柱；圖69a和69b分別為可溶性A6 TCR的還原和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的52位殘基和TRBC2*01外顯子1的55位殘基間包含新鏈間二硫鍵，電泳的級(jí)分收集自圖63中所過的陰離子交換柱；圖70a和70b分別為可溶性A6 TCR的還原和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的15位殘基和TRBC2*01外顯子1的15位殘基間包含新鏈間二硫鍵，電泳的級(jí)分收集自圖64中所過的陰離子交換柱；圖71為可溶性A6 TCR經(jīng)大小排阻層析獲得的曲線圖，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的48位殘基和TRBC2*01外顯子1的57位殘基間含有新鏈間二硫鍵，該曲線圖顯示來自Superdex 200 HL凝膠過濾柱的蛋白質(zhì)洗脫。運(yùn)行的級(jí)分收集自圖59中所過的陰離子交換柱；圖72為可溶性A6 TCR經(jīng)大小排阻層析獲得的曲線圖，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的77位殘基間含有新鏈間二硫鍵，該曲線圖顯示來自Superdex 200 HL凝膠過濾柱的蛋白質(zhì)洗脫。運(yùn)行的級(jí)分收集自圖60中所過的陰離子交換柱子；圖73為可溶性A6 TCR經(jīng)大小排阻層析獲得的曲線圖，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的10位殘基和TRBC2*01外顯子1的17位殘基間含有新鏈間二硫鍵，該曲線圖顯示來自Superdex 200 HL凝膠過濾柱的蛋白質(zhì)洗脫。運(yùn)行的級(jí)分收集自圖61中所過的陰離子交換柱子；
圖74為可溶性A6 TCR經(jīng)大小排阻層析獲得的曲線圖，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的59位殘基間含有新鏈間二硫鍵，該曲線圖顯示來自Superdex 200 HL凝膠過濾柱蛋白質(zhì)洗脫。運(yùn)行的級(jí)分收集自圖62中所過的陰離子交換柱子；圖75為可溶性A6 TCR經(jīng)大小排阻層析獲得的曲線圖，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的52位殘基和TRBC2*01外顯子1的55位殘基間含有新鏈間二硫鍵，該曲線圖顯示來自Superdex 200 HL凝膠過濾柱的蛋白質(zhì)洗脫。運(yùn)行的級(jí)分收集自圖63中所過的陰離子交換柱子；圖76為可溶性A6 TCR經(jīng)大小排阻層析獲得的曲線圖，所述A6 TCR在TRAC*01外顯子1的15位殘基和TRBC2*01外顯子1的15位殘基間含有新鏈間二硫鍵，該曲線圖顯示來自Superdex 200 HL凝膠過濾柱的蛋白質(zhì)洗脫。運(yùn)行的級(jí)分收集自圖64中所過的陰離子交換柱子；以及圖77-80分別為顯示在以下殘基間含鏈間二硫鍵的可溶性A6 TCR與HLA-A2-tax pMHC結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線TRAC*01外顯子1的48位殘基和TRBC2*01外顯子1的57位殘基；TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的77位殘基；TRAC*01外顯子1的10位殘基和TRBC2*01外顯子1的17位殘基；和TRAC*01外顯子1的45位殘基和TRBC2*01外顯子1的59位殘基。
圖81為顯示在TRAC*01外顯子1的52位殘基和TRBC2*01外顯子1的55位殘基間含有新鏈間二硫鍵的可溶性A6 TCR與HLA-A2-tax和與HLA-A2-NY-ESO pMHC非特異結(jié)合的BIAcore曲線圖；圖82為顯示在TRAC*01外顯子1的15位殘基和TRBC2*01外顯子1的15位殘基間含有新鏈間二硫鍵的可溶性A6 TCR與HLA-A2-taxpMHC結(jié)合的BIAcore曲線圖；圖83a為具有1BD2序列(鏈A Thr164，鏈B Ser174)的模型周圍的電子密度圖。圖的形貌在1.0，2.0和3.0σ處繪出。圖83b為在A164和B174兩個(gè)位置處用Cys改進(jìn)后的電子密度圖。圖的形貌用與圖83a相同的σ水平繪出；
圖84將本發(fā)明NY-ESO TCR的結(jié)構(gòu)與1BD2 TCR的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，所述比較通過重疊以條帶和線圈表示的所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行；圖85a和85b分別顯示摻入生物素識(shí)別位點(diǎn)的NY-ESO TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列。突出顯示的為生物素識(shí)別位點(diǎn)；圖86a和86b分別顯示摻入六聚組氨酸標(biāo)簽的NY-ESO TCRβ鏈的DNA和氨基酸序列。突出顯示的為六聚組氨酸標(biāo)簽；圖87圖示了含新二硫鍵和生物素識(shí)別序列的可溶性NY-ESO TCR經(jīng)POROS 50HQ陰離子交換柱的洗脫，所述洗脫應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度進(jìn)行；圖88圖示了含新二硫鍵和六聚組氨酸標(biāo)簽的可溶性NY-ESO TCR經(jīng)POROS 50HQ陰離子交換柱的洗脫，所述洗脫應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度進(jìn)行；圖89為由圖87所示的經(jīng)NY-ESO-生物素化陰離子交換柱而收集到的合并級(jí)分進(jìn)行凝膠過濾層析的蛋白質(zhì)洗脫圖；圖90為由圖88所示的經(jīng)NY-ESO-六聚組氨酸標(biāo)記的陰離子交換柱而收集到的合并級(jí)分進(jìn)行凝膠過濾層析的蛋白質(zhì)洗脫圖；圖91a-h為FACS條帶圖，表明的是由分別用以下濃度的NY-ESO肽和熒光NY-ESO TCR四聚體孵育HLA-A2陽性的經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(PP LCL)，來自25,000個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的染色強(qiáng)度NYESO 0 TCR 5μg、NYESO 10-4M TCR 5μg、NYESO 10-5M TCR 5μg、NYESO 10-6M TCR5μg、NYESO 0 TCR 10μg、NYESO 10-4M TCR 10μg、NYESO 10-5M TCR10μg、NYESO 10-6M TCR 10μg；圖92為摻入TRBC1*01恒定區(qū)的A6 TCRβ-鏈的DNA序列；圖93為摻入TRBC1*01恒定區(qū)的可溶性A6 TCR進(jìn)行陰離子交換層析的曲線圖，其顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；
圖94-A.來自圖93中所過柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。B.來自圖93中所過柱的級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示；圖95來自圖93中峰2的合并級(jí)分的大小排阻層析。峰1包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體；圖96-A.二硫鍵連接的A6可溶性TCR與HLA-Flu復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore分析。B.與單獨(dú)注射二硫鍵連接的A6可溶性TCR的對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)合反應(yīng)；圖97顯示摻入“自由”半胱氨酸的A6 TCR的突變?chǔ)骆湹暮怂嵝蛄?；圖98-摻入“自由”半胱氨酸的可溶性A6 TCR的陰離子交換層析。它顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖99-A.來自圖98中所過柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。B.來自圖98中所過柱子的級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示；圖100-來自圖98中峰2的合并級(jí)分的大小排阻層析。峰1包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體；圖101-A.為摻入“自由”半胱氨酸的二硫鍵連接的A6可溶性TCR與HLA-Flu復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore分析。B.與單獨(dú)注射二硫鍵連接的A6可溶性TCR的對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)合反應(yīng)；圖102顯示摻入絲氨酸殘基從而突變替換了“自由”半胱氨酸的A6TCR的突變?chǔ)骆湹暮怂嵝蛄?；圖103-摻入絲氨酸殘基從而突變替換了“自由”半胱氨酸的可溶性A6 TCR的陰離子交換層析，其顯示了應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS 50HQ柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫；圖104-A.來自圖103中所過柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示。B.來自圖103中所過柱的級(jí)分的非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)，如所示；峰2明確包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體；
圖105-來自圖103中峰2的合并級(jí)分的大小排阻層析。峰1包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體；圖106-A.為摻入絲氨酸殘基用以突變?yōu)椤白杂伞卑腚装彼岬亩蜴I連接的A6可溶性TCR與HLA-Flu復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore分析。B.與單獨(dú)注射二硫鍵連接的A6可溶性TCR的對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)合反應(yīng)；圖107顯示pYX112的核酸序列；圖108顯示pYX122的核酸序列；圖109顯示前原交配因子(pre-pro mating factor)α與TCRα鏈融合的DNA和蛋白質(zhì)序列；圖110顯示前原交配因子α與TCRβ鏈融合的DNA和蛋白質(zhì)序列；圖111顯示在釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株SEY6210中表達(dá)的可溶性TCR的Western印跡。C泳道含60ng的純化可溶性NY-ESO TCR作為對(duì)照。1泳道和2泳道含分別從兩個(gè)獨(dú)自經(jīng)TCR轉(zhuǎn)化的酵母培養(yǎng)物收獲的蛋白質(zhì)；圖112顯示pEX172質(zhì)粒的KpnI到EcoRI插入片段的核酸序列。質(zhì)粒的其余部分為pBlueScript II KS-；圖113為用于克隆入桿狀病毒的TCR鏈的示意性圖解；圖114顯示用以形成鏈間二硫鍵的A6 α TCR構(gòu)建體的核酸序列，BamHI插入到pAcAB3表達(dá)載體中；圖115顯示用以形成鏈間二硫鍵的A6 β TCR構(gòu)建體的核酸序列，BamHI插入到pAcAB3表達(dá)載體中；以及圖116顯示細(xì)菌產(chǎn)生的含鏈間二硫鍵的A6 TCR和昆蟲產(chǎn)生的含鏈間二硫鍵的A6 TCR的考馬斯染色凝膠和Western印跡。
