自然殺傷(NK)細胞是先天免疫系統(tǒng)的基礎組分。它們能夠識別和破壞腫瘤細胞以及被病毒或細菌感染的細胞(Lanier LL，2008；Nat Immunol 9:495-502)。過去二十年來對NK細胞受體和其配體的鑒定和表征已經(jīng)讓人進一步了解NK細胞被腫瘤細胞激活的分子機制。抑制性受體的發(fā)現(xiàn)支持了Karre提出的“喪失自我(Missing self)”假說，其先鋒性工作指出NK細胞殺死缺乏主要組織相容性復合物(MHC)I類分子的腫瘤細胞。抑制性受體識別MHC I類分子，而激活受體識別各種配體(P.A.Mathew，J Cell Sci Ther，第3卷，第7期)。

NK細胞負責移植物抗白血病(GvL)效應，具有最小GvH(移植物抗宿主)和HvG(宿主抗移植物)效應，關注涉及NK細胞的免疫療法的開發(fā)。來自數(shù)個實驗室的數(shù)據(jù)表明，開發(fā)NK細胞同種異體反應性能夠具有與NK細胞源無關的很大益處。錯配的移植物觸發(fā)由NK細胞介導的同種異體反應性，其基于“喪失自我識別”。供體抗受體NK細胞同種異體反應性產(chǎn)生在對于HLA-C等位基因組(HLA-Bw4組和/或HLA-A3/11)而言錯配的個體之間。KIR配體錯配是NK細胞同種異體反應性的前提，因為在移植物抗宿主方向不是KIR配體錯配的20個供體-受體對中，未發(fā)現(xiàn)供體同種異體反應性NK集落。

NK細胞的另一興趣點是即使NK也識別主要具有其抑制性受體的自體-身份分子(HLA分子)，它們通過激活信號和抑制信號的復雜平衡而激活，并且需要僅由感染的異常細胞或腫瘤細胞所表達激活信號來殺死所述細胞。然后供體選擇更容易，因為單獨使用NK細胞，供體和患者不需要十分確切地表達相同的主要HLA等位基因(例如對于全臍帶血(UCB)移植而言，HLA匹配>4/6)。與之相反，當接收者不表達相應的HLA(無抑制性信號＝iKIR-HLA錯配)時，表達抑制性受體的NK導致更好的腫瘤殺死而不引起GvHD。

即使NK細胞具有天然細胞毒性潛力，其細胞毒性活性可以通過不同的激活機制在體外改善，大多數(shù)這些機制也能夠擴增(amplify)NK細胞(以各種擴增因子)，產(chǎn)生更具治療性的細胞，更有效。

發(fā)現(xiàn)擴增/激活NK細胞的良好途徑對于改善這些細胞的治療潛力(數(shù)量和功效)是重要的。

體外激活程序包括使用細胞因子和生長因子(例如IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、SCF、Flt3-L(...))，例如與輔助細胞或不與輔助細胞一起使用，所述輔助細胞例如外周血單核細胞、腫瘤細胞或細胞系(參見M.Villalba Gonzales等，WO2009/141729)。使用呈現(xiàn)特定iKIR-HLA錯配(4個主要iKIR-HLA錯配：HLA A3/A11；HLA Bw4；HLA C1；HLA C2和相關iKIR受體)的輔助細胞。

臍帶血(UCB)已經(jīng)顯示為NK的良好來源，具有更高的NK細胞百分比和良好的體內(nèi)擴增/激活(參見M.Villalba Gonzales等，WO2012/146702)。

但是，雖然可能以良好的擴增速率擴增和激活在一個UCB單位中含有的NK細胞，但是期望提供用于臨床療法、可獲得的、純的、具有高擴增速率或激活狀態(tài)并展示NK細胞的細胞毒性活性的細胞產(chǎn)物，特別是NK細胞產(chǎn)物。

另外，會期望所述方法允許在同一批次(生產(chǎn)批次)中生產(chǎn)預期治療至少大于1名、優(yōu)選50名、更優(yōu)選約100名患者的大量細胞，特別是激活的NK細胞，以及需要顯示盡可能低可變性的治療劑。

