從骨髓或臍帶血回收的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明包括從骨髓或臍帶血回收的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物，其包含大多數(shù)活的CD34+細(xì)胞以及基本上消耗的位于原始樣品中的紅細(xì)胞，無(wú)需任何異生素添加劑以幫助細(xì)胞分離。本發(fā)明還包括用于制備組合物的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)包括袋組和處理設(shè)備，所述處理設(shè)備利用光學(xué)傳感器、微控制器、伺服電動(dòng)機(jī)、加速計(jì)、測(cè)壓儀和電池。該系統(tǒng)和方法利用離心，以使細(xì)胞分為數(shù)層并且隨后將干細(xì)胞分離且轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。處理設(shè)備的微控制器接受來(lái)自設(shè)備的加速計(jì)、測(cè)壓儀和光學(xué)傳感器的輸入，以指導(dǎo)袋組中的計(jì)量閥打開(kāi)且關(guān)閉，以允許轉(zhuǎn)移盡可能多的干細(xì)胞與盡可能少的紅細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】從骨髓或臍帶血回收的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法
[0001]本申請(qǐng)為申請(qǐng)?zhí)枮?00780053147.5的分案申請(qǐng)，要求2007年3月28日的優(yōu)先權(quán)。
_2] 與相關(guān)_請(qǐng)的交叉參考
[0003]根據(jù)35U.S.C.§ 120，本申請(qǐng)是于2002年4月8日提交的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/118，291的部分繼續(xù)申請(qǐng)，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)專利申請(qǐng)的完整公開(kāi)內(nèi)容引入本文作為參考。根據(jù)35U.S.C.§ 120，本申請(qǐng)還是于2007年3月28日提交的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)11/664,212的部分繼續(xù)申請(qǐng)，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)專利申請(qǐng)是來(lái)自于2005年8月16日提交的國(guó)際申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US2005/029288的35U.S.C.§371國(guó)家階段申請(qǐng)，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述國(guó)際申請(qǐng)指定美國(guó)并根據(jù)PCTArticle21 (2)于2006年4月13日作為國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩02006/038993A2以英文公開(kāi)，并且其依次要求于2004年9月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/957,095的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)專利申請(qǐng)于2007年5月I日作為美國(guó)專利號(hào)7，211，191授權(quán)，所述專利的所有公開(kāi)內(nèi)容整體引入本文作為參考。
[0004]發(fā)明背景
[0005]1.發(fā)明領(lǐng)域
[0006]總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用于從人骨髓或臍帶血回收特定細(xì)胞群體的方法和裝置。具體地，本發(fā)明包括用于高效回收(分離且分開(kāi))位于骨髓或臍帶血中的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，并且取出過(guò)量紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血小板和血漿的系統(tǒng)和方法，無(wú)需借助于通常用于改善干細(xì)胞回收效率的異生素添加剤。該系統(tǒng)包括無(wú)菌、功能上封閉的袋組(bag set)以及設(shè)計(jì)為在離心場(chǎng)中操作的微處理器控制的電機(jī)械和光學(xué)設(shè)備，所述設(shè)備基于其大小和密度使細(xì)胞群體分開(kāi)，并且隨后將這些干細(xì)胞和祖細(xì)胞以預(yù)定最終體積轉(zhuǎn)移至干細(xì)胞袋。本發(fā)明還包括由人骨髓或臍帶血制備的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物，其可用于立即使用或用于貯存和隨后使用。
_7] 2.相關(guān)技術(shù)描述
[0008]為了本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求的目的，使用下述定義:
[0009]“自體使用”意指人細(xì)胞或組織植入、移植、輸注或轉(zhuǎn)移回細(xì)胞或組織從其回收的個(gè)體內(nèi)。
[0010]“類晶體”意指用于電解質(zhì)替換或增加血管內(nèi)體積的等滲鹽和/或葡萄糖溶液，例如鹽水溶液、林格氏(Ringer’s)乳酸鹽溶液或5%葡萄糖水溶液。
[0011]“造血干細(xì)胞”是產(chǎn)生許多類型的血細(xì)胞包括紅細(xì)胞(RBCs)、白血球、白細(xì)胞(WBCs)和血小板的多能干細(xì)胞。
[0012]“白血球”或白細(xì)胞是造血譜系中的細(xì)胞,其主要包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，并且表達(dá)細(xì)胞表面抗原⑶45 (⑶45+細(xì)胞)。
[0013]“淋巴細(xì)胞”是如通過(guò)Sysmex XE-2100測(cè)量的淋巴樣譜系細(xì)胞，其可以包括成熟淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)以及發(fā)育中的淋巴細(xì)胞例如淋巴母細(xì)胞。[0014]“最低限度處理的骨髄或臍帶血”意指用于干細(xì)胞和祖細(xì)胞的抗凝(例如用肝素或檸檬酸鹽)骨髄或臍帶血處理，其不包括添加化學(xué)物質(zhì)(除水，類晶體，或滅菌、防腐或貯存試劑外)，并且不改變細(xì)胞或組織的相關(guān)生物特征。
[0015]“單核細(xì)胞”是如通過(guò)Sysmex XE-2100測(cè)量的髓樣譜系細(xì)胞，其可以包括成熟單核細(xì)胞和發(fā)育中的單核細(xì)胞例如成單核細(xì)胞。
[0016]“單核的細(xì)胞”(MNC)是造血譜系中的細(xì)胞，其包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
[0017]“嗜中性粒細(xì)胞”是如通過(guò)Sysmex XE-2100測(cè)量的髓樣譜系細(xì)胞，其可以包括多形核嗜中性粒細(xì)胞和發(fā)育中的嗜中性粒細(xì)胞，例如帶形、晚幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞和成粒細(xì)胞。
[0018]“血小板”是如通過(guò)Sysmex XE-2100測(cè)量的巨核細(xì)胞系細(xì)胞，其可以包括成熟血小板(凝血細(xì)胞)。
[0019]“祖細(xì)胞”是通過(guò)一系列細(xì)胞分裂產(chǎn)生不同細(xì)胞譜系的干細(xì)胞直接后代。
[0020]“紅細(xì)胞”如通過(guò)Sysmex XE-2100測(cè)量的紅細(xì)胞系細(xì)胞，其包括成熟RBC而不是具核紅細(xì)胞。
[0021]“干細(xì)胞”是具有3種一般性質(zhì)的多能細(xì)胞:(I)它們能夠長(zhǎng)期分裂且更新其自身；
(2)它們是非特化的；和(3)它們可以產(chǎn)生不同的特化細(xì)胞類型。關(guān)于干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記是CD34抗原，升高的胞內(nèi)酶醛脫氫酶(ALDH)濃度也是這樣。
[0022]“斯托克斯定律(Stoke’ sLaw)”是描述顆粒在重力加速度過(guò)程中在粘性液體中的沉降速度的數(shù)學(xué)公式(Vg=d2 (Pl-P2)/18iixG)，其中:
[0023]? Vg=沉降速度，
[0024]? d=顆粒直徑，
[0025]? Pl=顆粒密度，
[0026]*P2=液體密度，
[0027]? G=重力加速度，和
[0028]? U =液體粘度。
[0029]“Sysmex XE-2100”是由Sysmex Corp, Kobe, Japan制造的自動(dòng)化血液學(xué)細(xì)胞分析儀，其通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分且定量造血細(xì)胞，發(fā)射半導(dǎo)體激光束，并且檢測(cè)3種光信號(hào):向前散射、側(cè)向散射和側(cè)向熒光。
[0030]“總具核細(xì)胞”(TNC)是WBCs和具核RBCs。
[0031]“異生素添加剤”和“異生素試劑”意指并非人體的天然組分的化學(xué)物質(zhì)，其有意加入收集的骨髄或臍帶血中用于達(dá)到細(xì)胞分離過(guò)程性能特征中的變化的目的，如果不添加其，所述變化將不發(fā)生。
[0032]異生素添加劑的例子是:`[0033]1.沉降試劑(例如，羥乙基淀粉、葡聚糖或明膠)；
[0034]2?密度梯度介質(zhì)(例如，F(xiàn)ieoll?, Percoll?);和
[0035]3.用于細(xì)胞表面大分子細(xì)胞的親和分子(例如單克隆抗體、與順磁珠結(jié)合的單克隆抗體)。
[0036]迄今，盡管干細(xì)胞的巨大臨床潛力，但無(wú)干細(xì)胞治療已收到FDA許可用于人使用。證實(shí)臨床功效和安全性且獲得干細(xì)胞治療的管理許可的主要障礙是，用于從骨髄或臍帶血分離干細(xì)胞群體的現(xiàn)有設(shè)備和方法具有ー個(gè)或多個(gè)下述明顯局限性:它們是冒微生物污染危險(xiǎn)的開(kāi)放系統(tǒng)；它們是時(shí)間和勞動(dòng)カ密集的；它們需要添加不希望有且昂貴的異生素試劑；它們以平均40-75%的非常低效率回收干細(xì)胞；并且它們與用于組織再生的臍帶血或骨髓量不相客。
[0037]在干細(xì)胞治療嚴(yán)重和頻繁的人疾病的廣泛使用可以發(fā)生前，所述疾病例如心肌梗死、缺血、糖尿病和皮膚傷ロ，必須克服3個(gè)關(guān)鍵障礙:
[0038]1.臨床試驗(yàn)必須證實(shí)干細(xì)胞治療的功效和安全性；
[0039]2.必須獲得由健康管理機(jī)構(gòu)，特別是食品藥品監(jiān)瞀管理局(FDA)細(xì)胞、組織和基因治療辦公室(Office of Cell, Tissue and Gene Therapy) (OCTGT)的管理許可；和
[0040]3.必須開(kāi)發(fā)用于從最低限度處理的骨髄或臍帶血快速和簡(jiǎn)單回收活的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的實(shí)用方法，其不依賴于使用異生素添加劑以取出過(guò)量血漿、紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。