在以下的所有實(shí)施例中，除非另外說明，產(chǎn)生的可溶性TCR鏈在緊鄰形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基的C末端進(jìn)行截?cái)唷?br> 實(shí)施例1-A6 Tax TCRα和β鏈的引物和突變?cè)O(shè)計(jì)將A6 Tax TRAC*01外顯子1的48位蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼釙r(shí)，設(shè)計(jì)以下的引物(突變以小寫字母顯示)5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G將A6 Tax TRBC1*01和TRBC2*01兩者的外顯子1的57位絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼釙r(shí)，設(shè)計(jì)以下的引物(突變以小寫字母顯示)5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT GPCR誘突含A6 Tax TCRα或β鏈基因的表達(dá)質(zhì)粒的突變分別應(yīng)用α-鏈引物或β-鏈引物進(jìn)行如下突變。將100ng的質(zhì)粒與5μl的10mM dNTP、25μl的10xPfu-緩沖液(Stratagene)、10單位的Pfu聚合酶(Stratagene)，且用H2O將終體積調(diào)整為240μl。將引物補(bǔ)充到48μl的該混合物中，以稀釋引物使其在50μl的終反應(yīng)體積中的終濃度為0.2μM。95℃30秒的初始變性后，反應(yīng)混合物在Hybaid PCR express PCR儀中進(jìn)行15輪的變性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分鐘)。然后用10單位的DpnI限制性酶(New England Biolabs)37℃消化產(chǎn)物5小時(shí)。將10μl的消化反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌中并在37℃生長18小時(shí)。挑取單菌落并在5mlTYP+氨芐青霉素(16g/l細(xì)菌用胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/l K2HPO4、100mg/l氨芐青霉素)中過夜培養(yǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書應(yīng)用Qiagen mini-prep柱純化質(zhì)粒DNA且應(yīng)用牛津大學(xué)生化室的測序設(shè)備進(jìn)行自動(dòng)序列測定以證實(shí)序列。相應(yīng)的突變核酸和氨基酸序列在圖中顯示，圖2a和3a為用于α鏈且圖2b和3b用于β鏈。
實(shí)施例2-可溶性TCR的表達(dá)、重折疊和純化將分別含突變的α-鏈和β-鏈的表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21pLysS中，且將抗氨芐青霉素的單菌落在TYP(氨芐青霉素100μg/ml)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)直到OD600為0.4，之后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)3小時(shí)后在Beckman J-6B中4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸在含50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、10mM DTT，pH8.0的緩沖液中。過夜凍融步驟后，在Milsonix XL2020超聲儀中用標(biāo)準(zhǔn)的12mm直徑探針以1分鐘脈沖超聲降解重懸細(xì)胞總共約10分鐘。在Beckman J2-21離心機(jī)中13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘回收包涵體沉淀。然后進(jìn)行三次去污劑清洗以移除細(xì)胞殘?jiān)湍こ煞?。每次用Beckman J2-21以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀15分鐘之前將包涵體沉淀在Triton緩沖液(50mM Tris-HCI、0.5％Triton-X100、200mMNaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH8.0)中進(jìn)行均質(zhì)化。然后在以下的緩沖液中通過類似的洗滌以移除去污劑和鹽50mMTris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH8.0。最后，將包涵體分裝成30mg小份并凍存于-70℃。用6M鹽酸胍溶解并用Bradford染料結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)定量包涵體蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
從冷凍庫存中取出約30mg(即1微摩爾)的每一溶解的包涵體鏈進(jìn)行解凍，然后混合樣本并將混合物稀釋到15ml的胍溶液(6M鹽酸胍、10mM乙酸鈉、10mM EDTA)中，以保證鏈充分變性。然后將含充分還原和變性的TCR鏈的胍溶液注入到1升的以下重折疊緩沖液中100mM Tris pH8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。放置溶液24小時(shí)。然后對(duì)重折疊液透析兩次，首先用10升的100mM尿素，然后用10升的100mM尿素、10mMTris pH8.0。重折疊和透析步驟均在6-8℃進(jìn)行。
將透析的重折疊液上樣至Akta凈化器(Pharmacia)的POROS 50HQ陰離子交換柱并以0-500mM NaCl梯度用50倍柱體積洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，以從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離出sTCR，如圖4所示。將峰級(jí)分存儲(chǔ)在4℃并在合并和濃縮前進(jìn)行考馬斯染色的SDS-PAGE(圖5)分析。最后，應(yīng)用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％NP40)預(yù)平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱(圖6)純化并表征sTCR。合并并濃縮位于相對(duì)分子量約50kDa的洗脫峰，之后通過BIAcore表面胞質(zhì)共振分析進(jìn)行表征。
實(shí)施例3-通過BIAcore表面胞質(zhì)共振說明sTCR與特異pMHC的結(jié)合應(yīng)用表面胞質(zhì)共振生物傳感器(BIAcore 3000TM)分析sTCR與其肽-MHC配體的結(jié)合。產(chǎn)生單pMHC復(fù)合體(以下描述)有利于分析，將pMHC復(fù)合體以半定向方式固定在鏈親和素包被的結(jié)合表面，使得可同時(shí)有效檢測可溶性T細(xì)胞受體與達(dá)四種的不同pMHC(固定在分別的流槽上)的結(jié)合。人工注射HLA復(fù)合體可容易地控制固定的I類分子的精確水平。
該固定的復(fù)合體能夠結(jié)合T細(xì)胞受體和共受體CD8αα，二者均可以注射入溶解相。甚至在低濃度(至少40μg/ml)時(shí)也可獲得TCR的特異結(jié)合，表明TCR是相對(duì)穩(wěn)定的。應(yīng)用在溶解相或固定相的sTCR定性和定量觀察到的sTCR的pMHC結(jié)合特征均類似。這是對(duì)可溶性TCR種類部分活性的重要對(duì)照，并提示生物素化pMHC復(fù)合體與非生物素化復(fù)合體具有一樣的生物活性。
從細(xì)菌表達(dá)的含構(gòu)成性亞單位蛋白和合成肽的包涵體中體外重折疊生物素化I類HLA-A2-肽復(fù)合體，隨后進(jìn)行純化和體外酶性生物素化(O’Callaghan等.(1999)生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)2669-15)。表達(dá)的HLA-重鏈具有一C末端生物素化標(biāo)簽，所述標(biāo)簽替換了適宜構(gòu)建體中蛋白質(zhì)的跨膜和胞漿結(jié)構(gòu)域。獲得了包涵體表達(dá)水平為～75mg/升的細(xì)菌培養(yǎng)物。也從適宜的構(gòu)建物在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)HLA輕-鏈或β2-小球蛋白，表達(dá)水平為～500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物。
裂解大腸桿菌細(xì)胞并純化包涵體使其約為80％純度。包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)在6M鹽酸胍、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mMEDTA中變性，并以濃度為30mg/升重鏈、30mg/升β2m加到0.4ML-精氨酸-HCl、100mM Tris pH8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml肽(例如tax 11-19)中進(jìn)行重折疊，在＜5℃條件下以單劑量一次性將變性蛋白質(zhì)加入到重折疊緩沖液中。在4℃至少進(jìn)行1小時(shí)以完全重折疊。
在10倍體積的10mM Tris pH8.1進(jìn)行透析以交換緩沖液。兩次緩沖液交換對(duì)于有效減少溶液的離子強(qiáng)度是必須的。然后蛋白質(zhì)溶液過濾通過1.5μm的乙酸纖維素濾器并加樣到POROS 50HQ陰離子交換柱(8ml柱床體積)。用線性0-500mM NaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。HLA-A2-肽復(fù)合體在約250mM NaCl處進(jìn)行洗脫，并收集峰級(jí)分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)并將級(jí)分置冰上冷卻。
生物素化HLA復(fù)合體的緩沖液交換為10mM Tris pH8.1、5mMNaCl，所述交換應(yīng)用在同一緩沖液中平衡的Pharmacia快速去鹽柱。洗脫后立即將含蛋白質(zhì)的級(jí)分置冰上冷卻并加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化試劑1mM生物素、5mM ATP(緩沖為pH8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(根據(jù)O’Callaghan等.(1999)生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)2669-15進(jìn)行純化)。然后室溫過夜孵育混合物。
應(yīng)用凝膠過濾層析純化生物素化HLA復(fù)合體。用濾過的PBS預(yù)平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱并加入1ml生物素化反應(yīng)混合物，并用PBS以0.5ml/分鐘洗柱子。生物素化HLA復(fù)合體以單一峰洗脫，體積約為15ml。合并含蛋白質(zhì)的級(jí)分、置冰上冷卻并加入混合的蛋白酶抑制劑。應(yīng)用考馬斯-結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)測定蛋白質(zhì)濃度并將分裝的生物素化HLA復(fù)合體儲(chǔ)存于-20℃。通過標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)法固定鏈親和素。
在BIAcore 3000TM表面胞質(zhì)共振(SPR)生物傳感器上分析含新鏈間鍵的A6 Tax sTCR與其配體/MHC復(fù)合體或不相關(guān)HLA-肽組合物間的相互作用，其產(chǎn)生如上描述。SPR測定在小流槽內(nèi)的傳感器表面附近以反應(yīng)單位(RU)表述的折射率的變化，這一原理可用于檢測受體配體的相互作用以及用于分析其親和性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過將單獨(dú)的HLA-肽復(fù)合體固定于分離的流槽中制備檢測用流槽，所述固定通過交聯(lián)到β2m上的生物素和鏈親和素間的結(jié)合實(shí)現(xiàn)，而前述的抗生物素鏈菌素已化學(xué)交聯(lián)到流槽的激活表面。然后通過將sTCR以恒定速度通過不同流槽的表面進(jìn)行試驗(yàn)，以此測定SPR反應(yīng)。起初，以5μl每分鐘的固定流速將sTCR通過兩種不同的表面證實(shí)相互作用的特異性；所述表面其一包被以～5000 RU的特異肽-HLA復(fù)合體，另一個(gè)包被～5000 RU的非特異肽-HLA復(fù)合體(圖7中的插入圖)。以不同流速和不同濃度將可溶性sTCR注入肽-HLA復(fù)合體上用來定義背景共振。這些對(duì)照測量的數(shù)值從用特異肽-HLA復(fù)合體獲得的數(shù)值中減去并用以計(jì)算結(jié)合親和力，所述結(jié)合親和力以解離常數(shù)Kd表述(Price& Dwek，用于生物化學(xué)家的物理化學(xué)中的原則和問題(Principles andProblems in Physical Chemistry for Biochemist)(第二版)1979，ClarendonPress，Oxford)，如圖7所示。