為此，會期望提供賦予在通過細胞制造工藝同一生產(chǎn)批次獲得大量特定的富集細胞群的能力的方法，所述細胞制造工藝符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(cGMP)、商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)以及管理機構的化學、制造以及控制標準。

這是本發(fā)明的目標。

申請人首次以令人驚奇的方式成功地從不同供體擴增和富集NK細胞。

根據(jù)第一實施方式，本發(fā)明涉及生產(chǎn)細胞群的方法，所述方法包括下述步驟：

(a)提供至少n個臍帶血單位(UCB單位)，或其含有所述細胞的組分，n≥2，優(yōu)選2<n≤100；和

(b)匯集所述至少n個UCB單位，或其含有所述細胞的組分，以生產(chǎn)所述細胞群。

在更優(yōu)選的實施方式中，3≤n≤50，最優(yōu)選3≤n≤25。

在本發(fā)明的背景下，“含有所述細胞的UCB單位的組分”是指含有至少期望生產(chǎn)的細胞群或者所述群的一部分的UCB單位的組分。

在優(yōu)選方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述方法還包括下述步驟：

(c)使步驟(b)中獲得的匯集物中含有的T細胞耗盡。

根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述方法包括下述步驟：在步驟(b)匯集之前使n個UCB單位的每一個中含有的T細胞耗盡。

本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，對于主要HLA I類組的基因型而言在步驟b)中匯集的n個UCB單位呈現(xiàn)相同的模式。

在本說明書中，“對于主要HLA I類組的基因型而言呈現(xiàn)相同模式”是指其HLA分子的組被相同的抑制性KIR識別、并且優(yōu)選其中存在于匯集的n個UCB中的各HLA組被NK細胞通過相同的主要抑制性KIR識別的UCB單位。

在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中存在于匯集的n個UCB中的各UCB屬于被相同抑制性KIR識別的HLA組。

如本文所用，術語“KIR”或“抑制性KIR”具有本領域中的通常含義，并且包括但不限于KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2。

主/主要抑制性KIR是KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2。

KIR2DL1識別HLA-C w4以及相關的“組2”等位基因。KIR2DL2和KIR2DL3識別HLA-Cw3以及相關的“組1”等位基因。KIR3DL1是具有Bw4基序的HLA-B同種異型(allotype)的受體。最后，KIR3DL2是HLA-A3/11的受體。

在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述主要HLA I類組選自由下述組成的組：被KIR3DL2識別的HLA A3/A11，被KIR3DL1識別的HLA Bw4，被KIR2DL2/3識別的HLA C組1，和被KIR2DL1識別的HLA C組2。

UCB單位優(yōu)選來源是人UCB單位。

在特別優(yōu)選的實施方式中，所述來源是冷凍人UCB的來源。

在另一方面，本發(fā)明還提供從n個UCB單位中含有的細胞生產(chǎn)細胞的擴增群的方法，所述方法包括下述步驟：

(A)通過根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)細胞群的方法，從至少n個UCB單位或其含有所述細胞的組分生產(chǎn)細胞群，可選的是在步驟A)之前各UCB單位已經(jīng)對所述細胞進行初步地且分開地擴增；和

(B)在合適的培養(yǎng)基中擴增獲自從步驟(A)獲得的細胞群中獲得的所需細胞，以產(chǎn)生所述的所需細胞的擴增群。

在本發(fā)明的從n個UCB單位中含有的細胞生產(chǎn)細胞的擴增群的方法中，在步驟A)中的匯集步驟b)之前各UCB單位已經(jīng)對所述細胞進行初步地且分開地擴增的情況下，步驟(B)可以是可選步驟。

在另一優(yōu)選方面，本發(fā)明還提供從n個UCB單位中含有的所需細胞生產(chǎn)分化細胞群的方法，所述方法包括下述步驟：

(A)通過根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)細胞群的方法，從所述n個UCB單位或其含有所述所需細胞的組分生產(chǎn)細胞群，可選的是在步驟A)之前各UCB單位已經(jīng)對所述細胞進行初步單獨地分化；和