[0041 ] 除造血干細(xì)胞外，目前已知骨髄和臍帶血包含具有用于組織再生且增強(qiáng)傷ロ愈合的潛在治療價(jià)值的其他類型干細(xì)胞和祖細(xì)胞。先前命名為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞可以產(chǎn)生骨、軟骨、脂肪、肌肉和結(jié)締組織，并且是ALDH Br+。位于骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞是從造血干細(xì)胞傳下來(lái)的原始細(xì)胞，可以進(jìn)入血流并且到達(dá)血管損傷區(qū)域以幫助修復(fù)損害，可以產(chǎn)生新血管,并且是⑶34+。
[0042]干細(xì)胞通過(guò)各種細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行鑒定，包括⑶34+和醛脫氫酶亮細(xì)胞(ALDHBr+)。CD34+細(xì)胞是表達(dá)命名為CD34的抗原的干細(xì)胞，所述抗原可以通過(guò)使用對(duì)于那種特定抗原具有特異性的生色團(tuán)綴合抗體進(jìn)行檢測(cè)。其他研究者基于其表達(dá)高水平的醛脫氫酶(ALDH)鑒定成體干細(xì)胞。ー個(gè)公司Aldagen (Durham,NC)開(kāi)發(fā)了利用基質(zhì)的技術(shù),所述基質(zhì)通過(guò)產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光檢測(cè)表達(dá)高水平ALDH的細(xì)胞。這些所謂的ALDH亮細(xì)胞(ALDH Br+)可以使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè) 。ALDH Br+細(xì)胞包含不同祖先，其可以產(chǎn)生多種重要細(xì)胞系，包括神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞。
[0043]干細(xì)胞的生存力可以通過(guò)幾種方法加以證實(shí)，所述方法包括排斥活體染料例如錐蟲(chóng)藍(lán)或7-氨基-放線菌素D (7-AAD)。使用商購(gòu)可得的試劑盒，通過(guò)測(cè)量作為關(guān)于在骨髄或臍帶血中的干細(xì)胞替代物的白細(xì)胞(CD45+細(xì)胞)的生存力常規(guī)評(píng)估干細(xì)胞的生存力。
[0044]大量骨髓或臍帶血是難處理的，特別是因?yàn)榇罅考t細(xì)胞的存在(對(duì)于骨髄中的每個(gè)⑶34+細(xì)胞存在約25，000個(gè)紅細(xì)胞，并且對(duì)于臍帶血中的每個(gè)⑶34+細(xì)胞存在約180，000個(gè)紅細(xì)胞)。這些過(guò)量紅細(xì)胞使得難以使用干細(xì)胞和祖細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊拇嬖趶母旧舷♂屃嗽谛枰M織再生的傷ロ部位處的干細(xì)胞和祖細(xì)胞濃度，并且它們干擾用于干細(xì)胞的其他處理步驟，包括用于先體外后體內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)，基因治療、或細(xì)胞群體的親和純化。此外，此種大量紅細(xì)胞的存在產(chǎn)生其他安全性問(wèn)題，例如在同種異體移植中的ABO不相容性。在一些情況下，還可能希望使來(lái)自體積減少的干細(xì)胞濃縮物的嗜中性粒細(xì)胞降到最低，這是由于這些細(xì)胞與炎癥反應(yīng)的潛在關(guān)聯(lián)，以及在其細(xì)胞質(zhì)中存在可能影響生存力或可塑性或以其他方式改變干細(xì)胞功能性的生物學(xué)活性酶和細(xì)胞因子。
[0045]在固定離心時(shí)間段后細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率和最終位置隨其大小和密度而變，其中它的運(yùn)動(dòng)根據(jù)斯托克斯定律進(jìn)行限定。干細(xì)胞在其密度方面低于RBCs，并且在密度方面高于血小板，具有更接近于WBCs的那種的密度。因此，通過(guò)密度和大小回收干細(xì)胞的常規(guī)方法一般涉及通過(guò)離心使細(xì)胞群體分層，且然后在從離心機(jī)取出后，嘗試從臍帶血或骨髓的剩余部分中捕獲干細(xì)胞。
[0046]從骨髓或臍帶血分離WBCs和干細(xì)胞的ー種手工方法是將全部骨髓或臍帶血插入離心機(jī)管內(nèi)，并且使它們?cè)?500-2000xg下在室溫下旋轉(zhuǎn)10-15分鐘。這使骨髓或臍帶血分離成上部血漿層、下部紅細(xì)胞(RBC)層、和在RBC和血漿之間的界面處的薄WBCs和干細(xì)胞和祖細(xì)胞層。在分層完成后，一次性塑料轉(zhuǎn)移移液管可以用于下至距離RBCs約Imm抽吸掉血漿(上層)。當(dāng)取出血漿時(shí)，必須非常小心，以免攪亂必須通過(guò)相同的移液技術(shù)取出的WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層，同時(shí)嘗試堤防干細(xì)胞和祖細(xì)胞丟失到RBCs內(nèi)或干細(xì)胞被RBCs過(guò)度污染。這種在試管中的手工方法的缺點(diǎn)是它是開(kāi)放系統(tǒng)，這冒著骨髓單位的微生物污染危險(xiǎn)；它是勞動(dòng)カ和時(shí)間密集的；WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層的紅細(xì)胞污染量是高度可變的；并且干細(xì)胞的丟失是顯著且可變的。重要的是避免微生物污染一一關(guān)于這種方法的主要關(guān)注，因?yàn)樗梢载?fù)面影響培養(yǎng)干細(xì)胞的能力或冒感染傳播給干細(xì)胞受體身體的危險(xiǎn)。 [0047]從臍帶血或骨髓回收WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體的另ー種方法利用細(xì)胞處理設(shè)備，例如 CompomatG4設(shè)備(Fresenius KabiAG,Friedberg,德國(guó))和 C0BE2991 血細(xì)胞處理器(Blood Cell Processor) (COBE Laboratories,Lakewood,CO)。這種類型的方法的例子呈3?于TsubakL入“Concentration of Progenitor Cells Collected from Bone MarrowFluid Using a Continuous Flow Cell Separator System，，，ApheresisandDialysis5(I),46-48,2001中。對(duì)于干細(xì)胞收獲的骨髄或臍帶血量依賴于所提議的臨床用途。對(duì)于組織再生或修復(fù)中基于細(xì)胞的治療，一般收集50-150mL骨髄或臍帶血。這些血庫(kù)儀器需要大量骨髓或臍帶血(超過(guò)200mL)以正確發(fā)揮作用，并且完全不適合于一般對(duì)于組織再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用收集的低體積(小于200mL)。此外，這些機(jī)械化方法的細(xì)胞產(chǎn)物的最終體積(50-100mL)基本上大于優(yōu)選的3-20mL最終體積，這提供對(duì)于臨床用途合適的干細(xì)胞和祖細(xì)胞濃度。這些儀器還需要泵以將血液或骨髄從ー個(gè)容器移動(dòng)到另ー個(gè)，并且這些泵可能潛在引起對(duì)于細(xì)胞的機(jī)械損害。
[0048]用于骨髓或臍帶血的體積減少和純化的另ー種方法利用梯度介質(zhì)例如Fkoli?或.Pereoll⑩，以與骨髓或臍帶血組合，并且在離心過(guò)程中，使其自身介入細(xì)胞群體之間，以減少在回收干細(xì)胞的嘗試過(guò)程中細(xì)胞群體的混合。Fieoll?是中性、高分支、高質(zhì)量、親水的多糖。Fieoli? (例如密度1.077)可以用于將血液或骨髓分離成其組分(紅細(xì)胞、白細(xì)胞等)。Ficoll?正常放置在管的底部，并且用鹽水稀釋的骨髓或臍帶血隨后在Fieoli?上緩慢成層。在離心后，較重的RBCs(密度1.09-1.10)取代在管底部的Fico丨Rk:ヽ并且下述層從頂部到底部在柱中可見(jiàn):(I)血漿和血小板；(2)單核的細(xì)胞(MNC)(密度1.06-1.07);
(3)Ficoll?；和(4)在底部以沉淀形式存在的紅細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞(密度1.08-1.09)。這種分離允許以MNCs與RBCs共混合的更少機(jī)會(huì)收獲MNCs。一些紅細(xì)胞俘獲(紅細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的存在)仍在MNC層中發(fā)生。
[0049]用Ficoll?處理骨髄或臍帶血的明顯缺點(diǎn)是在將FicoU?加入骨髄或臍帶血的步驟時(shí)它是開(kāi)放系統(tǒng)，從而意味著微生物可以直接進(jìn)入骨髄或臍帶血內(nèi)，并且從而增加微生物污染的危險(xiǎn)。為了減少這種危險(xiǎn)，必須使用生物學(xué)安全工作櫥執(zhí)行這個(gè)步驟，這可能不總是可得到的，并且是為了可接受的性能必須連續(xù)維持且監(jiān)控的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的昂貴部分。此外，F(xiàn)ico丨I?是異生素，并且在細(xì)胞可以安全地施用于人體前必須通過(guò)洗滌取出。這個(gè)洗滌步驟需要時(shí)間和努力，并且進(jìn)ー步增加關(guān)于微生物污染和細(xì)胞丟失的可能性。干細(xì)胞的回收是低的且高度可變的，為20-70%。Percoli⑩，用聚乙烯吡咯烷酮包被的膠態(tài)二氧化硅,是類似于Ficoll?的具有其伴隨缺點(diǎn)的另ー種密度梯度介質(zhì)。
[0050]關(guān)于使用羥乙基淀粉(HES)沉降試劑分離骨髄白細(xì)胞的技術(shù)已由A.Montuoro等人，“A technique for isolation of bone marrow cells using hyaroxyethyl starch(HES) sedimentation agent, Haematologica76Suppll:7-9,1991 公開(kāi)。HES 在臨床上用作血漿擴(kuò)張劑并且特征在于它的分子量及其取代程度。一般以0.5-2% HES重量與骨髄或臍帶血體積的終濃度的HES添加引起紅細(xì)胞凝集，并且從而基于斯托克斯定律的原理改變其沉降速度。然而，HES是異生素，并且已與靜脈內(nèi)施用時(shí)ー些患者中的不利事件相關(guān)。此外，！ES的使用増加成本和對(duì)于細(xì)胞處理的另外復(fù)雜性。葡聚糖聚合物制劑和明膠溶液也已用于相同目的，并且具有與!ES相同的缺點(diǎn)。
[0051]最后，還已知可以通過(guò)使用免疫方法從骨髓或臍帶血分離干細(xì)胞和祖細(xì)胞，所述免疫方法包括流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分選(Beckton Dickinson或Coulter)和通過(guò)抗體包被的順磁顆粒細(xì)胞分選例如Miltenyi CliniMacs或BaxterIsolex系統(tǒng)。對(duì)干細(xì)胞抗原例如⑶34具有特異性的抗體用作這些分離技術(shù)的部分。這些方法具有需要昂貴的異生素試劑、設(shè)備和一次性處理用具，并且執(zhí)行是費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。雖然最終產(chǎn)物是具有少的紅細(xì)胞或白細(xì)胞污染的更純的干細(xì)胞群體，但這個(gè)純度水平代表相當(dāng)大的產(chǎn)生的費(fèi)用，并且可能不是達(dá)到預(yù)期細(xì)胞治療效果所需要的。此外，抗體和珠對(duì)骨髄或臍帶血的添加意味著產(chǎn)物在方法過(guò)程中不是“最低限度處理的”，因?yàn)檫@些試劑可能引起非故意的不利生物后果，例如干細(xì)胞不可逆的分化成譜系定型途徑。