獲得的Kd值(1.8μM)與報(bào)道的用于無新二硫鍵的A6 Tax sTCR與pMHC間的相互作用接近(0.91μM-Ding等，1999，免疫學(xué)(Inmmunity)1145-56)。
實(shí)施例4-含新二硫鍵的可溶性JM22 TCR的產(chǎn)生在實(shí)施例1中制備的可溶性A6 TCR的β鏈在其天然序列中包含適用于用作連接位點(diǎn)的BglII限制性位點(diǎn)(AAGCTT)。
進(jìn)行如以下詳細(xì)描述的PCR誘變以將BamH1限制性位點(diǎn)(GGATCC)導(dǎo)入可溶性A6 TCR的α鏈，位點(diǎn)位于新半胱氨酸密碼子的5’端。在圖2a中描述的序列用作該誘變的模板。應(yīng)用以下的引物|BamHI|5′-ATATCCAGAACCCgGAtCCTGCCGTGTA-3′5′-TACACGGCAGGAaTCcGGGTTCTGGATAT-3′100ng的質(zhì)粒與5μl的10mM dNTP、25μl的10xPfu-緩沖液(Stratagene)、10單位的Pfu聚合酶(Stratagene)混合，并用H2O將終體積調(diào)整至240μl。將引物補(bǔ)充到48μl的該混合物中，以稀釋引物使其在50μl的終反應(yīng)體積中的終濃度為0.2μM。95℃30秒的初始變性后，反應(yīng)混合物在Hybaid PCR express PCR儀中進(jìn)行15輪的變性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分鐘)。然后用10單位的DpnI限制性酶(NewEngland Biolabs)37℃消化產(chǎn)物5小時(shí)。將10μl的消化反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌中并在37℃生長18小時(shí)。挑取單菌落并在5ml TYP+氨芐青霉素(16g/l細(xì)菌用胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/l NaCl、2.5g/lK2HPO4、100mg/l氨芐青霉素)中過夜培養(yǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書應(yīng)用Qiagen mini-prep柱子純化質(zhì)粒DNA且應(yīng)用牛津大學(xué)生化室的測序設(shè)備進(jìn)行自動(dòng)序列測定以證實(shí)序列。導(dǎo)入到α鏈的突變?yōu)椤俺聊蓖蛔?，因此該鏈的氨基酸序列保持不變，與在圖3a中描述的一致。突變?chǔ)伶湹腄NA序列在圖8a中顯示。
為產(chǎn)生摻入新二硫鍵的可溶性JM22 TCR，含α鏈BamHI和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的A6 TCR質(zhì)粒用作模板。應(yīng)用以下的引物|NdeI|5′-GGAGATATACATATGCAACTACTAGAACAA-3′5′-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3′|BamHI||NdeI|5′-GGAGATATACATATGGTGGATGGTGGAATC-3′5′-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3′|BglII|通過以下的PCR克隆獲得JM22 TCRα和β-鏈構(gòu)建體。
應(yīng)用如上所示的引物和含JM22 TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性酶消化并克隆到pGMT7中以獲得表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒的插入序列通過自動(dòng)DNA測序進(jìn)行證實(shí)。圖8b和8c分別顯示JM22 TCR的突變?chǔ)梁挺骆湹腄NA序列，且圖9a和9b顯示生成的氨基酸序列。
如在實(shí)施例1和2中所描述的那樣表達(dá)相應(yīng)的TCR鏈、共同重折疊和純化。圖10說明應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS50HQ柱對(duì)可溶性二硫鍵連接的JM22 TCR蛋白質(zhì)進(jìn)行的洗脫。圖11顯示自圖10中闡述的柱運(yùn)行所得級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠的結(jié)果。峰1明確包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體。圖12顯示圖10中峰1收集級(jí)分經(jīng)大小排阻柱進(jìn)行的蛋白質(zhì)洗脫。
如在實(shí)施例3中所述進(jìn)行JM22 TCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析。圖13a顯示二硫鍵連接的JM22可溶性TCR與HLA-Flu復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore分析。圖13b顯示與用于單獨(dú)注射二硫鍵連接的JM22可溶性TCR的對(duì)照進(jìn)行比較的結(jié)合反應(yīng)。測定的該二硫鍵連接的TCR對(duì)HLA-flu復(fù)合體的Kd為7.9±0.51μM。
實(shí)施例5-含新二硫鍵的可溶性NY-ESO TCR的產(chǎn)生根據(jù)已知技術(shù)從Enzo Cerundolo(分子醫(yī)學(xué)院，牛津大學(xué)(Institute ofMolecular Medicine，University of Oxford))提供的T細(xì)胞中分離編碼NY-ESO TCR的cDNA。通過用反轉(zhuǎn)錄酶處理mRNA產(chǎn)生編碼NY-ESOTCR的cDNA。
為產(chǎn)生摻入新二硫鍵的可溶性NY-ESO TCR，含α鏈BamHI和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的A6 TCR質(zhì)粒用作模板，如在實(shí)施例4中所描述的。應(yīng)用以下的引物|NdeI|5′-GGAGATATACATATGCAGGAGGTGACACAG-3′5′-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3′|BamHI||NdeI|5′-GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGACC-3′5′-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’|BglII|通過如以下的PCR克隆獲得NY-ESO TCRα和β-鏈構(gòu)建體。
應(yīng)用如上所示的引物和含NY-ESO TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用相應(yīng)限制性酶消化PCR產(chǎn)物并克隆到pGMT7以獲得表達(dá)質(zhì)粒。通過自動(dòng)DNA測序證實(shí)質(zhì)粒插入體的序列。圖14a和14b分別顯示NY-ESO TCR的突變?chǔ)梁挺骆湹腄NA序列，且圖15a和15b顯示產(chǎn)生的氨基酸序列。
如在實(shí)施例1和2中所述表達(dá)相應(yīng)的TCR鏈、共同生折疊和純化，但方法中存在以下的變更可溶性TCRs的變性從冷凍庫存中解凍30mg的溶解TCR β-鏈包涵體和60mg的溶解TCRα-鏈包涵體。在6M的胍溶液中將包涵體稀釋成終濃度為5mg/ml，并加入DTT(2M母液)使其終濃度為10mM。將混合物置37℃孵育30分鐘。
可溶性TCRs的重折疊在5℃±3℃劇烈攪拌1L的重折疊緩沖液。在加入變性的TCR鏈前約5分鐘加入氧化還原偶(2-半胱胺和胱胺(終濃度分別為6.6mM和3.7mM)。在5℃±3℃攪拌約5小時(shí)±15分鐘進(jìn)行蛋白質(zhì)的重折疊。
經(jīng)重折疊的可溶性TCRs的透析以Spectrapor 1膜(Spectrum；Product No.132670)在10L 10mM Tris pH8.1中于5℃±3℃透析經(jīng)重折疊的TCR 18-20小時(shí)。此次透析后，透析緩沖液換成新鮮的10mM Tris pH8.1(10L)并繼續(xù)在5℃±3℃透析20-22小時(shí)。
圖16說明應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS 50HQ柱對(duì)二硫鍵連接的可溶性NY-ESO TCR蛋白質(zhì)的洗脫。圖17顯示經(jīng)圖16中所示柱的級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠的結(jié)果。峰1和峰2明確包含鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體。圖18顯示來自圖17中峰1(A)和峰2(B)收集的合并級(jí)分的大小排阻層析。蛋白質(zhì)洗脫為單一主峰，與TCR異源二聚體對(duì)應(yīng)。
二硫鍵連接的NY-ESO TCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析如實(shí)施例3中的描述進(jìn)行。圖19顯示二硫鍵連接的NY-ESO可溶性TCR與HLA-NYESO復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore分析。A.峰1，B.峰2。
該二硫鍵連接的TCR對(duì)HLA-NY-ESO復(fù)合體的Kd測定為9.4±0.84μM。
實(shí)施例6-含新鏈間二硫鍵且兩個(gè)半胱氨酸中至少其一為形成天然鏈間二硫鍵所需的可溶性NY-ESO TCR的產(chǎn)生為產(chǎn)生摻入一個(gè)新二硫鍵且半胱氨酸殘基中的至少其一參與形成天然二硫鍵的可溶性NY-ESO TCR，含α鏈BamHI和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒用作構(gòu)架，如在實(shí)施例4中所描述的。應(yīng)用以下的引物
|NdeI|5′-GGAGATATACATATGCAGGAGGTGACACAG-3′5′-CCCAAGCTTAACAGGAACTTTCTGGGCTGGGGAAGAA-3′|HindIII||NdeI|5′-GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGACC-3′5′-CCCAAGCTTAACAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3′|BglII|通過如以下的PCR克隆獲得NY-ESO TCRα和β-鏈構(gòu)建體。
應(yīng)用如上所示的引物和含NY-ESO TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用相應(yīng)限制性酶消化PCR產(chǎn)物并克隆到pGMT7以獲得表達(dá)質(zhì)粒。通過自動(dòng)DNA測序證實(shí)質(zhì)粒插入體的序列。圖20a和20b分別顯示NY-ESO TCR的突變?chǔ)梁挺骆湹腄NA序列，且圖21a和21b顯示產(chǎn)生的氨基酸序列。
為產(chǎn)生含非天然鏈間二硫鍵和天然鏈間二硫鍵的可溶性NY-ESOTCR，用以上兩引物分離的DNA均得以應(yīng)用。為產(chǎn)生具有非天然鏈間二硫鍵和僅具有一個(gè)參與天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基的可溶性NY-ESOTCRs，應(yīng)用用以上引物中的一個(gè)以及實(shí)施例5中適宜引物所分離的DNA。
表達(dá)相應(yīng)的TCR鏈、共同重折疊和純化，如在實(shí)施例5中所述。
圖22-24說明應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS 50HQ陰離子交換柱對(duì)可溶性NY-ESO TCRαcysβcys(即在兩條鏈中均具有非天然和天然半胱苷酸)、TCRαcys(在兩條鏈中均具有非天然半胱氨酸但僅在α鏈中具有天然半胱氨酸)和TCRβcys(在兩條鏈中均具有非天然半胱氨酸但僅在β鏈中具有天然半胱氨酸)的蛋白質(zhì)的洗脫。圖25和26分別顯示經(jīng)圖22-24中所過柱子的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠的結(jié)果。結(jié)果明確顯示已形成鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體。圖27-29分別為經(jīng)圖22-24所述的NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys陰離子交換柱洗脫的收集級(jí)分進(jìn)行凝膠過濾層析的蛋白質(zhì)洗脫圖。蛋白質(zhì)洗脫為一單一主峰，與TCR異源二聚體對(duì)應(yīng)。
sTCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析按實(shí)施例3中所描述的進(jìn)行。圖30-32分別顯示NY-ESO TCRαcysβcys、TCRαcys和TCRβcys與HLA-NYESO復(fù)合體特異結(jié)合的BIAcore分析。
TCRαcysβcys的Kd值為18.08±2.075μM，TCRαcys的Kd值為19.24±2.01μM且TCRβcys的Kd值為22.5±4.0692μM。
實(shí)施例7-含新鏈間二硫鍵的可溶性AH-1.23 TCR的產(chǎn)生根據(jù)已知技術(shù)從Hill Gaston(醫(yī)學(xué)院(Medical School)，Addenbrooke’s醫(yī)院，劍橋(Cambridge))提供的T細(xì)胞中分離編碼AH-1.23 TCR的cDNA。通過用反轉(zhuǎn)錄酶處理mRNA產(chǎn)生編碼NY-ESOTCR的cDNA。
為產(chǎn)生摻入新二硫鍵的可溶性AH-1.23 TCR，含α鏈BamHI和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的TCR質(zhì)粒用作模板，如在實(shí)施例4中所描述的。
|NdeI|5′-GGGAAGCTTACATATGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGG-3′5′-TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3′|BamHI||NdeI|5′-TTGGAATTCACATATGGGCGTCATGCAGAACCCAAGACAC-3′5′-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3′|BglII|通過如以下的PCR克隆獲得AH-1.23 TCRα和β-鏈構(gòu)建體。
應(yīng)用如上所示的引物和含AH-1.23 TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用相應(yīng)限制性消化PCR產(chǎn)物并克隆到pGMT7以獲得表達(dá)質(zhì)粒。通過自動(dòng)DNA測序證實(shí)質(zhì)粒插入體的序列。圖33a和33b分別顯示AH-1.23 TCR的突變?chǔ)梁挺骆湹腄NA序列，且圖34a和34b顯示產(chǎn)生的氨基酸序列。
表達(dá)相應(yīng)的TCR鏈、共同重折疊和純化，如在實(shí)施例5中描述的。
圖35說明應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度經(jīng)POROS 50HQ陰離子交換柱對(duì)二硫鍵連接的可溶性AH-1.23 TCR蛋白質(zhì)的洗脫。圖36和37分別顯示經(jīng)圖35中所示柱收集級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠的結(jié)果。這些凝膠明確表明鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體的存在。圖38為經(jīng)圖35中所示的陰離子交換柱收集級(jí)分進(jìn)行Superdex 75 HR凝膠過濾柱的洗脫圖。蛋白質(zhì)洗脫為一單一主峰，與異源二聚體對(duì)應(yīng)。
實(shí)施例8-在恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)內(nèi)的備選位置含有新鏈間二硫鍵的可溶性A6 TCRs的產(chǎn)生以下實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行用以研究是否可能在TCR免疫球蛋白區(qū)TRAC*01外顯子1的48位蘇氨酸和TRBC1*01/TRBC2*01二者的外顯子1的57位絲氨酸之間以外的位置形成包含新二硫鍵的功能性可溶TCRs。
為突變A6 TCR的α-鏈，設(shè)計(jì)以下的引物(引物名稱中的數(shù)字是指TRAC*01外顯子1中突變氨基酸殘基的位置，突變殘基以小寫字母顯示)T48→C突變5’-CACAGACAAAtgTGTGCTAGACAT-3’5’-ATGTCTAGCACAcaTTTGTCTGTG-3’Y10→C突變5’-CCCTGCCGTGTgCCAGCTGAGAG-3”5’-CTCTCAGCTGGcACACGGCAGGG-3’L12→C突變5’-CCGTGTACCAGtgcAGAGACTCTAAATC-3’5’-GATTTAGAGTCTCTgcaCTGGTACACGG-3’S15→C突變5’-CAGCTGAGAGACTgTAAATCCAGTGAC-3’5’-GTCACTGGATTTAcAGTCTCTCAGCTG-3’V22→C突變5’-CAGTGACAAGTCTtgCTGCCTATTCAC-3’5’-GTGAATAGGCAGcaAGACTTGTCACTG-3’
Y43→C突變5’-GATTCTGATGTGTgTATCACAGACAAAT-3’5’-ATTTGTCTGTGATAcACACATCAGAATC-3’T45→C突變5’-CTGATGTGTATATCtgtGACAAAACTGTGC-3’5’-GCACAGTTTTGTCacaGATATACACATCAG-3’L50→C突變5’-AGACAAAACTGTGtgtGACATGAGGTCT-3’5’-AGACCTCATGTCacaCACAGTTTTGTCT-3’M52→C突變5’-ACTGTGCTAGACtgtAGGTCTATGGAC-3’5’-GTCCATAGACCTacaGTCTAGCACAGT-3’S61→C突變5’-CTTCAAGAGCAACtGTGCTGTGGCC-3’5’-GGCCACAGCACaGTTGCTCTTGAAG-3’為突變TCR A6的β-鏈，設(shè)計(jì)以下的引物(引物名稱中的數(shù)字是指TRBC2*01外顯子1中突變氨基酸殘基的位置，突變殘基以小寫字母顯示)S57→C突變5’-CAGTGGGGTCtGCACAGACCC-3’5’-GGGTCTGTGCaGACCCCACTG-3’V13→C突變5’-CCGAGGTCGCTtgtTTTGAGCCATCAG-3’5’-CTGATGGCTCAAAacaAGCGACCTCGG-3’F14→C突變5’-GGTCGCTGTGtgtGAGCCATCAGA-3’5’-TCTGATGGCTCacaCACAGCGACC-3’S17→C突變5’-GTGTTTGAGCCATgtGAAGCAGAGATC-3’
5’-GATCTCTGCTTCacATGGCTCAAACAC-3’G55→C突變5’-GAGGTGCACAGTtGtGTCAGCACAGAC-3’5’-GTCTGTGCTGACaCaACTGTGCACCTC-3’D59→C突變5’-GGGTCAGCACAtgCCCGCAGCCC-3’5’-GGGCTGCGGGcaTGTGCTGACCC-3’L63→C突變5’-CCCGCAGCCCtgCAAGGAGCAGC-3’5’-GCTGCTCCTTGCaGGGCTGCGGG-3’S77→C突變5’-AGATACGCTCTGtGCAGCCGCCT-3’5’-AGGCGGCTGCaCAGAGCGTATCT-3’R79→C突變5’-CTCTGAGCAGCtGCCTGAGGGTC-3’5’-GACCCTCAGGCaGCTGCTCAGAG-3’E15→C突變5′-GCTGTGTTTtgtCCATCAGAA-3′5′-TTCTGATGGacaAAACACAGC-3′PCR誘變、α和βTCR構(gòu)建體擴(kuò)增、連接和質(zhì)粒純化的進(jìn)行如在實(shí)施例1中所描述，應(yīng)用以上引物的適宜組合以產(chǎn)生包括新鏈間二硫鍵的可溶性TCRs，所述新鏈間二硫鍵在以下的氨基酸對(duì)之間
圖39到58顯示以上引物擴(kuò)增的突變A6 TCR鏈的DNA和氨基酸序列。編碼突變半胱氨酸的密碼子著重顯示。
各條TCR鏈的表達(dá)、共同重折疊和純化如在實(shí)施例5中所描述。用POROS 50HQ陰離子交換柱純化后，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)跑SDS-PAGE凝膠以評(píng)價(jià)是否已形成任何正確重折疊的可溶性TCR。這些凝膠也用以確認(rèn)在純化物質(zhì)中正確分子量的任何二硫鍵連接蛋白質(zhì)的存在與否。研究中的含以下新鏈間二硫鍵的TCRs用此細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)不能產(chǎn)生正確分子量的二硫鍵連接的蛋白質(zhì)，因此不對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的測試。但是，可應(yīng)用備選的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)。
圖59到64分別顯示在以下殘基間含新鏈間二硫鍵的可溶性TCRs應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 200HQ陰離子交換柱的洗脫Thr48-Ser57、Thr45-Ser77、Tyr10-Ser17、Thr45-Asp59、Met52-Gly55和Ser15-Glu15，如由加點(diǎn)線所顯示的。圖65到70分別顯示經(jīng)圖59到64所示柱子而收集級(jí)分的還原SDS-PAGE(考馬斯染色)和非還原SDS-PAGE(考馬斯染色)凝膠的結(jié)果。這些凝膠明確顯示鏈間二硫鍵連接的TCR異源二聚體的存在。
圖71到76為經(jīng)圖59到64中所示陰離子交換柱收集級(jí)分的Superdex200 HR凝膠過濾柱的洗脫圖。
TCRs與pMHC結(jié)合的BIAcore分析的進(jìn)行如實(shí)施例3所描述。圖77-82為證明純化的可溶性TCRs與HLA-A2 tax pMHC復(fù)合體結(jié)合能力的BIAcore曲線圖。
Thr48-Ser57的Kd值為7.8μM、Thr45-Ser77的Kd值為12.7μM、Tyr10-Ser17的Kd值為34μM、Thr45-Asp59的Kd值為14.9μM且Ser15-Glu15的Kd值為6.3μM。Met52-Gly55能夠與其天然“靶標(biāo)”HLA-A2tax復(fù)合體結(jié)合，盡管其也能與“不相關(guān)”靶標(biāo)HLA-A2-NY-ESO復(fù)合體以類似方式結(jié)合(參見圖81)。
實(shí)施例9-NY-ESO-HLA-A2復(fù)合體特異的二硫鍵連接NY-ESO T細(xì)胞受體的X射線晶體學(xué)NY-ESO dsTCR的克隆如實(shí)施例所描述，且其如下表達(dá)。
分別含突變?chǔ)?鏈和β-鏈的表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染到大腸桿菌菌株BL21pLysS中，且在TYP(氨芐青霉素100μg/ml)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)抗氨芐青霉素的單菌落直到其OD600為0.7，之后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)18小時(shí)后在Beckman J-6B中4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘以收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸在含10mM Tris-HCI pH8.1、10mM MgCl2、150mM NaCl、2mM DTT、10％甘油的裂解緩沖液中。在每1L的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入100μl的溶菌酶(20mg/ml)和100μl的Dnase I(20μg/ml)。冰上孵育30分鐘后，用具標(biāo)準(zhǔn)12mm直徑探針的Milsonix XL2020超聲儀超聲細(xì)菌懸液，所述超聲應(yīng)用1分鐘的脈沖共持續(xù)10分鐘。在Beckman J2-21離心機(jī)(4℃)中13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘回收包涵體沉淀。然后在Triton洗滌緩沖液(50mM Tris-HCI pH8.1、0.5％Triton-X100、100mM NaCl、10mMNaEDTA，0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT)中進(jìn)行三次洗滌以移除細(xì)胞殘?jiān)湍こ煞?。每次洗滌時(shí)，包涵體沉淀在Triton洗滌緩沖液中進(jìn)行均質(zhì)化，之后在Beckman J2-21中13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘進(jìn)行沉淀。然后以類似方法在重懸緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl、10mMNaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT)中洗滌以移除去污劑和鹽。最后，將包涵體溶解在6M胍緩沖液(6M鹽酸胍、50mM Tris pH8.1、100mMNaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中，分成120mg的小份并冷凍在-70℃。包涵體用6M鹽酸胍溶解定量并用Bradford染料結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)進(jìn)行測量。