(B)在合適的培養(yǎng)基中使獲自之前步驟的所需細胞分化，以生產(chǎn)所述的分化細胞群。

在本發(fā)明的從n個UCB單位中含有的細胞生產(chǎn)分化細胞群的方法中，在步驟A)中的匯集步驟b)之前各UCB單位已經(jīng)對所述細胞進行初步單獨地分化的情況下，分化步驟(B)可以是可選步驟。

在另一優(yōu)選方面，本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)含有激活的自然殺傷(NK)細胞的細胞群的方法，所述方法包括：

(A)通過根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)細胞群的方法，從至少n個UCB單位或其含有所述NK細胞的組分生產(chǎn)含有激活的NK細胞的細胞群，可選的是在步驟A)之前各UCB單位已經(jīng)對所述NK細胞進行初步地且分開地擴增；

(B)在合適的培養(yǎng)基中激活從步驟(A)獲得的所述NK細胞，以生產(chǎn)含有激活的NK細胞的所述細胞群；

C)可選的是，從所述群回收所述激活的NK細胞。

在另一優(yōu)選方面，本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)擴增的激活的NK細胞群的方法，所述方法包括：

(A)通過根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)細胞群的方法，從至少n個UCB單位或其含有所述NK細胞的組分生產(chǎn)含有NK細胞的細胞群，可選的是在步驟A)之前各個UCB單位已經(jīng)對所述NK細胞進行初步地且分開地擴增和激活；

(B)在合適的培養(yǎng)基中擴增和激活從步驟(A)獲得的所述NK細胞，以生產(chǎn)所述擴增的激活的NK細胞群；和

(C)可選的是，回收所述擴增的激活的NK細胞。

本發(fā)明還包括一種從n個UCB單位生產(chǎn)擴增且可選地激活的NK細胞群的方法，所述方法包括下述步驟：

i)提供至少n個UCB單位，或其含有NK細胞的組分，n≥2，優(yōu)選2<n≤100或3≤n≤50，更優(yōu)選3≤n≤25，其中所述至少n個UCB單位對于主要HLA I類組的基因型呈現(xiàn)相同模式，優(yōu)選的是其中在匯集的n個UCB中呈現(xiàn)的各HLA組被NK細胞通過相同的主要抑制性KIR識別；

ii)可選地使各UCB單位進行紅細胞/紅血球耗盡，優(yōu)選通過密度梯度分離，更優(yōu)選通過Ficoll-密度梯度分離，通過Hetastarch(羥乙基淀粉；HES)法，通過使用CB裝置或者通過冷凍解凍步驟進行；

iii)可選地，將在步驟i)或ii)中獲得的細胞群冷凍，保存在液氮中，并在步驟iv)之前解凍；

iv)使各UCB單位中含有的T細胞耗盡；

v)對于在之前步驟中獲得的各個UCB單位，分開地擴增并可選的是通過在合適的培養(yǎng)基中使一個UCB單位或其含有NK細胞的組分中含有的NK細胞接觸而激活在所述UCB單位中含有的NK細胞，從而生產(chǎn)所述擴增群，可選的是，激活各UCB單位的NK細胞，優(yōu)選的是在3～28天期間激活各UCB單位的NK細胞；和；

vi)匯集在之前步驟UCB單位或其含有NK細胞的組分中獲得的n個UCB單位細胞，以生產(chǎn)匯集的擴增且可選激活的NK細胞群。

本發(fā)明還包括一種從n個UCB單位生產(chǎn)擴增且可選地激活的NK細胞群的方法，所述方法包括下述步驟：

i)提供至少n個UCB單位，或其含有NK細胞的組分，n≥2，優(yōu)選2<n≤100或3≤n≤50，更優(yōu)選3≤n≤25，其中所述至少n個UCB單位對于主要HLA I類組的基因型呈現(xiàn)相同模式，優(yōu)選的是其中在匯集的n個UCB中呈現(xiàn)的各HLA組被NK細胞通過相同的主要抑制性KIR識別；

ii)可選地使各UCB單位進行紅細胞/紅血球耗盡，優(yōu)選通過密度梯度分離，更優(yōu)選通過Ficoll-密度梯度分離(Ficoll-Paque型)，通過Hetastarch(羥乙基淀粉；HES)法，通過使用CB裝置或者通過冷凍解凍步驟進行；