[0052]由 Minguell,等人“Preparative separation of nucleated cells from humanbone marrow”，Experentia35:548-549,1978的研究比較了由于用葡聚糖、葡聚糖加
Ficoll?、 和血沉棕黃層法處理的體積減少、細(xì)胞回收和細(xì)胞生存力。該論文
證實(shí)缺乏用于骨髄的理想制備方法`，因?yàn)椹`些方法引起細(xì)胞生存カ的喪失，并且全部具有68%或更少淋巴樣細(xì)胞(單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞或MNC)的相對(duì)低的細(xì)胞回收。為了達(dá)到所觀察到的2.7:1紅細(xì)胞(RBC)/具核細(xì)胞比，命名為血沉棕黃層法的無(wú)需沉降輔助的離心法具有低且高度可變的(36-68% )最初存在的這些細(xì)胞的淋巴樣細(xì)胞回收范圍。
[0053]發(fā)明概沭
[0054]需要用于從骨髄或臍帶血制備干細(xì)胞組合物的系統(tǒng)和方法，其選擇性回收高百分比的干細(xì)胞和非常低百分比的RBCs ;快速，非勞動(dòng)カ密集，且易于以一致方式執(zhí)行；可以在手術(shù)室中使用；在無(wú)菌、功能上封閉的系統(tǒng)中執(zhí)行；不需要異生素添加劑；減少骨髄或臍帶血樣品的原始體積；能夠處理一系列骨髓體積；并且允許用戶預(yù)先選擇最終產(chǎn)物的體積。還需要這樣的干細(xì)胞組合物，其包括來(lái)自原始樣品的高百分比干細(xì)胞且使那些干細(xì)胞維持在存活條件下，包含來(lái)自原始樣品的非常低百分比的RBCs，不包括任何異生素添加剤，并且具有可以由用戶選擇的最終體積。
[0055]公開(kāi)了衍生自人骨髓或臍帶血的干細(xì)胞組合物以及用于其制備的系統(tǒng)和方法。公開(kāi)的發(fā)明具有整合到單一系統(tǒng)內(nèi)的下述10個(gè)屬性:[0056]1.它回收高百分比的干細(xì)胞；
[0057]2.它通過(guò)取出過(guò)量血漿、RBCs、血小板和嗜中性粒細(xì)胞而減少骨髓或臍帶血樣品的原始體積；
[0058]3.它不需要異生素添加劑以完成干細(xì)胞回收，同時(shí)增強(qiáng)產(chǎn)物的安全性概況，從而消除關(guān)于細(xì)胞洗滌的需要，且使成本降到最低；
[0059]4.它使干細(xì)胞維持在存活條件下；
[0060]5.它快速完成(少于90分鐘)；
[0061]6.由于干細(xì)胞分離和捕獲步驟的自動(dòng)化，它并非勞動(dòng)カ密集的；
[0062]7.它易于以一致方式執(zhí)行，從而需要最低限度的操作員訓(xùn)練和專業(yè)知識(shí)；
[0063]8.它可以在手術(shù)室中或鄰近手術(shù)室使用用于自體或同種異體用途，或在細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)室中使用。
[0064]9.它在無(wú)菌、功能上封閉的系統(tǒng)中分開(kāi)且分離干細(xì)胞和祖細(xì)胞，以減少產(chǎn)物的微生物污染危險(xiǎn)；和
[0065]10.它能夠處理用于組織再生的全范圍的骨髄和臍帶血。
[0066]在ー個(gè)方面，本發(fā)明包括了包括處理袋組和處理設(shè)備的系統(tǒng)。無(wú)菌且優(yōu)選一次性的袋組包括處理袋、RBC濃縮袋、干細(xì)胞袋、計(jì)量閥和使計(jì)量閥與每個(gè)袋連接的管路。一旦臍帶血或骨髓已轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)，就將袋組放置到安裝到離心桶(bucket)內(nèi)的處理設(shè)備內(nèi)。處理設(shè)備與袋組相互作用，以在單次離心運(yùn)行過(guò)程中將WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層從骨髄或臍帶血轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。處理設(shè)備包括光學(xué)傳感器、微控制器、伺服電動(dòng)機(jī)、一個(gè)或多個(gè)加速計(jì)、測(cè)壓儀(load cell)和電池。微控制器接受且分析來(lái)自光學(xué)傳感器、加速計(jì)和測(cè)壓儀的輸入，并且指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)以精確的閥運(yùn)動(dòng)打開(kāi)且關(guān)閉計(jì)量閥，這允許在離心過(guò)程中通過(guò)密度和大小分層的不同細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到不同袋內(nèi)。
[0067]在另ー個(gè)方面，本發(fā)明還包括用于從骨髄或臍帶血分離且濃縮干細(xì)胞的方法。該方法包括下述步驟。將骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)。將裝載的袋組放置到處理設(shè)備內(nèi)。袋組在處理設(shè)備中以足夠的g力和時(shí)間離心，以使處理袋中的骨髄或臍帶血的細(xì)胞基于其密度和大小分為數(shù)層。袋組在處理設(shè)備中以較低的gカ離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)。袋組可以任選在處理設(shè)備中以足夠的g力和時(shí)間離心，以使處理袋中的細(xì)胞基于細(xì)胞密度和大小再次分為數(shù)層。袋組在處理設(shè)備中離心，同時(shí)計(jì)量閥連續(xù)快速打開(kāi)且關(guān)閉多次，以使剩余RBCs部分從處理袋分離到RBC濃縮袋內(nèi)，而不同時(shí)轉(zhuǎn)移WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層。當(dāng)袋組在離心時(shí)，處理設(shè)備使空干細(xì)胞袋的重量校準(zhǔn)為零。袋組在處理設(shè)備中離心，同時(shí)計(jì)量閥連續(xù)快速打開(kāi)且關(guān)閉多次，以使小量剰余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些血漿從處理袋中分離且轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。
[0068]在另ー個(gè)方面，本發(fā)明包括通過(guò)本發(fā)明方法的實(shí)施方案制備的衍生自骨髓或臍帶血的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物。來(lái)自骨髓的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物具有約I個(gè)CD34+細(xì)胞與約500個(gè)RBCs的比，并且來(lái)自臍帶血的具有I個(gè)⑶34+細(xì)胞與5，000個(gè)RBCs的比。這些干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物不包含任何異生素添加剤。
[0069]本發(fā)明的干細(xì)胞組合物解決了無(wú)需異生素添加劑的、關(guān)于在功能上封閉的袋組中快速制備的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物的目前未滿足的臨床需要，以達(dá)到先前難以達(dá)到的紅細(xì)胞與干細(xì)胞比。骨髓組合物是有利的，因?yàn)樗厥崭弑壤蘑?4+細(xì)胞(約97%)和ALDHBr+細(xì)胞(約92%)，同時(shí)消耗約98%的RBCs，并且不包含異生素添加剤。臍帶血組合物也是有利的，因?yàn)樗厥崭弑壤蘑?4+細(xì)胞(約95% )，同時(shí)消耗約98%的RBCs，并且不包含異生素添加剤。
[0070]附圖簡(jiǎn)沭
[0071]圖1是本發(fā)明袋組的實(shí)施方案的二維布置圖。
[0072]圖2是圖1袋組的透視圖。
[0073]圖3A是顯示圖1袋組的計(jì)量閥的ー個(gè)流體通道的示意圖。
[0074]圖3B是顯示圖3A中所示計(jì)量閥的第二個(gè)流體通道的示意圖。
[0075]圖3C是顯示圖3B中所示計(jì)量閥的第三個(gè)流體通道的示意圖。
[0076]圖4A是顯示與圖3A-3C實(shí)施方案不同的計(jì)量閥的實(shí)施方案的ー個(gè)流體通道的示意圖。
[0077]圖4B顯示圖4A中所示計(jì)量閥的第二個(gè)流體通道的示意圖。
[0078]圖5是本發(fā)明處理設(shè)備的實(shí)施方案的透視圖。
[0079]圖6是圖5處理設(shè)備的透視圖。
[0080]圖7是圖5處理設(shè)備的透視圖。
[0081]圖8是圖5處理設(shè)備的透視圖。
[0082]圖9是圖5處理設(shè)備的側(cè)視圖。
[0083]圖10是本發(fā)明處理設(shè)備的基板的實(shí)施方案的透視圖，顯示組分。
[0084]圖11是圖5處理設(shè)備的分解圖。
[0085]圖12是圖5處理設(shè)備中放置的圖1袋組的透視圖。
[0086]圖13是圖12袋組和處理設(shè)備的透視圖。
[0087]圖14是圖12袋組和處理設(shè)備的透視圖。
[0088]圖15是圖12袋組和處理設(shè)備的透視圖。
[0089]圖16是圖12袋組和處理設(shè)備在離心桶中的透視圖。
[0090]圖17是顯示圖16裝載的離心桶和離心機(jī)的部分分解圖。
[0091]圖18是圖5處理設(shè)備的微控制器的輸入和輸出的方框圖。
[0092]圖19是顯示在分層步驟后的細(xì)胞層的圖1處理袋的部分橫截面?zhèn)纫晥D。
[0093]圖20是顯示在方法的離心步驟過(guò)程中隨時(shí)間而變的在透光率中的變化的曲線圖，具體顯示在離心過(guò)程中隨時(shí)間而變的在LED和光學(xué)傳感器之間骨髓或臍帶血流體透光率中的變化。
[0094]發(fā)明詳沭
[0095]用于從骨髓或臍帶血回收干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物的系統(tǒng)
[0096]該系統(tǒng)包括袋組100和處理設(shè)備200。
[0097]圖1和2顯示袋組100的實(shí)施方案。袋組100是功能上封閉且優(yōu)選一次性的。袋組100包括通過(guò)管路或管道系統(tǒng)與計(jì)量閥連接的3個(gè)或更多個(gè)袋，具有入口管路、夾、濾器和取樣位點(diǎn)。袋組100優(yōu)選包括3個(gè)袋:處理袋102、紅細(xì)胞(RBC)濃縮袋104和干細(xì)胞袋106。
[0098]處理袋102可以由乙烯こ酸乙烯酯(EVA)制成，但還可以由PVC或其他塑料制成。RBC濃縮袋可以由PVC或其他塑料制成。干細(xì)胞袋106可以由EVA制成，盡管也可以使用其他塑料。袋102和106可以是吹塑的。RBC濃縮袋可以是RF熔接的，盡管它可以是吹塑的。
[0099]處理袋102是三維袋，其可以具有不對(duì)稱形狀，包括頂部邊緣108、彎曲側(cè)面110、垂直側(cè)面112、錐形底部113和底部出口 114。頂部邊緣108包括入口 115和2個(gè)洞116。可替代地，處理袋102可以是對(duì)稱形狀的，從而使得它的側(cè)面錐形對(duì)稱地朝向底部出口 114。處理袋102的總體積可以是約240mL，盡管在使用中，它一般充滿約50_150mL骨髓或臍帶血。處理袋102通過(guò)與入口 115連接的入口管路118供應(yīng)。入口管路118包括凹形Iuer ロ(female Iuer) 120，其允許袋組100與包含待轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)的骨髓或臍帶血的注射器連接。凹形Iuer ロ 120與凸形Iuer頭(male luer)122連接，所述凸形Iuer頭122與釘124連接，所述釘124由帽126覆蓋，所述帽126允許袋組100與包含待轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)的骨髓或臍帶血的收集袋連接。入口管路118包括凝塊和骨碎片濾器128(約200-300 U網(wǎng)孔)。管路或管道系統(tǒng)夾130位于凝塊和骨碎片濾器128與凹形Iuer ロ 120之間。入口管路118可以任選還包括取樣位點(diǎn)132、取樣枕134和取樣位點(diǎn)136，全部位于凝塊和骨碎片濾器128下。取樣位點(diǎn)132和136各自包括無(wú)針凹形Iuer 口和非放氣Iuer ロ帽。底部出口 114將輸出從處理袋102導(dǎo)向計(jì)量閥138。