約60mg(即2.4微摩爾)冷凍的溶解α鏈與30mg(即1.2微摩爾)冷凍的溶解β鏈混合。用6M的胍緩沖液將該TCR混合物稀釋成終體積為18ml并于37℃加熱30分鐘以保證鏈的完全變性。然后攪拌中將含充分還原和變性的TCR鏈的胍溶液與1升冷的重折疊緩沖液(100mM Tris pH8.1、400mM L-精氨酸-HCl、2mM EDTA、6.6mM 2-半胱胺、3.7mM胱胺、5M尿素)混合。將溶液置冷室(5℃±3℃)中5小時(shí)以進(jìn)行重折疊。然后用12升的水透析重折疊產(chǎn)物18-20小時(shí)，之后用12升的10mM Tris pH8.1透析18-20小時(shí)(5℃±3℃)。截止分子量為6-8000kDa的Spectrapor1(Spectrum Laboratories，產(chǎn)品號(hào)132670)透析膜用于此透析過程。經(jīng)透析的蛋白質(zhì)用安裝在Nalgene過濾裝置中的0.45μm孔徑的濾器(Schleicher和Schuell，目錄號(hào)10404012)進(jìn)行過濾。
將透析的重折疊產(chǎn)物加到POROS 50HQ(Applied Biosystems)陰離子交換柱子用KTA凈化器(Amersham Biotech)從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離重折疊的NY-ESO TCR。加蛋白質(zhì)之前POROS 50HQ柱用10倍體積的緩沖液A(10mM Tris pH8.1)預(yù)平衡。用0-500mM NaCl梯度以7倍的柱體積洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。應(yīng)用還原和非還原樣本緩沖液在變性SDS-PAGE上分析峰級(jí)分(1ml)。含異源二聚體α-β復(fù)合體的峰級(jí)分應(yīng)用以25mM MESpH6.5預(yù)平衡的Superdex 75HR凝膠過濾柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。合并相對(duì)分子量約為50kDa處洗脫的蛋白質(zhì)峰，在Ultrafree離心濃縮器(Millipore，part number UFV2BGC40)中濃縮至42mg/ml并儲(chǔ)存于-80℃。
通過懸滴技術(shù)在18℃進(jìn)行NY-ESO TCR的結(jié)晶，應(yīng)用1μl的蛋白質(zhì)溶液(8.4mg/ml)溶在5mM Mes pH6.5中與等體積的結(jié)晶緩沖液混合。應(yīng)用Crystal Screen緩沖液(Hampton Research)的幾種不同的條件下出現(xiàn)結(jié)晶。單立方晶體(＜100μm)出現(xiàn)在30％PEG 4000、0.1M檸檬酸鈉pH5.6、0.2M乙酸銨緩沖液中，并用于結(jié)構(gòu)測定。
NY-ESO TCR的結(jié)晶快速冷凍并測試在Daresbury同步加速器的X線束中的衍射。晶體衍射為0.25mn(2.5)分辨率。收集一組數(shù)據(jù)并進(jìn)行處理使其整組中98.6％的振幅在約0.27nm(2.7)為適當(dāng)，當(dāng)也可用于近0.25nm(2.5)。合并的R-因子，即晶體等同反射多次測量間的一致性，約占所有數(shù)據(jù)的10.8％。這處于分辨力設(shè)置(resolution shell)的邊緣。空間基團(tuán)為P21，其單元維數(shù)為a＝4.25nm(42.5)、b＝5.95nm(59.5)、c＝8.17nm(81.7)、β＝91.5°。單元維數(shù)和對(duì)稱性意味著單元內(nèi)存在兩個(gè)拷貝。需要研究的不對(duì)稱單位(au)或最小體積僅具有1個(gè)分子，且單元內(nèi)的其他分子通過21對(duì)稱操作產(chǎn)生。au內(nèi)分子的位置在y-方向上是任意的。只要在x-z平面中處于正確的位置，即可將其在y-方向隨意平移。在此“極性”空間基團(tuán)，其被稱作自由參數(shù)。
PDB數(shù)據(jù)庫僅記錄了一條含A/B異源二聚體TCR，為1BD2。該記錄還具有HLA-結(jié)合肽與該TCR復(fù)合的坐標(biāo)。該TCR鏈B與NY-ESO中的相同，但鏈A在C-結(jié)構(gòu)域存在微小差異且在N-結(jié)構(gòu)域存在顯著差異。應(yīng)用1BD2 A/B模型進(jìn)行分子置換(MR)，產(chǎn)生不恰當(dāng)?shù)娜芤?，這一點(diǎn)通過與對(duì)稱等價(jià)分子的廣泛交疊所顯示。單獨(dú)應(yīng)用B鏈產(chǎn)生更佳的溶液，其不與近鄰產(chǎn)生明顯的沖突。相關(guān)系數(shù)為49％，晶體R-因子為50％且最近的距離(重心到重心)為0.49nm(49)。將起始的鏈B模型轉(zhuǎn)換成MR等價(jià)物所需的旋轉(zhuǎn)和平移操作應(yīng)用到鏈A。因此產(chǎn)生雜合的MR溶液，在單元中良好包裝，并具有最小的沖突。
電子密度圖通常與模型一致，且允許對(duì)其調(diào)整以與NY-ESO TCR的序列匹配。但起始模型具有許多缺口，特別是缺失側(cè)鏈，這是模型的不佳排布部分的特征。鏈間的許多發(fā)卡環(huán)的密度非常低，且難以建模。模型的晶體R-因子為30％。R-因子為殘數(shù)，即計(jì)算振幅和觀測振幅間的差異。
如圖83a和83b所示，來自1BD2的輸入序列并不與密度很好地匹配。更換模型使鏈A中164位為Cys和鏈B中174位為Cys，隨之以進(jìn)一步的改進(jìn)，清楚顯示該序列賦值可更好地與密度匹配。但就側(cè)鏈大小而言其差異微小，因此模型中很少存在干擾。該區(qū)域電子密度幾乎不變。
該研究最重要的方面在于新TCR的結(jié)構(gòu)與已發(fā)表模型(1BD2)的結(jié)構(gòu)非常類似。比較可包括全部的TCR、恒定結(jié)構(gòu)域或近突變位點(diǎn)的小部分。
r.m.s偏差值在以下的表中列出。結(jié)構(gòu)的比較在圖84中顯示。
(所有單位均為)短延伸指現(xiàn)在通過二硫橋連接的A鏈的單鏈(A157到A169)和B鏈的單鏈(B170到B183)。僅對(duì)主鏈原子計(jì)算偏差。
這些結(jié)果顯示二硫鍵的導(dǎo)入對(duì)鍵周圍的TCR局部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很小的影響。將該TCR與A6 TCR的已發(fā)表結(jié)構(gòu)(1BD2)進(jìn)行比較時(shí)觀察到一些較大的影響，但RMS置換的增加主要是由于環(huán)構(gòu)象的差異(參見圖84)。這些環(huán)并不形成TCR核心結(jié)構(gòu)的部分，該部分由形成特征性Ig折疊的一系列β-片層形成。完整α-鏈的RMS偏差特別大，這是由于A6(1BD2)和NY-ESO TCRs間可變結(jié)構(gòu)域序列中存在的差異。但是，A6和NY-ESOTCRs具有相同的可變?chǔ)?結(jié)構(gòu)域，且完整β-鏈的RMS偏差顯示該可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)也存在于具有新二硫鍵的TCR中。因此這些數(shù)據(jù)表明TCR的核心結(jié)構(gòu)存在于具有新二硫鍵的TCR的晶體結(jié)構(gòu)中。
實(shí)施例10-含新鏈間二硫鍵和C末端β鏈標(biāo)記位點(diǎn)的可溶性NY-ESOTCRs的產(chǎn)生。
為產(chǎn)生摻入新二硫鍵的可溶性NY-ESO TCR，應(yīng)用在實(shí)施例4中描述的含α鏈BamHI和β鏈BglII限制性位點(diǎn)的A6 TCR質(zhì)粒作為構(gòu)架。
通過如下的PCR克隆獲得NY-ESO TCR β-鏈構(gòu)建體。應(yīng)用如下所示的引物和含NY-ESO TCR鏈的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
|NdeI|Fwd5′-GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGAAC-3′Rev5′-CCACCGGATCCGTCTGCTCTACCCCAGGC-3′|BamHI|
用相應(yīng)限制性酶消化PCR產(chǎn)物并克隆到含生物素識(shí)別序列的pGMT7中以獲得表達(dá)質(zhì)粒。通過自動(dòng)DNA測序證實(shí)質(zhì)粒插入物的序列。圖85a顯示摻入生物素識(shí)別位點(diǎn)的NY-ESO TCRβ鏈的DNA序列，且圖85b顯示產(chǎn)生的氨基酸序列。
α鏈構(gòu)建體的產(chǎn)生如在實(shí)施例5中所描述。相應(yīng)TCR鏈的表達(dá)、共同重折疊和純化如在實(shí)施例5中所描述。
為產(chǎn)生含非天然鏈間二硫鍵和β鏈C末端六聚組氨酸標(biāo)簽的可溶性NY-ESO TCR，應(yīng)用以上的相同引物和NY-ESO模板。用相應(yīng)限制性酶消化PCR產(chǎn)物，并克隆入含六聚組氨酸序列的pGMT7以獲得表達(dá)質(zhì)粒。圖86a顯示摻入六聚組氨酸標(biāo)簽的NY-ESO TCRβ鏈的DNA序列，且圖86b顯示產(chǎn)生的氨基酸序列。
圖87顯示應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ陰離子交換柱洗脫含新二硫鍵和生物素識(shí)別序列的可溶性NY-ESO TCR。圖88顯示應(yīng)用以點(diǎn)線表示的0-500mM NaCl梯度從POROS 50HQ陰離子交換柱洗脫含新二硫鍵和六聚組氨酸標(biāo)簽的可溶性NY-ESO TCR。
圖89和90分別為經(jīng)圖87和88所示NY-ESO-生物素和NY-ESO-六聚組氨酸標(biāo)記的陰離子交換柱收集的合并級(jí)分進(jìn)行凝膠過濾層析的蛋白質(zhì)洗脫圖。蛋白質(zhì)洗脫為一單一主峰，與TCR異源二聚體對(duì)應(yīng)。
sTCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析的進(jìn)行如實(shí)施例3所描述。NY-ESO-生物素TCR的Kd值為7.5μM，The NY-ESO-六聚組氨酸標(biāo)記的TCR的Kd值為9.6μM。
實(shí)施例11-應(yīng)用含新鏈間二硫鍵的可溶性NY-ESO TCR的熒光標(biāo)記四聚體進(jìn)行細(xì)胞染色TCR四聚體的制備如在實(shí)施例10中制備的含新二硫鍵和生物素識(shí)別序列的NY-ESO可溶性TCRs用于形成用于細(xì)胞染色的可溶性TCR四聚體。應(yīng)用PD-10柱(Pharmacia)將2.5ml經(jīng)純化的可溶性TCR溶液(～0.2mg/ml)緩沖液交換為生物素化反應(yīng)緩沖液(50mM Tris pH8.0、10mM MgCl2)中。應(yīng)用10kDa截止分子量的centricon濃縮器(Amicon)將洗脫液(3.5ml)濃縮至1ml。濃縮使?jié)舛冉咏?0mM，加入ATP母液(0.1g/ml，調(diào)節(jié)至pH7.0)。然后加入1倍體積的蛋白酶抑制劑混合物(蛋白酶抑制劑混合物組1，Calbiochem Biochemicals)，以使蛋白酶混合物的終濃度足以達(dá)到提供的母液濃度的1/100，之后加入生物素使其濃度為1mM(母液濃度為0.2M)和酶使其濃度為20μg/ml(母液濃度為0.5mg/ml)。然后室溫過夜孵育混合物。通過S75 HR柱進(jìn)行大小排阻層析移除過量的生物素。通過如下的基于大小排阻HPLC法測定NY-ESO TCR上的生物素化水平。將一份50μl體積的生物素化NY-ESO TCR(2mg/ml)與50μl的鏈親和素包被的瓊脂糖珠(Sigma)孵育1小時(shí)。然后將珠子旋轉(zhuǎn)沉下，且將50μl的未結(jié)合樣本過TSK 2000 SW柱(Tosoohaas)，流速為0.5ml/min(200mM磷酸鹽緩沖液pH7.0)，時(shí)間30分鐘。用紫外分光光度計(jì)在214nm和280nm處檢測生物素化NY-ESO TCR的存在。生物素化NY-ESO與非生物素化NY-ESOTCR對(duì)照均過柱子。從非生物素化蛋白質(zhì)的峰面積中減去生物素化蛋白質(zhì)的峰面積計(jì)算生物素化百分率。