[0100]RBC濃縮袋104可以是扁平袋，具有頂部邊緣105、底部邊緣107和2個(gè)側(cè)面邊緣109,并且包括蝶形釘孔(spike port) 140,其用于在過(guò)程結(jié)束時(shí)取出RBCs的等分試樣,如果需要這樣的話。底部邊緣107在ー個(gè)角落處包括入口 111。RBC濃縮袋104的體積是約IOOmL,盡管在使用中，它一般充滿約30-80mL。RBC濃縮袋104在入口 111處與供應(yīng)管路142連接，所述供應(yīng)管路142在計(jì)量閥138的連接頭139之ー處與計(jì)量閥138連接。
[0101]干細(xì)胞袋106是形狀為矩形的三維袋。干細(xì)胞袋106包括頂部邊緣117、底部邊緣119、大區(qū)室144和小區(qū)室146，其中區(qū)室144和146通過(guò)2個(gè)通道148連接。頂部邊緣117包括入口 121和2個(gè)釘孔150，其用于在過(guò)程結(jié)束時(shí)取出干細(xì)胞。干細(xì)胞袋106的體積是約30mL，盡管在使用中，它一般充滿約25mL，其中約20mL在大區(qū)室144中，并且約5mL在小區(qū)室146中。干細(xì)胞袋106在入口 121處與干細(xì)胞袋入口管路152連接，所述干細(xì)胞袋入ロ管路152通過(guò)F連接頭154與供應(yīng)管路156連接。供應(yīng)管路156在計(jì)量閥138的連接頭139之ー處與計(jì)量閥138連接。F連接頭154使供應(yīng)管路156和干細(xì)胞袋入口管路152與分支管路158連接。分支管路158通過(guò)T連接頭160與取樣管路162和冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路164連接。取樣管路162包括管路夾164和取樣位點(diǎn)166，并且在取樣枕168中終止。冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路164包括取樣位點(diǎn)170和管路夾172，并且在無(wú)菌濾器174 (優(yōu)選約0.2 U網(wǎng)孔)中終止。取樣位點(diǎn)166和170各自包括無(wú)針凹形Iuer 口和非放氣Iuer ロ帽。
[0102]管路118、142、156和162是可以由PVC、EVA或其他材料制成的管道系統(tǒng)。管路152和158是由EVA制成的管道系統(tǒng)。冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路164是在外部用PVC和在內(nèi)部用EVA制備的共擠壓管道系統(tǒng)。因?yàn)榕c冷凍保護(hù)劑接觸的塑料材料(如果它們浸出到冷凍保護(hù)劑內(nèi))可以進(jìn)入干細(xì)胞袋106且污染最終產(chǎn)物，所以使用不包含可以浸出到冷凍保護(hù)劑內(nèi)的增塑劑的材料例如EVA用于將與冷凍保護(hù)劑接觸的管路是有利的。
[0103]計(jì)量閥138 可以是旋塞閥。在一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)量閥138是三通旋塞閥，因?yàn)樗哂?個(gè)連接頭139，從而使得它可以與3個(gè)袋連接:處理袋102、RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106。其他類型的計(jì)量閥或旋塞閥也將發(fā)揮作用，例如具有4個(gè)連接頭的四通旋塞閥。計(jì)量閥138包括具有3個(gè)連接頭139的外部部分141和內(nèi)部部分143。外部部分141可以由聚碳酸酯制成。內(nèi)部部分143包括整體模塑的柄145和桶147，其可以由聚乙烯(polyethelene)制成。桶147在幾個(gè)位置之間移動(dòng)，包括定義為不允許任何流體流過(guò)計(jì)量閥138的位置的封閉位置，以及定義為允許流體流過(guò)計(jì)量閥138的位置的2個(gè)開(kāi)放位置。2個(gè)開(kāi)放位置包括允許流體從處理袋102流過(guò)計(jì)量閥138到RBC濃縮袋104的ー個(gè)位置，和允許流體從處理袋102流過(guò)計(jì)量閥138到干細(xì)胞袋106的ー個(gè)位置。在圖3A-3C中所示的一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)量閥138的桶147可以配置為包含3個(gè)開(kāi)ロ，從而允許流體沿著3個(gè)可能流體通道流動(dòng):如圖3A中所示從處理袋102到RBC濃縮袋104的預(yù)期通道；如圖3B中所示從處理袋102到干細(xì)胞袋106的預(yù)期通道；和如圖3C中所示在RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106之間的非計(jì)劃暫時(shí)通道，這可能在計(jì)量閥138在其2個(gè)預(yù)期位置之間移動(dòng)時(shí)出現(xiàn)。此種暫時(shí)流體流動(dòng)是不希望的，因?yàn)樗梢栽试Sー些另外的RBCs流入干細(xì)胞袋106內(nèi)，從而減少所得到的干細(xì)胞組合物的純度。為了解決這個(gè)擔(dān)心，在圖4A-4B中所示的另ー個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)量閥138的桶147可以可替代地配置為僅包含2個(gè)開(kāi)ロ，從而允許流體僅沿著2個(gè)可能的流體通道流動(dòng)；如圖4A中所示從處理袋102到RBC濃縮袋104的預(yù)期通道；和如圖4B中所示從處理袋102到干細(xì)胞袋106的預(yù)期通道。這種配置將排除在RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106之間任何可能的暫時(shí)流體流動(dòng)。計(jì)量閥138應(yīng)能夠經(jīng)得住在離心過(guò)程中發(fā)生的高壓；例如，評(píng)定為約500磅/英寸2 (psi)的閥是令人滿意的。供應(yīng)管路142從計(jì)量閥138導(dǎo)向RBC濃縮袋104。供應(yīng)管路156從計(jì)量閥138導(dǎo)向F連接頭154，所述F連接頭154經(jīng)由干細(xì)胞袋入口管路152導(dǎo)向干細(xì)胞袋106。管路142、152和156可以各自是熱封的且與袋組100分開(kāi)。[0104]如果需要更多的袋以使來(lái)自骨髓或臍帶血的另外組分分開(kāi)，那么袋組100可以包括另外的袋。如果包括另外的袋，那么計(jì)量閥138將具有另外的連接頭以供給每個(gè)袋，并且袋組將包括另外的供應(yīng)管路以使計(jì)量閥與每個(gè)袋連接。例如，如果希望使處理袋102中最后部分的RBCs與轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)的那些RBCs分開(kāi)，那么需要第四個(gè)袋。第四個(gè)袋通過(guò)分開(kāi)的供應(yīng)管路與計(jì)量閥138連接。在那種情況下，計(jì)量閥138將是具有4個(gè)連接頭的四通旋塞閥，并且將包括允許從處理袋102到其他3個(gè)袋中每個(gè)的流體流動(dòng)的桶。
[0105]圖5-15顯示處理設(shè)備200的實(shí)施方案。處理設(shè)備200是略微圓柱狀的，具有頂部202、底部204、前部206、背部208、側(cè)面210和側(cè)面212。前部206包括前門(mén)214以及前壁216和217。處理設(shè)備200具有機(jī)體218、干細(xì)胞袋區(qū)室220、基板222、支持托架224和處理袋吊架226。機(jī)體218和干細(xì)胞袋區(qū)室220優(yōu)選由模塑的氨基甲酸こ酯制成，盡管還可以使用其他熱塑材料。基板222優(yōu)選由不銹鋼制成。支持托架224優(yōu)選由鋁制成。處理袋吊架226優(yōu)選由不銹鋼制成。依一定尺寸制造處理設(shè)備200以配合具有IL最低限度容積的離心桶內(nèi)，所述離心桶在橫截面中可以是圓形或卵圓形的。圖16顯示處理設(shè)備200，包含在離心桶228內(nèi)部的袋組100。圖17顯示裝載的離心桶228如何安裝到在合適位置中已具有另外5個(gè)裝載的離心桶的離心機(jī)內(nèi)。
[0106]處理設(shè)備200的機(jī)體218包括主區(qū)室230，所述主區(qū)室230具有加工為接受處理袋102的尺寸的延長(zhǎng)卵圓形形狀。主區(qū)室230在頂部是開(kāi)放的，并且由開(kāi)放前門(mén)214接近，所述前門(mén)214通過(guò)鉸鏈232與處理設(shè)備200的前部206附著。主區(qū)室230具有符合且支持處理袋102的側(cè)壁234和236以及后壁238，且朝向通道240漸小，所述通道加工為接受處理袋102的錐形底部113的尺寸。側(cè)壁234和236在中部附近寬松地用架支撐處理袋102，并且在錐形底部113處更緊密地用架支撐處理袋102。接近處理袋102錐形底部113的更緊密容限是有利的，以提供關(guān)于處理袋102及其內(nèi)容物在離心的高壓過(guò)程中的支持，并且使對(duì)袋內(nèi)容物的干擾降到最低。前門(mén)214包括在其內(nèi)部表面上的凹入內(nèi)部凹進(jìn)242，所述凹入內(nèi)部凹進(jìn)242對(duì)應(yīng)于主區(qū)室230的側(cè)壁234和236以及通道240，并且提供連續(xù)表面，從而使得當(dāng)前門(mén)214閉合時(shí)，它符合且支持處理袋102。
[0107]凹進(jìn)244位于處理設(shè)備200的前部206上，在前壁216和217下，并且配置為支持計(jì)量閥138的連接頭139。閥門(mén)致動(dòng)器套箍246位于凹進(jìn)244內(nèi)，并且按一定尺寸制造且配置為接受計(jì)量閥138柄145。閥門(mén)致動(dòng)器套箍246通過(guò)螺絲250與伺服電動(dòng)機(jī)248的軸附著。相應(yīng)凹進(jìn)252位于前門(mén)214內(nèi)部上，并且按一定尺寸制造且配置為接受計(jì)量閥138的伸出末端和連接頭139。
[0108]一個(gè)或多個(gè)光學(xué)傳感器254通過(guò)主區(qū)室230的前壁217裝配，它們的小孔位于側(cè)壁236上，其中相等數(shù)目的LEDs256位于相對(duì)側(cè)壁234上。LED256包括紅色LED燈，盡管還可以使用其他類型的LEDs。一個(gè)光學(xué)傳感器254和一個(gè)LED256優(yōu)選位于通道240之上約2cm，從而使得在光學(xué)傳感器254和LED256水平以及計(jì)量閥138水平之間的處理袋102中的體積是約2mL，盡管還可以使用其他距離和相應(yīng)體積。如果包括另外的光學(xué)傳感器和LEDs,那么它們可以位于光學(xué)傳感器254和LED256之上或之下,這依賴于待分離的RBCs所需體積。
[0109]處理設(shè)備200的側(cè)面212包括槽ロ 258、貯存腔260、通道262、RBC濃縮袋凹進(jìn)264、支持架266和鉤268。槽ロ 258按一定尺寸制造且配置為接受RBC濃縮袋104的釘孔140。RBC濃縮袋凹進(jìn)264從槽ロ 258向下延伸至支持架266，并且按一定尺寸制造且配置為接受RBC濃縮袋104。貯存腔260位于槽ロ 258下，并且在RBC濃縮袋凹進(jìn)264后且與RBC濃縮袋凹進(jìn)264連續(xù)。通道262沿著RBC濃縮袋凹進(jìn)264的內(nèi)部邊緣延伸，與前門(mén)214、頂部202和背部208鄰近。支持架266是形成RBC濃縮袋凹進(jìn)264的底面的水平架。
[0110]干細(xì)胞袋區(qū)室220是水平、中空的矩形區(qū)室，其具有位于前門(mén)214的鉸鏈232下的較大側(cè)面270。干細(xì)胞袋區(qū)室268位于基板232下，并且與測(cè)壓儀272附著。干細(xì)胞袋區(qū)室220通過(guò)向下打開(kāi)的鉸接門(mén)274接近，并且經(jīng)由在其頂部邊緣處位于干細(xì)胞袋區(qū)室220內(nèi)部的閂276合到應(yīng)有位置。鉸接門(mén)274的內(nèi)部包含凹進(jìn)278，所述凹進(jìn)278按一定尺寸制造且配置為容納干細(xì)胞袋106的釘孔150和入口 121。鉸接門(mén)274的外部包含按一定尺寸制造以容納干細(xì)胞袋入口管路152的槽280和通道282。
[0111]底部通道284向上延伸并且與基板222平行，從在鉸鏈232下的前部206經(jīng)過(guò)側(cè)面210和背部208到側(cè)面212。底部通道284按一定尺寸制造以容納管路142。
[0112]處理設(shè)備200包括在側(cè)面210處延伸超過(guò)頂部202的處理袋吊架226。處理袋吊架226具有銜接在處理袋102上的洞116的接片227，使處理袋102維持在處理設(shè)備200內(nèi)部適當(dāng)位置中。LED窗ロ 229位于側(cè)面210處的頂部202上。
[0113]支持托架224是U型托架，其通過(guò)螺絲225與基板222附著，并且定向與處理設(shè)備200的側(cè)面210和212平行。
[0114]如圖10中所示，基板222優(yōu)選具有安裝到其上的下述組分:印刷電路板286、伺服電動(dòng)機(jī)248、測(cè)壓儀272和界面接觸印刷電路板288。印刷電路板286包含可編程只讀存儲(chǔ)器憶微控制器290。由于在離心過(guò)程中的熱產(chǎn)生，微控制器290可能需要溫度補(bǔ)償。測(cè)壓儀272是補(bǔ)償溫度的應(yīng)變計(jì)測(cè)壓儀。伺服電動(dòng)機(jī)248是齒輪減速電動(dòng)機(jī)。ー個(gè)或多個(gè)加速計(jì)292安裝到印刷電路板286上；如果使用2個(gè)加速計(jì)292，那么ー個(gè)可以安裝到另ー個(gè)之上。優(yōu)選地，加速計(jì)292包括測(cè)量約0-200xg的低g加速計(jì)291，和測(cè)量約1000_1700xg的高g加速計(jì)293。印刷電路板286還包括通過(guò)LED窗ロ 229可見(jiàn)的狀態(tài)LEDs294。ー個(gè)或多個(gè)狀態(tài)LEDs294可以指示電池296的充電狀態(tài)以及在方法中正執(zhí)行的當(dāng)前步驟，以及其他信息。提供界面接觸印刷電路板288以與外部電池充電器連接，并且提供與個(gè)人計(jì)算機(jī)的通訊連接。基板222通過(guò)螺絲298與機(jī)體218附著。
[0115]圖18是顯不微控制器290的輸入和輸出的方框圖。光學(xué)傳感器254、電池電壓302、測(cè)壓儀272以及加速計(jì)291和293，產(chǎn)生轉(zhuǎn)變成由微控制器290接受的數(shù)字輸入的模擬輸出。微控制器290以預(yù)定時(shí)間間隔記錄、貯存且分析那些輸入。微控制器控制伺服電動(dòng)機(jī)248、關(guān)于光學(xué)傳感器254的LED256和狀態(tài)LEDs294。當(dāng)包括計(jì)量閥138的袋組100正確放置到處理設(shè)備200內(nèi)吋，伺服電動(dòng)機(jī)248通過(guò)其傳動(dòng)軸與閥門(mén)致動(dòng)器套箍246連接，并且響應(yīng)來(lái)自微控制器290的信號(hào)，伺服電動(dòng)機(jī)248引起計(jì)量閥138移動(dòng)至不同位置，以打開(kāi)或關(guān)閉至袋組100的袋的流體流動(dòng)。
[0116]電池296位于處理設(shè)備200的側(cè)面210處在頂部202上的電池腔300中。電池296是可再充電的鎳金屬氫化物電池，包括具有總共約3.8-4伏的3個(gè)電池，所述電壓進(jìn)行調(diào)節(jié)以提供5伏的恒定電壓。電池296給微控制器290、光學(xué)傳感器254、加速計(jì)291和293、測(cè)壓儀272、光學(xué)傳感器LED256、狀態(tài)LEDs294、伺服電動(dòng)機(jī)248、以及處理設(shè)備200中的所有電路包括與個(gè)人計(jì)算機(jī)的通訊連接提供動(dòng)カ。
[0117]處理單元200可以放置在分開(kāi)的擴(kuò)展塢(docking station)中，所述擴(kuò)展塢包括電池充電器并且可以與個(gè)人計(jì)算機(jī)連接。來(lái)自微控制器290的數(shù)據(jù)可以轉(zhuǎn)移給個(gè)人計(jì)算機(jī)，并且經(jīng)由擴(kuò)展塢通過(guò)界面接觸印刷電路板288，可以接受來(lái)自個(gè)人計(jì)算機(jī)的命令。
[0118]如圖12-15中所示，袋`組100如下插入處理設(shè)備200內(nèi)。將干細(xì)胞袋106放置到干細(xì)胞袋區(qū)室220內(nèi)，從而使得底部邊緣119首先配合，并且小區(qū)室146折疊并且放置在較大側(cè)面270中。入口 121和釘孔150放置在鉸接門(mén)274的凹進(jìn)278內(nèi)部。干細(xì)胞袋入口管路152放置在鉸接門(mén)274的槽280中。鉸接門(mén)274隨后關(guān)閉并且用閂276閂上。干細(xì)胞袋入口管路152放置在通道282中。計(jì)量閥138的柄145放置到閥門(mén)致動(dòng)器套箍246內(nèi)。處理袋102在主區(qū)室230中這樣定向，從而使得前門(mén)214在處理袋102的垂直側(cè)面112上關(guān)閉。F連接頭154放置在RBC濃縮袋凹進(jìn)264內(nèi)。管路夾165關(guān)閉且連同取樣管路162 —起放置在通道262內(nèi)部。冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路165、管路夾172 (關(guān)閉的)和取樣位點(diǎn)170放置到貯存腔260內(nèi)，其中無(wú)菌濾器174放置到貯存腔260的右側(cè)壁插座內(nèi)。取樣位點(diǎn)166錨定在鉤268處。取樣枕168安裝到直接在RBC濃縮袋凹進(jìn)264的右側(cè)中的濾器插座下的凹進(jìn)內(nèi)。隨后，將供應(yīng)管路142放置到底部通道284內(nèi)，并且將RBC濃縮袋104放置到RBC濃縮袋凹進(jìn)264內(nèi)。入口管路118和取樣位點(diǎn)136向下并且朝向在側(cè)面210處的處理袋吊架226折疊。處理袋102的洞116與吊架226的接片227附著。前門(mén)214關(guān)閉。釘孔140安裝到槽ロ 258內(nèi)，其中底部邊緣107在支持架266上，從而使得RBC濃縮袋104安裝在貯存腔260上。分支管路158沿著貯存腔260的左側(cè)垂直放置。
[0119]從骨髓或臍帶血回收干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物的方法[0120]該方法包括使骨髄或臍帶血細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞密度和大小分層且分離的離心。待處理的骨髓或臍帶血包含血漿、RBCs、WBCs和干細(xì)胞，如由⑶34+和ALDHBr+干細(xì)胞標(biāo)記的存在指示的。所得到的干細(xì)胞產(chǎn)物是干細(xì)胞和祖細(xì)胞的組合物，其包括ー些WBCs、以及顯著減少的RBCs和血漿。使用上文描述的系統(tǒng)的該方法在能夠處理一系列骨髄或臍帶血體積的無(wú)菌、功能上封閉的系統(tǒng)中執(zhí)行，并且產(chǎn)生其體積可以預(yù)先由用戶選擇的最終產(chǎn)物。該方法通過(guò)取出過(guò)量RBCs和血漿，并且如果臨床上有利的，則取出嗜中性粒細(xì)胞和血小板，來(lái)顯著減少骨髓體積，從而使最終干細(xì)胞組合物中的干細(xì)胞濃縮。對(duì)于這種方法不需要異生素添加劑，所述方法從骨髓或臍帶血回收高百分比的干細(xì)胞和祖細(xì)胞。
[0121]如本說(shuō)明書(shū)中使用的，術(shù)語(yǔ)“g力”指相對(duì)離心力，并且所有對(duì)特定g力的參考均在處理設(shè)備200中的光學(xué)傳感器254位置處測(cè)定。應(yīng)當(dāng)理解本文提及的特定gカ和時(shí)間段舉例說(shuō)明該方法的實(shí)施方案，并且除所提及的那些外的gカ和時(shí)間段是有用的并且包括在該方法的其他實(shí)施方案中。
[0122]在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，包括下述步驟:
[0123]1.將骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)。
[0124]將骨髓或臍帶血收獲或收集到收集容器例如袋、注射器或其他容器內(nèi)，與抗凝劑例如肝素或(PD—起保存，并且轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)。轉(zhuǎn)移可以這樣完成:通過(guò)將釘124插入收集袋內(nèi)，使凹形旋鎖Iuer ロ(Iuerlock) 120與注射器附著,或使用無(wú)菌連接設(shè)備無(wú)菌對(duì)接收集袋和處理袋的管道系統(tǒng)。管路夾130是打開(kāi)的。骨髄或臍帶血隨后經(jīng)由重力流動(dòng)通過(guò)入口管路118從收集容器轉(zhuǎn)移到處理袋102。骨髓或臍帶血經(jīng)過(guò)凝塊和骨碎片濾器128，在它到達(dá)處理袋102前，所述凝塊和骨碎片濾器128從骨髓或臍帶血取出聚集物(例如血凝塊、脂肪球和骨碎片)。在骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移后，入口管路118在取樣位點(diǎn)132之上進(jìn)行熱封，并且取出收集容器、凝塊和骨碎片濾器128以及管路118的其余部分。
[0125]約25-200mL體積的骨髓或臍帶血可以放置到處理袋102內(nèi)，其中約50_170mL是優(yōu)選的。如果收集的骨髄或臍帶血的原始體積是約IOOmL,并且骨髄或臍帶血具有約30%的血細(xì)胞比容，那么RBC體積將是約30mL，WBC以及干細(xì)胞和祖細(xì)胞體積將是約lmL，并且剩余體積將是血衆(zhòng)。
[0126]出乎意料地，不必需沉降試劑或其他異生素添加剤，以執(zhí)行這個(gè)方法并且達(dá)到干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓或臍帶血的有效回收，如本文所描述的。如果需要沉降試劑例如HES，那么它任選加入處理袋102中的骨髄中。
[0127]如果需要，在取樣位點(diǎn)132之上的入口管路118熱封后，待處理的骨髓或臍帶血樣品可以從處理袋102中獲取。對(duì)取樣枕134進(jìn)行擠壓并且釋放以將樣品抽取到枕內(nèi)。入口管路118隨后在取樣位點(diǎn)136之上進(jìn)行熱封，并且連同取樣位點(diǎn)132取出取樣枕134。取樣枕134中的骨髓或臍帶血隨后可以通過(guò)取樣位點(diǎn)132接近用于分開(kāi)的測(cè)定，例如用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞生存力、微生物污染和HLA分析。
[0128]如果未從處理袋102中獲取樣品，那么入口管路118在取樣位點(diǎn)136之上進(jìn)行熱封，并且取出在取樣位點(diǎn)136之上的所有組分。