應(yīng)用neutravidin-藻紅蛋白結(jié)合物(Cambridge Biosciences，UK)獲得生物素化可溶性TCR的四聚化。應(yīng)用考馬斯蛋白質(zhì)試驗(yàn)(Pierce)測定生物素化可溶性TCR的濃度，并計(jì)算可溶性TCR 0.8mg/mg neutravidin-藻紅蛋白結(jié)合物的比率以獲得neutravidin-PE與生物素化TCR以1∶4的比率飽和。置冰上并溫和攪動(dòng)下將磷酸鹽緩沖液(PBS)中19.5μl的6.15mg/ml生物素化NY-ESO可溶性TCR溶液緩慢加到150μl的1mg/ml的neutravidin-PE溶液中。然后將100.5μl的PBS加到此溶液中以獲得最終的濃度為1mg/ml的NY-ESO TCR四聚體。
染色方法將四份0.5ml PBS中的0.3×106HLA-A2陽性的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(PP LCL)與不同濃度(0、10-4、10-5和10-6M)的HLA-A2 NYESO肽(SLLMWITQC)37℃孵育2小時(shí)。然后用Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)(Gibco，UK)洗滌這些PP LCL細(xì)胞兩次。
將四份中的每一份均分成兩份，并用neutravidin-藻紅蛋白新鮮四聚化的生物素化NY-ESO二硫鍵連接的TCR進(jìn)行染色。細(xì)胞與5或10μg的藻紅蛋白標(biāo)記的四聚體dsTCR復(fù)合體冰上孵育30分鐘并用HBSS洗滌。再次洗滌細(xì)胞，重懸在HBSS中并用FACSVantage分析。收集25,000個(gè)細(xì)胞并用WinMIDI軟件分析數(shù)據(jù)。
結(jié)果圖91a-h顯示如上描述制備的每一樣本產(chǎn)生的FACSVantage數(shù)據(jù)的條帶圖。以下表列出每一樣本觀察到的染色陽性細(xì)胞的百分率
這些數(shù)據(jù)明確表明被NY-ESO TCR四聚體標(biāo)記的細(xì)胞比例以與孵育細(xì)胞的肽(SLLMWITQC)濃度相關(guān)的方式增加。因此，這些NY-ESO TCR四聚體為適于對(duì)表達(dá)HLA-A2 NY-ESO復(fù)合體的特異細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的分子。
在本實(shí)施例中，應(yīng)用了熒光共軛的NY-ESO TCR四聚體。但是，如果用適宜的治療性分子替換該標(biāo)記也可預(yù)期類似的細(xì)胞結(jié)合水平。
實(shí)施例12-摻入Cβ1恒定區(qū)的具新二硫鍵的可溶性A6 TCR的產(chǎn)生。
先前的所有實(shí)施例均描述了摻入Cβ2恒定區(qū)的具新二硫鍵的可溶性TCRs的產(chǎn)生。本實(shí)施例證明摻入Cβ1恒定域的可溶性TCRs也可成功產(chǎn)生。
用于將A6 TCRβ-V-結(jié)構(gòu)域與Cβ1進(jìn)行PCR接合的引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)以下的引物用于A6 TCRβ-鏈V-結(jié)構(gòu)域的PCR構(gòu)建體5’-GGAGATATACATATGAACGCTGGTGTCACT-3’5’-CCTTGTTCAGGTCCTCTGTGACCGTGAG-3’設(shè)計(jì)以下的引物用于Cβ1的PCR構(gòu)建體5’-CTCACGGTCACAGAGGACCTGAACAAGG-3’5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)分別擴(kuò)增βVTCR構(gòu)建體和Cβ1構(gòu)建體。應(yīng)用接合PCR(stitching PCR)將兩構(gòu)建體連接。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用Qiagenmini-prep柱子純化質(zhì)粒DNA，且應(yīng)用牛津大學(xué)生物化學(xué)室的測序設(shè)備通過自動(dòng)測序證實(shí)序列。A6+Cβ1的序列在圖92中顯示。
結(jié)果，在A6+Cβ1鏈和A6αTCR鏈的C-結(jié)構(gòu)域均導(dǎo)入半胱氨酸后，通過鏈間二硫鍵A6+Cβ1鏈與A6αTCR配對(duì)。
可溶性TCR的表達(dá)和重折疊如實(shí)施例2所描述。
經(jīng)再折疊的可溶性TCR的純化將經(jīng)透析的重折疊物上樣到Akta凈化器(Pharmacia)的POROS 50HQ陰離子交換柱，并以0-500mM NaCl梯度用50倍柱體積洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)以從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離出sTCR，如在圖93中所示。峰級(jí)分儲(chǔ)存在4℃并通過考馬斯染色的SDS-PAGE(圖94)進(jìn)行分析，之后合并并濃縮級(jí)分。最后，應(yīng)用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mMEDTA、0.05％NP40)預(yù)平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱對(duì)sTCR進(jìn)行純化和表征(圖95)。合并并濃縮在相對(duì)分子量約為50kDa處的洗脫峰，之后通過BIAcore表面胞質(zhì)共振分析說明特性。
二硫鍵連接的A6 TCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析如在實(shí)施例3中所描述進(jìn)行。圖96顯示二硫鍵連接的A6可溶性TCR與其配對(duì)的pMHC特異結(jié)合的BIAcore分析。
摻入Cβ1恒定區(qū)的具有新二硫鍵的可溶性A6 TCR對(duì)其配對(duì)pMHC的Kd值為2.42±0.55μM。該值與實(shí)施例3中所測定的摻入Cβ2恒定區(qū)的具有新二硫鍵的可溶性A6 TCR的Kd值(1.8μM)非常接近。
實(shí)施例13-β鏈中摻入“自由”半胱氨酸的具有新二硫鍵的可溶性A6TCR的產(chǎn)生TCRs的β鏈恒定區(qū)包括一個(gè)不參與鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵形成的半胱氨酸殘基(TRBC1*01和TRBC2*01外顯子1的75位殘基)。先前描述的所有實(shí)施例中，產(chǎn)生具有新二硫鍵的可溶性TCRs時(shí)，該“自由”半胱氨酸均已突變?yōu)楸彼嵋员苊庑纬煽赡艿膶?dǎo)致功能性TCR產(chǎn)量降低的“不適宜”二硫鍵。本實(shí)施例證明可產(chǎn)生摻入該“自由”半胱氨酸的可溶性TCRs。
引物設(shè)計(jì)及TCRβ鏈的突變將TCRβ-鏈的丙氨酸(TRBC1*01和TRBC2*01外顯子1的75位殘基)突變?yōu)榘腚装彼釙r(shí)，設(shè)計(jì)以下的引物(突變以小寫字母顯示)5’-T GAC TCC AGA TAC tgT CTG AGC AGC CG5’-CG GCT GCT CAG Aca GTA TCT GGA GTC A可溶性TCR的PCR誘變、表達(dá)和重折疊的進(jìn)行如實(shí)施例2中所描述。
經(jīng)重折疊的可溶性TCR的純化將經(jīng)透析的重折疊物加到Akta凈化器(Pharmacia)的POROS 50HQ陰離子交換柱，并以0-500mM NaCl梯度用多于50倍柱體積洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)以從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離出sTCR，如在圖98中所示，以從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離出sTCR。峰級(jí)分儲(chǔ)存在4℃并通過考馬斯染色SDS-PAGE(圖99)進(jìn)行分析，之后合并并濃縮。最后，應(yīng)用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％NP40)預(yù)平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱(圖100)對(duì)sTCR進(jìn)行純化和表征。收集并濃縮在相對(duì)分子量約為50kDa處的洗脫峰，之后通過BIAcore表面胞質(zhì)共振分析說明其特征。
二硫鍵連接的A6 TCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析的進(jìn)行如實(shí)施例3中所描述。圖101顯示二硫鍵連接的A6可溶性TCR與其匹配的pMHC特異結(jié)合的BIAcore分析。
β鏈中摻入“自由”半胱氨酸的具有新二硫鍵的可溶性A6 TCR對(duì)其匹配的pMHC的Kd值為21.39±3.55μM。
實(shí)施例14-其β鏈中的“自由”半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的具有新二硫鍵的可溶性A6 TCR的產(chǎn)生。
本實(shí)施例證明，可成功產(chǎn)生其β鏈中的“自由”半胱氨酸(TRBC1*01和TRBC2*01外顯子1的75位殘基)突變?yōu)榻z氨酸的具有新二硫鍵的可溶性TCRs。
引物設(shè)計(jì)及TCRβ鏈誘變將TCRβ-鏈的丙氨酸(先前其替換了天然半胱氨酸(TRBC1*01和TRBC2*01外顯子1的75位殘基))替換為絲氨酸時(shí)，設(shè)計(jì)以下的引物(突變以小寫字母顯示)5’-T GAC TCC AGA TAC tCT CTG AGC AGC CG5’-CG GCT GCT CAG AGa GTA TCT GGA GTC A可溶性TCR的PCR誘變(導(dǎo)致產(chǎn)生如圖102中所示的突變?chǔ)骆?、表達(dá)和重折疊的進(jìn)行如實(shí)施例2中所示。
經(jīng)重折疊的可溶性TCR的純化將經(jīng)透析的重折疊物加到Akta凈化器(Pharmacia)的POROS 50HQ陰離子交換柱，并以0-500mM NaCl梯度用多于50倍柱體積洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，以從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離出sTCR如在圖103中所示，以從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離出sTCR。峰級(jí)分儲(chǔ)存在4℃并通過考馬斯染色SDS-PAGE(圖104)進(jìn)行分析，之后合并并濃縮。最后，應(yīng)用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％NP40)預(yù)平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱(圖105)對(duì)sTCR進(jìn)行純化和表征。收集并濃縮在相對(duì)分子量約為50kDa處的洗脫峰，之后通過BIAcore表面胞質(zhì)共振分析說明其特征。
二硫鍵連接的A6 TCR與pMHC結(jié)合的BIAcore分析的進(jìn)行如實(shí)施例3中所描述。圖106顯示二硫鍵連接的A6可溶性TCR與其匹配的pMHC特異結(jié)合的BIAcore分析。
β鏈中的“自由”半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的具有新二硫鍵的可溶性A6TCR對(duì)其匹配的pMHC的Kd值為2.98±0.27μM。該值與實(shí)施例3中所測定的β鏈中“自由”半胱氨酸突變?yōu)楸彼岬木哂行露蜴I的可溶性A6TCR的Kd值(1.8μM)非常接近。
實(shí)施例15-含新二硫鍵的NY-ESO TCRα和β鏈克隆到酵母表達(dá)載體NY-ESO TCRα和β鏈與來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的前原交配因子α序列的C末端融合并分別克隆到酵母表達(dá)載體pYX122和pYX112中(參見圖107和108)。