[0129]2.將裝載的袋組放置到處理設(shè)備內(nèi)。
[0130]將袋組100包括袋、管路和計(jì)量閥放置到如上所述的處理設(shè)備200內(nèi)。
[0131]如圖16和17中所示，將處理設(shè)備200與袋組100 —起放置到離心機(jī)的離心桶228內(nèi)，所述離心桶228可以進(jìn)行冷凍。離心機(jī)需要用另ー個(gè)處理設(shè)備200或用合適的砝碼進(jìn)行平衡。
[0132]3.使袋組以足夠的g力和經(jīng)過(guò)時(shí)間在處理設(shè)備中離心，以使處理袋中的骨髓或臍帶血細(xì)胞基于其密度和大小分為數(shù)層。
[0133]處理設(shè)備200中的袋組100以足夠的預(yù)定gカ和預(yù)定時(shí)間進(jìn)行離心，以使處理袋102中的骨髓或臍帶血細(xì)胞群體通過(guò)細(xì)胞密度和大小分為數(shù)層。例如，離心可以在約1400xg下執(zhí)行約20-約40分鐘。在這個(gè)分層步驟過(guò)程中，計(jì)量閥138處于其關(guān)閉位置，從而使得不允許流體流動(dòng)通過(guò)計(jì)量閥138。加速計(jì)293測(cè)量在離心過(guò)程中的g力。
[0134]離心優(yōu)選繼續(xù)直至細(xì)胞已分為3層。參見(jiàn)顯示在這個(gè)分層步驟已執(zhí)行后的處理袋102的圖19。下面、最濃的層400主要是RBCs ;中間密度的中間層402是WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及ー些血小板的層；并且上面、最不濃的層404主要是血漿伴隨一些另外的血小板。與干細(xì)胞和祖細(xì)胞一起存在的血小板百分比將隨著離心持續(xù)時(shí)間增加而變大。1400g力和20-40分鐘的離心時(shí)間足以引起超過(guò)70%的干細(xì)胞遷移至WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層，盡管優(yōu)選至少約80% -90%的干細(xì)胞位于這個(gè)層中。
[0135]4.袋組在處理設(shè)備中以較低gカ離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)。
[0136]細(xì)胞已在先前步驟中在處理袋102中分層后，處理設(shè)備200中的袋組100以足夠的預(yù)定較低gカ和預(yù)定時(shí)間進(jìn)行離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋102分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。g力低于步驟3中使用的g力，以依具有細(xì)胞損傷的最低危險(xiǎn)的受控方式，允許RBC層從處理袋102通過(guò)計(jì)量閥138通過(guò)供應(yīng)管路142流動(dòng)到RBC濃縮袋104內(nèi)。例如，離心可以在約80xg下執(zhí)行約3-約`10分鐘。這個(gè)離心步驟可以通過(guò)使先前步驟的g力自動(dòng)減少至預(yù)定較低g力與先前分層步驟的離心連續(xù)，或它可以在先前離心步驟已完成且停下來(lái)后起始且執(zhí)行。
[0137]加速計(jì)291測(cè)量在離心過(guò)程中的g力。微控制器290 —接受預(yù)定gカ穩(wěn)定例如約30秒的來(lái)自加速計(jì)291的輸入，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)248，以引起閥門(mén)致動(dòng)器套箍246使計(jì)量閥138打開(kāi)至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過(guò)供應(yīng)管路142且到RBC濃縮袋104內(nèi)的流體通道。在計(jì)量閥138打開(kāi)時(shí)，處理袋102中由壓緊的RBCs組成的大部分下層流動(dòng)到RBC濃縮袋104內(nèi)。
[0138]同時(shí)在計(jì)量閥138打開(kāi)時(shí)，微控制器290在流體流過(guò)LED256時(shí)指導(dǎo)光學(xué)傳感器254從LED256獲取通過(guò)在處理袋102中的骨髓或臍帶血的透光率讀數(shù)。微控制器290連續(xù)記錄且分析透光率，它接受所述透光率作為隨時(shí)間而變的來(lái)自光學(xué)傳感器254的輸入。圖20顯示隨著細(xì)胞層流經(jīng)LED256和光學(xué)傳感器254在離心過(guò)程中隨時(shí)間而變的相對(duì)透光率，在步驟4中計(jì)量閥138打開(kāi)后開(kāi)始并且持續(xù)經(jīng)過(guò)步驟8，排除任選步驟5。線近似S形曲線，具有其中存在很少的透光率或無(wú)透光率并且線幾乎水平的區(qū)域A ;其中存在透光率量中的快速増加并且線的斜率陡的區(qū)域B ;和其中存在大量透光率并且線幾乎水平的區(qū)域C。
[0139]在這個(gè)步驟過(guò)程中，RBC層流經(jīng)光學(xué)傳感器254。因?yàn)镽BC層具有最大的細(xì)胞濃度，所以它阻斷光透射至光學(xué)傳感器254。因此，在這個(gè)步驟過(guò)程中，光學(xué)傳感器254檢測(cè)出來(lái)自LED256的很少光或未檢測(cè)出光，如圖20上的區(qū)域A所示。
[0140]在RBC層已流經(jīng)光學(xué)傳感器254后，RBC層和WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層之間的界面開(kāi)始流過(guò)光學(xué)傳感器254。因?yàn)檫@個(gè)層具有比RBC層更低的細(xì)胞濃度，所以更多的光通過(guò)光學(xué)傳感器254從LED256檢測(cè)出。微控制器290 —由光學(xué)傳感器254通知，預(yù)定量的透光率已達(dá)到，這指示W(wǎng)BC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物層的經(jīng)過(guò)的開(kāi)始，微控制器就指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)248，以引起閥門(mén)致動(dòng)器套箍246使計(jì)量閥138關(guān)閉，從而使得通過(guò)計(jì)量閥138的流體流動(dòng)停止。這由圖20上的點(diǎn)D顯示。因此，WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層的最低部分一開(kāi)始達(dá)到光學(xué)傳感器254，計(jì)量閥138就關(guān)閉。
[0141]在這個(gè)分離步驟后，約2mL壓緊的RBC體積保留在處理袋102中，大部分RBC體積已轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。例如，在具有30%血細(xì)胞比容的IOOmL收集的骨髓的原始體積中，約28mLRBC體積(約93% )目前將在RBC濃縮袋104中，并且約2mL (7% )RBC體積將保留在處理袋102中。
[0142]5.袋組可以任選在處理設(shè)備中以足夠的g力和經(jīng)過(guò)時(shí)間離心，以使處理袋中的細(xì)胞基于細(xì)胞密度和大小再次分為數(shù)層。
[0143]這是個(gè)任選步驟。如果這個(gè)步驟不執(zhí)行，那么該方法前進(jìn)到下ー個(gè)步驟。
[0144]由于先前分離步驟和當(dāng)細(xì)胞溶液通過(guò)計(jì)量閥138取出時(shí)發(fā)展的科里奧利(Coriolis)力，處理袋102中的細(xì)胞層(這包括RBC層的剩余部分、所有WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層、和所有血漿層)可以在其界面處變得略微更少確定且更多混合。在這個(gè)任選步驟中，處理設(shè)備200中的袋組100可以以足夠的預(yù)定g力和時(shí)間離心，以使剩余細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞密度和大小再次分為更確定的層。例如，離心可以在約1400xg下執(zhí)行約5-約15分鐘。這個(gè)離心步驟可以通過(guò)給離心機(jī)編程以自動(dòng)增加g力與先前分離步驟的離心連續(xù)，或它可以在先前離心步驟已完成且停下來(lái)后起始且執(zhí)行。
[0145]在這個(gè)離心步驟過(guò)程中，計(jì)量閥138處于其關(guān)閉位置，從而使得不允許流體流動(dòng)通過(guò)計(jì)量閥138。離心優(yōu)選持續(xù)直至細(xì)胞已再次分為在層之間的界面處具有減少的混合的3層:剩余RBCs的下層、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞的中間層、和血漿上層。離心カ和時(shí)間是足夠的，從而使得超過(guò)70%的干細(xì)胞位于WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層中，盡管優(yōu)選至少約80% -90%的干細(xì)胞位于這個(gè)層中。
[0146]6.袋組在處理設(shè)備中離心，同時(shí)計(jì)量閥接連快速打開(kāi)且關(guān)閉多次，以使剩余RBCs的相當(dāng)大部分從處理袋更精確地轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)，而不同時(shí)轉(zhuǎn)移WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層。
[0147]先前任選再分層步驟后，或如果未執(zhí)行再分層步驟，那么在先前分離步驟后，處理設(shè)備200中的袋組100以足夠的預(yù)定g力和預(yù)定時(shí)間段離心，以完成這個(gè)步驟以及步驟7和8。例如，離心可以在約80xg (與步驟4中使用的相同的g力)下執(zhí)行約5-約15分鐘。
[0148]在這個(gè)步驟中，在處理袋102中剩余RBCs的相當(dāng)大部分精確地轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。較低g力的目的是以具有細(xì)胞損傷的最低危險(xiǎn)的受控方式，允許RBCs從處理袋102流動(dòng)到RBC濃縮袋104內(nèi)。這個(gè)離心步驟可以與先前步驟的離心連續(xù)，如果先前步驟是再分層，那么通過(guò)給離心機(jī)編程以自動(dòng)減少g力來(lái)實(shí)現(xiàn)，或如果先前步驟是分離，那么通過(guò)以相同g力繼續(xù)離心來(lái)實(shí)現(xiàn)，或它可以在先前離心步驟完成且停下來(lái)后起始且執(zhí)行。