設(shè)計(jì)以下的引物以PCR擴(kuò)增來自釀酒酵母SEY6210菌株的前原交配因子α序列(Robinson等(1991)，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol.)11(12)5813-24)，以用于與TCRα鏈的融合。
5’-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3’5’-TCA CCT CCT GGG CTT CAG CCT CTC TTT TAT C-3’設(shè)計(jì)以下的引物以PCR擴(kuò)增來自釀酒酵母SEY6210菌株的前原交配因子α序列以用于與TCRβ鏈的融合。
5’-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3’5’-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3’將釀酒酵母SEY6210菌株的一個(gè)菌落重懸在30μl的0.25％SDS水溶液中并于90℃加熱3分鐘制備酵母DNA。用于與TCRα和β鏈融合的前原交配因子α序列通過PCR擴(kuò)增0.25μl的酵母DNA產(chǎn)生，所述擴(kuò)增應(yīng)用以上提及的相應(yīng)引物以及以下的PCR條件。12.5pmoles的每一引物與200μM dNTP、5μl的10x Pfu緩沖液和1.25單位的Pfu聚合酶(Stratagene)混合，終體積為50μl。將反應(yīng)混合物在Hybaid PCR express PCR儀中經(jīng)92℃30秒的起始變性之后，進(jìn)行30輪的變性(92℃，30秒)、退火(46.9℃，60秒)和延伸(72℃，2分鐘)。
設(shè)計(jì)以下的引物，PCR擴(kuò)增用于與以上提及的前原交配因子α序列融合的TCRα鏈。
5’-GGC TGA AGC CCA GGA GGT GAC ACA GAT TCC-3’5’-CTC CTC TCG AGT TAG GAA CTT TCT GGG CTG GG-3’設(shè)計(jì)以下的引物，PCR擴(kuò)增用于與以上提及的前原交配因子α序列融合的TCRβ鏈。
5’-GGC TGA AGC CGG CGT CAC TCA GAC CCC AAA AT-3’5’-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3’PCR擴(kuò)增TCRα和β鏈的條件與以上提及的基本相同，不同之處在于用于擴(kuò)增TCRα和β鏈的DNA模板分別為NY-ESO TCRα和β鏈(如實(shí)施例5中所制備的)；以及應(yīng)用的退火溫度為60.1℃。
然后將PCR產(chǎn)物用于PCR接合反應(yīng)中，利用最初PCR產(chǎn)物中導(dǎo)入的互補(bǔ)交錯(cuò)序列產(chǎn)生全長的嵌合基因。用限制性酶EcoR I和Xho I消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物并克隆到同樣酶切的pYX122或pYX112中。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明用QiagenTMmini-prep柱純化產(chǎn)生的質(zhì)粒，并利用Genetics Ltd，Queensway，New Milton，Hampshire，United Kingdom的測序設(shè)備通過自動(dòng)測序證實(shí)序列。圖109和110顯示克隆的嵌合產(chǎn)物的DNA和蛋白質(zhì)序列。
實(shí)施例16-含新二硫鍵的可溶性NY-ESO TCR在酵母中的表達(dá)如實(shí)施例15中描述產(chǎn)生的分別含TCRα和β鏈的酵母表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入釀酒酵母SEY6210菌株中，所述轉(zhuǎn)染應(yīng)用Agatep等(1998)(在線技術(shù)訣竅(Technical Tips Online)(http//tto.trends.com)151P01525)的方法。生長在含組氨酸和尿嘧啶的SD(synthetic dropout)瓊脂(Qbiogene，Illkirch，F(xiàn)rance)上的單菌落在10ml SD的含組氨酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)物以1∶10比例再次在10ml的含組氨酸和尿嘧啶的新鮮SD培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)4小時(shí)。用Heraeus Megafuge 2.0R(Kendro LaboratoryProducts Ltd，Bishop′s Stortford，Hertfordshire，UK)以3800轉(zhuǎn)/分鐘離心培養(yǎng)物5分鐘并回收上清。將5μl的StratClean樹脂(Stratagene)與上清混合并在blood wheel中4℃過夜旋轉(zhuǎn)。在Heraeus Megafuge 2.0R中以3800轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀StrataClean樹脂并棄去培養(yǎng)基。將25μl的還原性樣本緩沖液(含50μl的2M DTT的950μl Laemmli樣本緩沖液(Biorad))加到樹脂并將樣本在95℃加熱5分鐘，然后冰上冷卻，之后將20μl的混合物加到SDS-PAGE凝膠上，以0.8mA恒流/cm2凝膠面積電泳1小時(shí)。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到免疫印跡PVDF膜(Bio-Rad)上并與TCR抗α鏈抗體雜交，如以下的實(shí)施例17中所描述，其不同之處在以下列出。分別應(yīng)用1∶200和1∶1000稀釋的一級(jí)抗體(TCR抗α鏈)和二級(jí)抗體。圖111顯示生成的膜的圖像。結(jié)果顯示培養(yǎng)基中的酵母培養(yǎng)物存在低水平的TCR分泌。
實(shí)施例17-含二硫鍵的A6 Tax TCRα和β鏈在桿狀病毒中的表達(dá)克隆策略含二硫鍵的A6 Tax TCR的α和β鏈從pGMT7克隆到基于pBlueScript KS2-的載體pEX172。該載體設(shè)計(jì)為用于克隆不同的II類MHC的β鏈，用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)，該載體具有DRB1*0101的先導(dǎo)序列、用于插入不同的編碼肽的序列的AgeI位點(diǎn)、接頭區(qū)以及在Jun亮氨酸拉鏈序列前克隆DRβ鏈的MluI和SalI位點(diǎn)。pEX 172區(qū)別于pBlueScript IIKS-的序列位于pBlueScript II KS-的KpnI和EcoRI位點(diǎn)間，如圖112中顯示。為將TCR鏈克隆到昆蟲細(xì)胞，用AgeI和SalI消化該pEX172以移去接頭區(qū)和MluI位點(diǎn)，并將TCR鏈置入肽序列起始處。TCR序列克隆自pGMT7的5’端的BspEI位點(diǎn)(該位點(diǎn)具有AgeI兼容的粘性末端)和3’端的SalI位點(diǎn)。為提供用于移除DRβ先導(dǎo)序列的切割位點(diǎn)，保留DRβ鏈(GDT)起始的三個(gè)殘基。為防止轉(zhuǎn)錄出Jun亮氨酸拉鏈序列，必須在SalI位點(diǎn)前插入終止密碼子。該構(gòu)建體的示意圖參見圖113。一旦TCR鏈位于該質(zhì)粒內(nèi)，即將BamHI片段切下并亞克隆到pAcAB3載體，所述載體具有用于桿狀病毒的同源重組位點(diǎn)。pAcAB3載體具有兩個(gè)不同位點(diǎn)的啟動(dòng)子，其一具有BamHI位點(diǎn)而另一個(gè)具有BglII克隆位點(diǎn)。A6 TCRβ-鏈中存在BglII位點(diǎn)，因此將A6 TCRα-鏈插入到BglII位點(diǎn)，然后將β-鏈亞克隆到BamHI位點(diǎn)。
根據(jù)以上克隆策略，設(shè)計(jì)以下的引物(大寫字母與載體同源)A6αF5’-gtagtccggagacaccggaCAGAAGGAAGTGGAGCAGAACR5’-gtaggtcgacTAGGAACTTTCTGGGCTGGGA6βF5’-gtagtccggagacaccggaAACGCTGGTGTCACTCAGAR5’-gtaggtcgacTAGTCTGCTCTACCCCAGGPCR、克隆和亞克隆含二硫鍵的A6 Tax TCRα或β鏈基因的表達(dá)質(zhì)粒用作以下PCR反應(yīng)的模板。100ng的α質(zhì)粒與1μl 10mM dNTP、5μl 10xPfu-緩沖液(Stratagene)、1.25單位的Pfu聚合酶(Stratagene)、50pmol的上述A6α引物混合，且用水將終體積調(diào)整為50μl。建立用于β鏈的類似反應(yīng)混合物，應(yīng)用β質(zhì)粒和β引物對(duì)。反應(yīng)混合物在Hybaid PCR express PCR儀中進(jìn)行35輪的變性(95℃，60秒)、退火(50℃，60秒)和延伸(72℃，8分鐘)。然后用10單位的BspEI限制性酶將產(chǎn)物于37℃消化2小時(shí)，然后用10單位的SalI(New England Biolabs)進(jìn)一步消化2小時(shí)。這些消化的反應(yīng)液與已經(jīng)AgeI和SalI消化的pEX172連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌中并在37℃培養(yǎng)18小時(shí)。從每一α和β轉(zhuǎn)化板中挑取單菌落并在5ml的TYP+氨芐青霉素(16g/l細(xì)菌用胰蛋白胨、16g/l酵母提取物、5g/lNaCl、2.5g/lK2HPO4、100mg/l氨芐青霉素)中過夜培養(yǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明用QIAgen mini-prep柱純化質(zhì)粒DNA，并利用Genetix的測序設(shè)備通過自動(dòng)測序證實(shí)序列。α鏈和β鏈的BamHI插入的氨基酸序列分別在圖114和115中顯示。
這些pEX172中的α和β二硫鍵的A6 Tax TCR鏈構(gòu)建體用BamHI限制性酶(New England Biolabs)37℃消化2小時(shí)。α鏈BamHI插入序列連接到已用BglII酶消化的pAcAB3載體(Pharmingen-BD Biosciences21216P)。將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌并于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。從此平板上挑取單菌落并在5ml的TYP+氨芐青霉素中過夜培養(yǎng)并純化質(zhì)粒DNA，方法如前。然后用BamHI消化該質(zhì)粒并連入β鏈BamHI插入序列，轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌，過夜培養(yǎng)，挑選到TYP-氨芐青霉素中并培養(yǎng)，之后用QIAgen mini-prep柱純化DNA，方法如前。應(yīng)用以下的測序引物通過測序證實(shí)具有正確方向的α和β鏈pAcAB3α正向5’-gaaattatgcatttgaggatgpAcAB3β正向5’-attaggcctctagagatccgA6 TCR在昆蟲細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化、感染、表達(dá)和分析含α-鏈和β-鏈的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到在無血清培養(yǎng)基(Pharmingen-BDBiosciences551411)中培養(yǎng)的sf9細(xì)胞(Pharmingen-BD Biosciences21300C)，所述轉(zhuǎn)化應(yīng)用Baculogold轉(zhuǎn)化試劑盒(Pharmingen-BDBiosciences21100K)，按生產(chǎn)商的使用說明書操作。27℃培養(yǎng)5天后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長于其中的200μl培養(yǎng)基加到100ml的在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)密度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml的High Five細(xì)胞中。27℃繼續(xù)培養(yǎng)6天后，取1ml的該培養(yǎng)基并在Hereus microfuge中13,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘以沉淀細(xì)胞殘?jiān)?br> 10μl該昆蟲的A6二硫鍵連接的TCR的上清與陽性對(duì)照一同跑膠，所述陽性對(duì)照為5μg和10μg細(xì)菌的A6二硫鍵連接的TCR，膠為預(yù)制的4-20％Tris/甘氨酸凝膠(InvitrogenEC60252)。通過加入10μl的還原性樣本緩沖液(950μl的Laemmli樣本緩沖液(Bio-Rad161-0737)、50μl的2MDTT)并在95℃加熱5分鐘制備還原樣本，室溫冷卻10分鐘然后加樣20μl。通過加入10μl的Laemmli樣本緩沖液制備非還原樣本，并加樣20μl。