[0149]加速計(jì)291測(cè)量在離心過(guò)程中的g力。微控制器290 —接受預(yù)定gカ穩(wěn)定例如約30秒的來(lái)自加速計(jì)291的輸入，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)248，以引起閥門(mén)致動(dòng)器套箍246使計(jì)量閥138打開(kāi)至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過(guò)供應(yīng)管路142且到RBC濃縮袋104內(nèi)的流體通道，并且隨后關(guān)閉，經(jīng)過(guò)預(yù)定時(shí)間間隔的預(yù)定持續(xù)時(shí)間連續(xù)重復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉多次達(dá)預(yù)定數(shù)目的循環(huán)，允許從處理袋102到RBC濃縮袋104訪問(wèn)足夠的重復(fù)的、不連續(xù)時(shí)間量，以允許血漿層接近光學(xué)傳感器254水平。例如，計(jì)量閥138可以設(shè)定為打開(kāi)約0.1-約0.2秒的持續(xù)時(shí)間，并且關(guān)閉約10秒，這個(gè)循環(huán)重復(fù)約10-約30次，盡管持續(xù)時(shí)間、時(shí)間間隔和重復(fù)的其他組合也將良好工作。隨著計(jì)量閥138打開(kāi)且關(guān)閉，處理袋102中剰余RBCs部分流動(dòng)到RBC濃縮袋104內(nèi)。這個(gè)精確的紅細(xì)胞取出步驟引起在先前步驟后保留在處理袋102中的2mLRBC體積中約1_1.5mL從處理袋102流動(dòng)到RBC濃縮袋104內(nèi)，甚至進(jìn)一步減少處理袋102中留下的RBC體積，并且由于伴隨計(jì)量閥138毎次短暫打開(kāi)和關(guān)閉的微小體積的RBC轉(zhuǎn)移，RBCs不與干細(xì)胞和祖細(xì)胞混合，并且由于科里奧利力，干細(xì)胞和祖細(xì)胞不吸入到轉(zhuǎn)移的紅細(xì)胞內(nèi)。如果需要，甚至更大比例的剩余RBCs也可以通過(guò)這種方式轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋102內(nèi)。
[0150]這個(gè)最終精確計(jì)量活性由微控制器290指導(dǎo)，所述微控制器290隨著處理袋102中的細(xì)胞層流過(guò)LED256，從光學(xué)傳感器254接受來(lái)自LED256的透光率讀數(shù)。微控制器290連續(xù)記錄且分析隨時(shí)間而變的透光率，并且使當(dāng)前值與先前值比較。在這個(gè)步驟過(guò)程中，WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層流經(jīng)光學(xué)傳感器254。因?yàn)檫@個(gè)層在其與RBC層的界面處具有較高的細(xì)胞濃度，并且在其與血漿層的界面處具有較低的細(xì)胞濃度，所以隨著WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層流經(jīng)光學(xué)傳感器254和與血漿層的界面接近，透光率穩(wěn)定增加。因此，在這個(gè)步驟過(guò)程中，光學(xué)傳感器254檢測(cè)出在來(lái)自LED256的透光率中的穩(wěn)定增加。這由圖20上區(qū)域B中線的斜率顯示。
[0151 ] WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層已流經(jīng)光學(xué)傳感器254后，WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層和血漿層之間的界面開(kāi)始流過(guò)光學(xué)傳感器254。因?yàn)檠獫{層具有比WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層更少的細(xì)胞，所以通過(guò)光學(xué)傳感器254從LED256檢測(cè)出更多的光。微控制器290 —接受來(lái)自光學(xué)傳感器254的輸入，所述輸入為透光率的變化率中的預(yù)定減少已發(fā)生，這基于光學(xué)傳感器254檢測(cè)預(yù)定速率值，微控制`器290就指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)248，以引起閥門(mén)致動(dòng)器套箍246使計(jì)量閥138關(guān)閉，從而使得RBCs通過(guò)計(jì)量閥138的轉(zhuǎn)移終止。這由圖20上的點(diǎn)E顯示，在從區(qū)域B中線的陡斜率到區(qū)域C中幾乎水平的線的轉(zhuǎn)換處，這是在其下WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物層已流過(guò)光學(xué)傳感器254之下并且血漿層已開(kāi)始流經(jīng)光學(xué)傳感器254的點(diǎn)。因此，血漿層的最低部分一開(kāi)始達(dá)到光學(xué)傳感器254，計(jì)量閥138就關(guān)閉。
[0152]在這個(gè)分離步驟后，約0.5-1.0mLRBC體積保留在處理袋102中，另外1_1.5mLRBC體積已轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。
[0153]7.當(dāng)袋組在離心時(shí)，處理設(shè)備使空干細(xì)胞袋的重量校準(zhǔn)為零。
[0154]計(jì)量閥138在先前步驟中已關(guān)閉后，離心以步驟6中設(shè)定的g力和時(shí)間繼續(xù)。カロ速計(jì)291證實(shí)設(shè)定的g力，在這個(gè)點(diǎn)下測(cè)壓儀272和微控制器290組合以使空干細(xì)胞袋106的重量校準(zhǔn)為零。
[0155]8.袋組在處理設(shè)備中離心，同時(shí)計(jì)量閥接連快速打開(kāi)且關(guān)閉多次，以使小量剰余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些血漿從處理袋中分離且轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。
[0156]袋組106在處理設(shè)備200中的離心以步驟6中設(shè)定的g力和時(shí)間繼續(xù)。當(dāng)微控制器290接受來(lái)自測(cè)壓儀272的輸入，所述輸入為空干細(xì)胞袋106的重量已校準(zhǔn)為零，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)248，以引起閥門(mén)致動(dòng)器套箍246使計(jì)量閥138打開(kāi)至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過(guò)供應(yīng)管路156和干細(xì)胞袋入口管路152到干細(xì)胞袋 106內(nèi)的流體通道，并且隨后關(guān)閉，經(jīng)過(guò)預(yù)定時(shí)間間隔的預(yù)定持續(xù)時(shí)間連續(xù)重復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉多次達(dá)預(yù)定數(shù)目的循環(huán)，允許從處理袋102到干細(xì)胞袋106訪問(wèn)足夠的重復(fù)的、不連續(xù)時(shí)間量，以允許干細(xì)胞袋106填充直至達(dá)到它的預(yù)定重量。例如，計(jì)量閥138可以設(shè)定為打開(kāi)約0.1-約0.2秒的持續(xù)時(shí)間，并且關(guān)閉約10秒，這個(gè)循環(huán)重復(fù)多次。隨著計(jì)量閥138打開(kāi)且關(guān)閉，處理袋102中的剩余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些血漿流動(dòng)到干細(xì)胞袋 106內(nèi)。這個(gè)步驟過(guò)程中較低g力的目的是以具有細(xì)胞損傷(其在較高g力下將發(fā)生)的最低危險(xiǎn)的受控方式，允許這些細(xì)胞從處理袋102流動(dòng)到干細(xì)胞袋106內(nèi)。[0157]在這個(gè)分離步驟過(guò)程中，測(cè)壓儀272測(cè)量干細(xì)胞袋106的重量，并且微控制器290 接受來(lái)自測(cè)壓儀272的輸入。預(yù)設(shè)WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層的所需重量，并且可以設(shè)定為約 3克-約30克。例如，如果干細(xì)胞袋106中最終干細(xì)胞產(chǎn)物的所需體積是10mL，那么可以使用10克的重量。微控制器290 —接受來(lái)自測(cè)壓儀272的輸入，所述輸入為干細(xì)胞袋106 已達(dá)到其預(yù)設(shè)重量，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動(dòng)機(jī)248，以引起閥門(mén)致動(dòng)器套箍246使計(jì)量閥138關(guān)閉，從而使得通過(guò)計(jì)量閥138的流體流動(dòng)停止。[0158]計(jì)量閥138關(guān)閉后，離心以相同的g力繼續(xù)直至已達(dá)到步驟6中的預(yù)設(shè)時(shí)間段設(shè)置。[0159]9.離心結(jié)束并且從處理設(shè)備中取出袋組。[0160]在預(yù)設(shè)離心時(shí)間段結(jié)束時(shí)，離心終止并且從離心機(jī)中取出處理設(shè)備200。從處理單元200中取出袋組100，包括所有袋、計(jì)量閥138和管路。[0161]干細(xì)胞袋106包含剩余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞、以及一些血漿。干細(xì)胞袋106 的內(nèi)容物在本文中稱為“干細(xì)胞組合物”或“干細(xì)胞的組合物”。RBC濃縮袋104包含RBCs。 處理袋102包含在干細(xì)胞袋106中不包含的血漿的剩余部分。[0162]若需要，可以獲取來(lái)自RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106的樣品。取樣管路162、取樣枕168、取樣位點(diǎn)166和管路夾164用于取樣干細(xì)胞袋106。[0163]如果干細(xì)胞組合物立即使用，例如在自體背景中，那么干細(xì)胞袋106隨后使用 Sebra密封器(Sebra Corp., Tucson, AZ.)與袋組100的其余部分分離。[0164]如果干細(xì)胞組合物待冷凍，那么冷凍保護(hù)劑溶液例如DMSO溶液應(yīng)通過(guò)無(wú)菌濾器 174和冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路165加入干細(xì)胞袋106中。使用骨髓和臍帶血作為干細(xì)胞來(lái)源的方法的例子[0165]從授權(quán)供應(yīng)商收集5單位人骨髓和6單位臍帶血，并且在收集1-3天內(nèi)進(jìn)行處理。 下表顯示對(duì)于通過(guò)本文所述方法處理的骨髓和臍帶血獲得的數(shù)據(jù)。骨髓用肝素進(jìn)行抗 凝， 并且臍帶血用(PD進(jìn)行抗凝。依一定尺寸制造以包含處理設(shè)備的臺(tái)式離心機(jī)提供離心場(chǎng)。 在這些實(shí)驗(yàn)中不使用異生素添加劑作為沉降助劑。下表1提供用于骨髓和臍帶血實(shí)驗(yàn)的方法步驟概括。[0166]表1:用于骨髓和臍帶血實(shí)驗(yàn)的方法概括[0167]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從骨髓或臍帶血制備干細(xì)胞產(chǎn)物的系統(tǒng)，其包括: a.袋組，包括容納收集的骨髄或臍帶血的處理袋、紅細(xì)胞濃縮袋、干細(xì)胞袋和計(jì)量閥，其中所述計(jì)量閥與所述處理袋、所述紅細(xì)胞濃縮袋和所述干細(xì)胞袋連接； b.處理設(shè)備，所述袋組安裝到其內(nèi)，并且包括微控制器、電動(dòng)機(jī)、光學(xué)傳感器、LED、測(cè)壓儀和加速計(jì)， c.所述微控制器可操作地偶聯(lián)至所述電動(dòng)機(jī)、所述光學(xué)傳感器、所述LED、所述測(cè)壓儀和所述加速計(jì)； d.當(dāng)所述袋組包含在所述處理設(shè)備中時(shí)，所述電動(dòng)機(jī)與所述計(jì)量閥可操作地偶聯(lián)； e.其中所述微控制器被設(shè)定為接受來(lái)自所述加速計(jì)的輸入，其中在所述處理設(shè)備中所述計(jì)量閥關(guān)閉，所述袋組以第一 gカ被離心，所述第一 g力足夠使所述處理袋中的骨髓或臍帶血分層為包含紅細(xì)胞的層，包含白細(xì)胞/干細(xì)胞和祖細(xì)胞的層，以及包含血漿的層；和 f.