凝膠在Novex-Xcell凝膠槽中以150伏電泳1小時(shí)，之后在50ml的考馬斯凝膠染色液(1.1g的考馬斯粉溶于500ml的甲醇中攪拌1小時(shí)，加入100ml的乙酸，用水將體積調(diào)整為1升并攪拌1小時(shí)，然后用0.45μM的濾器過濾)中染色1小時(shí)，其間輕輕攪拌。在50ml的去染色液(不含考馬斯粉，其余與考馬斯染色液相同)中將凝膠去染色三次30分鐘，其間輕輕攪拌。
如前所示通過SDS-PAGE膠進(jìn)行Western印跡，不同之處在于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到免疫印跡PVDF膜(Bio-Rad162-0174)上而不是用考馬斯對(duì)凝膠進(jìn)行染色。將六張濾紙切成凝膠大小并浸到轉(zhuǎn)移緩沖液(將2.39g甘氨酸、5.81g的Tris堿、0.77g DTT溶解在500ml水中，加入200ml甲醇，然后用水將體積調(diào)整到1000ml)中。在甲醇中浸泡1分鐘且然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡2分鐘制備PVDF膜。將三張濾紙放置于免疫印跡儀器(Pharmacia-Novablot)的陽極表面，然后將膜放置在頂端，之后放入膠，最后在陰極側(cè)放置另外三張濾紙。以0.8mA恒流/cm2凝膠面積進(jìn)行免疫印跡1小時(shí)。
印跡過后，在7.5ml的封閉緩沖液(4片Tris-緩沖鹽(SigmaT5030)、3g脫脂奶粉SigmaM7409)、30μl的Tween 20，用水調(diào)整到30ml)封閉膜60分鐘，其間輕輕攪動(dòng)。用TBS洗滌緩沖液(20片TBS、150μl Tween 20，用水調(diào)整到300ml)洗滌膜三次，每次5分鐘。然后將膜與1∶50稀釋的抗TCRα鏈克隆3A8(SerotecMCA987)或抗TCRβ鏈克隆8A3(SerotecMCA988)一級(jí)抗體孵育，所述孵育在7.5ml的封閉緩沖液中進(jìn)行1小時(shí)，其間輕輕攪動(dòng)。如前所述在TBS洗滌緩沖液中洗滌膜。之后，在7.5ml的封閉緩沖液中與1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)抗體(SantaCruz BiotechSc-2005)孵育30分鐘，其間輕輕攪動(dòng)。如前所述洗滌膜，然后在用2片TBS配制的30ml水中洗滌。
通過Opti-4CN比色檢測(Biorad170-8235)(1.4ml Opt-4CN稀釋液、12.6ml H2O、0.28ml Opti-4CN底物)測定抗體結(jié)合。膜顯色30分鐘，然后在水中洗滌15分鐘。膜于室溫干燥，并將掃描圖像與考馬斯染色凝膠的圖像進(jìn)行比對(duì)(圖116)。
結(jié)果從圖116可看出，兩種含二硫鍵的TCRs均形成在SDS凝膠中穩(wěn)定的異源二聚體。這兩種TCRs還原后均分裂成α和β鏈。昆蟲產(chǎn)生的含二硫鍵的TCR異源二聚體的分子量略大于細(xì)菌產(chǎn)生的相應(yīng)二聚體，可能是由于昆蟲細(xì)胞的糖基化作用。從本實(shí)施例可看出昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生過量的α鏈，且在抗αwestern印跡的非還原泳道可觀察到游離α鏈。
這些數(shù)據(jù)明確表明，以上描述的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提供了含新二硫鍵的可溶性TCRs原核表達(dá)的可行備選方案。
權(quán)利要求
1.可溶性T細(xì)胞受體(sTCR)，其包含(i)除外其跨膜結(jié)構(gòu)域的全部或部分的TCRα鏈，和(ii)除外其跨膜結(jié)構(gòu)域的全部或部分的TCRβ鏈，其中(i)和(ii)均包含TCR鏈的功能性可變結(jié)構(gòu)域和至少一部分的恒定結(jié)構(gòu)域，且由不存在于天然TCR恒定結(jié)構(gòu)域殘基間的二硫鍵連接。
2.權(quán)利要求1中所要求的sTCR，其中(i)和(ii)中的一條鏈或兩條鏈包含TCR鏈的全部胞外恒定Ig結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的sTCR，其中(i)和(ii)中的一條鏈或兩條鏈包含TCR鏈的全部胞外結(jié)構(gòu)域。
4.可溶性αβ-形式的T細(xì)胞受體(sTCR)，其中α鏈恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白區(qū)的一個(gè)殘基與β鏈恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白區(qū)的一個(gè)殘基通過共價(jià)二硫鍵連接。
5.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其中天然TCR中不存在鏈間二硫鍵。
6.權(quán)利要求5所述的sTCR，其中天然α和βTCR鏈在C末端進(jìn)行截?cái)嘁匀コ纬商烊绘滈g二硫鍵的半胱氨酸殘基。
7.權(quán)利要求5所述的sTCR，其中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基替換為另一殘基。
8.權(quán)利要求7所述的sTCR，其中形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基替換為絲氨酸或丙氨酸。
9.前述權(quán)利中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其中存在于天然TCRβ鏈中的未配對(duì)半胱氨酸殘基是不存在的。
10.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫鍵的半胱氨酸殘基替換了天然TCR結(jié)構(gòu)中其β碳原子的距離小于0.6nm的殘基。
11.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫鍵的半胱氨酸殘基替換了TRAC*01外顯子1的Thr 48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57。
12.權(quán)利要求1到10中任何一項(xiàng)所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫鍵的半胱氨酸殘基替換了TRAC*01外顯子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 77。
13.權(quán)利要求1到10中任何一項(xiàng)所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫鍵的半胱氨酸殘基替換了TRAC*01外顯子1的Thr 10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 17。
14.權(quán)利要求1到10中任何一項(xiàng)所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫鍵的半胱氨酸殘基替換了TRAC*01外顯子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp 59。
15.權(quán)利要求1到10中任何一項(xiàng)所述的sTCR，其中形成不存在于天然TCR中的二硫鍵的半胱氨酸殘基替換了TRAC*01外顯子1的Ser 15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu 15。
16.權(quán)利要求1、2和5到15中任何一項(xiàng)所述的sTCR，其中(i)和(ii)中的每一條鏈包含的第一TCR的功能性可變結(jié)構(gòu)域均與第二TCR全部或部分的恒定結(jié)構(gòu)域融合，第一和第二TCRs來自同一物種。
17.權(quán)利要求16所述的sTCR，其中第二TCR的恒定結(jié)構(gòu)域的N末端截短到形成非天然鏈間二硫鍵的殘基。
18.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其中一條或兩條鏈在其C或N末端與另一分子衍生或融合。
19.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其中一條或兩條兩在其C和/或N末端具有可與分子融合的半胱氨酸殘基。
20.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR，其進(jìn)一步包含可檢測標(biāo)記。
21.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的與治療劑相聯(lián)的sTCR。
22.多價(jià)T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合體，其包含多種前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的sTCR。
23.權(quán)利要求22所述的復(fù)合體，其包含sTCR多聚體。
24.權(quán)利要求23所述的復(fù)合體，其包含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多的T細(xì)胞受體分子相互連接，所述連接優(yōu)選地通過接頭分子進(jìn)行。
25.權(quán)利要求22、23或24所述的復(fù)合體，其中sTCRs或sTCR多聚體存在于脂雙分子層中或連接到顆粒上。
26.用于檢測MHC-肽復(fù)合體的方法，其包括(i)提供權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所述的可溶性TCR或提供權(quán)利要求22到25中任何一項(xiàng)所述的多價(jià)T細(xì)胞受體復(fù)合體；(ii)將可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體與MHC-肽復(fù)合體接觸；以及(iii)檢測可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合體與MHC-肽復(fù)合體的結(jié)合。
27.藥物制劑，其包含權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所述的sTCR，和/或權(quán)利要求22到25中任何一項(xiàng)所述的多價(jià)TCR復(fù)合體，并包含可藥用載體。
28.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所述的sTCR的(i)或(ii)的序列，或其互補(bǔ)序列。
29.包含權(quán)利要求28中所述核酸分子的載體。
30.包含權(quán)利要求29中所述載體的宿主細(xì)胞。
31.獲得權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所定義的(i)或(ii)的方法，該方法包括在引起所述肽表達(dá)的條件下孵育權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞，以及然后純化所述多肽。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其還包括在適宜的重折疊條件下將(i)和(ii)混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了可溶性T細(xì)胞受體(sTCR)，其包含(i)除其跨膜結(jié)構(gòu)域外的TCRα鏈的全部或一部分，以及(ii)除其跨膜結(jié)構(gòu)域外的TCRβ鏈的全部或一部分。(i)和(ii)均包含TCR鏈的功能性可變結(jié)構(gòu)域和至少一部分的恒定結(jié)構(gòu)域，且通過不存在于天然TCR中的恒定結(jié)構(gòu)域殘基間的二硫鍵進(jìn)行連接。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1561343SQ02819279
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者B·K·雅各布森, M·格利克 申請(qǐng)人:艾維德克斯有限公司