其中所述微控制器被設(shè)定為在骨髄或臍帶血在所述處理袋中被分層后接受來(lái)自所述加速計(jì)的輸入，其中在所述處理設(shè)備中所述袋組以第二 gカ被離心，所述第二 g力低于所述第一 g力，然后控制所述電動(dòng)機(jī)，促使所述計(jì)量閥打開(kāi)所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的流體通道，以允許相當(dāng)一部分所述紅細(xì)胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細(xì)胞濃縮袋，然后響應(yīng)所述光學(xué)傳感器，控制所述電動(dòng)機(jī)，促使所述計(jì)量閥關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道，所述光學(xué)傳感器檢測(cè)在所述處理袋的頂部邊緣和底部出ロ之間水平通過(guò)所述處理袋的來(lái)自所述LED的透光率的ー組量；和 g.其中所述微控制器被設(shè)定為在促使所述計(jì)量閥關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道后接受來(lái)自所述加速計(jì)的輸入，其中在所述處理設(shè)備中所述袋組以第三gカ被離心，然后控制所述電動(dòng)機(jī)，促使所述計(jì)量閥接連多次打開(kāi)和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道以相繼重復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道接連重復(fù)的、不連續(xù)時(shí)間量，以允許另一部分所述紅細(xì)胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細(xì)胞濃縮袋，然后響應(yīng)所述光學(xué)傳感器，控制所述電動(dòng)機(jī)，促使所述計(jì)量閥關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道，所述光學(xué)傳感器檢測(cè)在所述處理袋的所述頂部邊緣和所述底部出口之間所述水平的通過(guò)所述處理袋的來(lái)自所述LED的透光率的變化速率的降低；和 h.其中所述微控制器被設(shè)定為響應(yīng)所述微控制器接受的來(lái)自所述測(cè)壓儀測(cè)量所述干細(xì)胞袋重量的輸入，使所述干細(xì)胞袋校準(zhǔn)為零；和 1.其中所述微控制器被設(shè)定為在所述干細(xì)胞袋校準(zhǔn)為零后控制所述電動(dòng)機(jī)，促使所述計(jì)量閥接連多次打開(kāi)和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道以相繼重復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道接連重復(fù)的、不連續(xù)時(shí)間量，以足夠使至少剩余的紅細(xì)胞以及白細(xì)胞/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至所述干細(xì)胞袋然后響應(yīng)所述微控制器對(duì)來(lái)自預(yù)設(shè)重量的所述測(cè)壓儀輸入的接受，控制所述電動(dòng)機(jī)，促使所述計(jì)量閥關(guān)閉所述處理袋與所述干細(xì)胞袋之間的所述流體通道。
2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述光學(xué)傳感器位于所述處理設(shè)備中，從而使得在所述光學(xué)傳感器水平和所述計(jì)量閥水平之間的所述處理袋中的體積是約2mL。
3.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述微控制器被設(shè)定為在步驟(f)之后且步驟(g)之前接受來(lái)自所述加速計(jì)的輸入，其中在所述處理設(shè)備中所述計(jì)量閥關(guān)閉，所述袋組以第四g力離心，所述第四g力足夠使所述處理袋中的骨髄或臍帶血再次分層為包含紅細(xì)胞的層，包含白細(xì)胞/干細(xì)胞和祖細(xì)胞的層，以及包含血漿的層。
4.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述第二和所述第三g力低于所述第一g力，并且其中所述第四g力等于所述第一 g力。
5.一種用于從骨髓或臍帶血制備干細(xì)胞產(chǎn)物的系統(tǒng)，其包括: 袋組，包括容納收集的骨髄或臍帶血的處理袋、紅細(xì)胞濃縮袋、干細(xì)胞袋和計(jì)量閥，其中所述計(jì)量閥與所述處理袋、所述紅細(xì)胞濃縮袋和所述干細(xì)胞袋連接； 處理設(shè)備，所述袋組安裝到其內(nèi)， 測(cè)壓儀裝置，用于測(cè)量所述干細(xì)胞袋的重量； 加速計(jì)裝置，用于含有所述袋組的所述處理裝置的離心g力； 光學(xué)傳感器裝置，用于測(cè)量通過(guò)所述處理袋的來(lái)自LED的透光率； 裝置，用于接受第一、加速計(jì)裝置測(cè)量的、含有所述袋組的所述處理裝置的離心g力足夠的時(shí)間段以使所述處理袋中的骨髄或臍帶血分層為包含紅細(xì)胞的層，包含白細(xì)胞/干細(xì)胞和祖細(xì)胞的層，以及包含血漿的層，其中所述計(jì)量閥關(guān)閉； 裝置，用于以第二、加速計(jì)裝置測(cè)量的、含有所述袋組的所述處理裝置的離心gカ打開(kāi)所述計(jì)量閥，用于打開(kāi) 含有所述分層的骨髄或臍帶血的所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的流體通道，以允許相當(dāng)一部分所述紅細(xì)胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細(xì)胞濃縮袋，并根據(jù)光學(xué)傳感器裝置測(cè)量的用于關(guān)閉所述流體通道的通過(guò)所述處理袋的來(lái)自所述LED的透光率ー組量，用于關(guān)閉計(jì)量閥；和 裝置，用于接連多次以第三、加速計(jì)裝置測(cè)量的、含有所述袋組的所述處理裝置的離心g力打開(kāi)和關(guān)閉所述計(jì)量閥以相繼重復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的所述流體通道接連重復(fù)的、不連續(xù)時(shí)間量，以允許另一部分所述紅細(xì)胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細(xì)胞濃縮袋，井根據(jù)所述光學(xué)傳感器裝置檢測(cè)通過(guò)所述處理袋的來(lái)自所述LED的透光率的變化率的降低，用于關(guān)閉計(jì)量閥；和 裝置，用于接連多次打開(kāi)和關(guān)閉所述計(jì)量閥以相繼重復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細(xì)胞濃縮袋之間的流體通道接連重復(fù)的、不連續(xù)時(shí)間量，以足夠使至少剩余的紅細(xì)胞和白細(xì)胞/干細(xì)胞和祖細(xì)胞的層轉(zhuǎn)移至所述干細(xì)胞袋，井根據(jù)預(yù)設(shè)的、測(cè)壓儀裝置測(cè)量的、所述干細(xì)胞袋的重量，用于關(guān)閉所述計(jì)量閥。
6.ー種從骨髄或臍帶血制備干細(xì)胞組合物的方法，其包括: a.將收集的骨髄或臍帶血放置到處理袋內(nèi)，其中所述處理袋是袋組的部分，所述袋組還包括紅細(xì)胞濃縮袋、干細(xì)胞袋和計(jì)量閥，并且進(jìn)ー步地，其中所述計(jì)量閥與所述處理袋、所述紅細(xì)胞濃縮袋和所述干細(xì)胞袋連接； b.將所述袋組放置到處理設(shè)備內(nèi)，其中所述處理設(shè)備包括微控制器、伺服電動(dòng)機(jī)、光學(xué)傳感器、LED、測(cè)壓儀和加速計(jì)，其中當(dāng)所述袋組包含在所述處理設(shè)備中時(shí)，所述伺服電動(dòng)機(jī)與所述計(jì)量閥可操作地偶聯(lián)； c.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時(shí)間離心，以使所述處理袋中的所述骨髓或臍帶血細(xì)胞分為紅細(xì)胞層、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及血漿層，其中所述計(jì)量閥關(guān)閉； d.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以低于所述分層步驟中使用的g力的g力和足夠的時(shí)間離心，以使大多數(shù)所述紅細(xì)胞從所述處理袋分離到所述紅細(xì)胞濃縮袋內(nèi)，其中所述計(jì)量閥從所述處理袋打開(kāi)到所述紅細(xì)胞濃縮袋； e.促使所述計(jì)量閥響應(yīng)所述光學(xué)傳感器檢測(cè)來(lái)自所述LED的預(yù)定量透光率而關(guān)閉； f.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時(shí)間離心，以使更多所述紅細(xì)胞從所述處理袋分離到所述紅細(xì)胞濃縮袋內(nèi)，其中所述計(jì)量閥接連打開(kāi)且關(guān)閉多次； g.促使所述計(jì)量閥響應(yīng)所述光學(xué)傳感器檢測(cè)透光率的預(yù)設(shè)變化速率而關(guān)閉； h.使所述干細(xì)胞袋校準(zhǔn)為零，其中所述校準(zhǔn)使用來(lái)自所述測(cè)壓儀的數(shù)據(jù)來(lái)執(zhí)行； .使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時(shí)間離心，以使剩余紅細(xì)胞、所述WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些所述血漿從所述處理袋分離到所述干細(xì)胞袋內(nèi)，其中所述計(jì)量閥接連打開(kāi)且關(guān)閉多次； j.促使所述計(jì)量閥響應(yīng)所述測(cè)壓儀測(cè)量所述干細(xì)胞袋的預(yù)設(shè)重量而關(guān)閉； k.從所述處理單元中取出所述袋組；和 .從所述袋組中取出包含所述干細(xì)胞組合物的所述干細(xì)胞袋。
7.權(quán)利要求6的方法，其在步驟(e)和(f)之間進(jìn)一歩包括，使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時(shí)間離心，以使所述處理袋中的所述骨髓或臍帶血細(xì)胞再次分為紅細(xì)胞層、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及血漿層，其中所述計(jì)量閥關(guān)閉。
8.權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)ー步包括預(yù)先選擇所述干細(xì)胞組合物的體積。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述選擇的體積通過(guò)選擇所述干細(xì)胞袋中所述干細(xì)胞組合物的重量進(jìn)行測(cè)定。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述收集骨髓的體積是約40mL-約240mL。
【文檔編號(hào)】C12M1/36GK103555559SQ201310484895
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2007年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2007年3月28日
【發(fā)明者】P.H.科埃略, B.A.貝克, J.R.查普曼, 李俊之, R.S.蔡爾德斯, P.埃曼努埃爾 申請(qǐng)人:熱起源公司