iii)可選地，將在步驟i)或ii)中獲得的細胞群冷凍，保存在液氮中，并在步驟iv)之前解凍；

iv)對于在之前步驟中獲得的各個UCB單位，分開地擴增并可選的是通過在合適的培養(yǎng)基中使一個UCB單位或其含有NK細胞的組分中含有的NK細胞接觸而激活在所述UCB單位中含有的NK細胞，從而生產(chǎn)所述擴增群，可選的是，激活各UCB單位的NK細胞，優(yōu)選的是在3～28天期間激活各UCB單位的NK細胞；

v)匯集在之前步驟中從UCB單位或其含有NK細胞的組分中獲得的n個UCB單位細胞，以生產(chǎn)匯集的擴增且可選激活的NK細胞群；和

vi)可選地，使在步驟v)后獲得的匯集的NK細胞中含有的T細胞耗盡。

在優(yōu)選實施方式中，使在步驟v)后獲得的匯集的NK細胞中含有的T細胞耗盡的步驟vi)不是可選步驟，而是所要求保護方法的一部分。

在另一優(yōu)選實施方式中，使在步驟v)后獲得的匯集的NK細胞中含有的T細胞耗盡的步驟vi)，之后是選擇展示CD56+生物標記的NK細胞的步驟，無論在該工序的最后是否仍然需要消除殘留的非激活NK細胞。

本發(fā)明還包括一種從n個UCB單位生產(chǎn)擴增且可選地激活的NK細胞群的方法，所述方法包括下述步驟：

i)提供至少n個UCB單位，或其含有NK細胞的組分，n≥2，優(yōu)選2<n≤100或3≤n≤50，更優(yōu)選3≤n≤25，其中所述至少n個UCB單位對于主要HLA I類組的基因型呈現(xiàn)相同模式，優(yōu)選的是其中在匯集的n個UCB中呈現(xiàn)的各HLA組被NK細胞通過相同的主要抑制性KIR識別；

ii)可選地使各UCB單位進行紅細胞/紅血球耗盡，優(yōu)選通過密度梯度分離，更優(yōu)選通過Ficoll-密度梯度分離，通過Hetastarch(羥乙基淀粉；HES)法，通過使用CB裝置或者通過冷凍解凍步驟進行；

iii)可選地，將在步驟i)或ii)中獲得的細胞群冷凍，保存在液氮中，并在步驟iv)之前解凍；

iv)可選地，或優(yōu)選地，使各UCB單位中含有的T細胞耗盡；

iv)匯集在之前步驟UCB單位或其含有NK細胞的組分中獲得的n個UCB單位細胞，以生產(chǎn)匯集的NK細胞群；和

vi)通過在合適的培養(yǎng)基中使所述匯集物中含有的NK細胞或其含有NK細胞的組分接觸而擴增并可選地激活在之前步驟中獲得的匯集的NK細胞，從而生產(chǎn)所述匯集的擴增且可選地激活的NK細胞群，優(yōu)選的是在1～5周的持續(xù)時間進行所述擴增和激活，優(yōu)選地是在9～28天的總持續(xù)時間里，擴增步驟后NK細胞的擴增因子對于擴增/激活步驟而言為至少100，優(yōu)選200、300或500。

本發(fā)明還包括一種從n個UCB單位生產(chǎn)擴增且可選地激活的NK細胞群的方法，所述方法包括下述步驟：

i)提供至少n個UCB單位，或其含有NK細胞的組分，n≥2，優(yōu)選2<n≤100或3≤n≤50，更優(yōu)選3≤n≤25，其中所述至少n個UCB單位對于主要HLA I類組的基因型呈現(xiàn)相同模式，優(yōu)選的是其中在匯集的n個UCB中呈現(xiàn)的各HLA組被NK細胞通過相同的主要抑制性KIR識別；

ii)可選地使各UCB單位進行紅細胞/紅血球耗盡，優(yōu)選通過密度梯度分離，更優(yōu)選通過Ficoll-密度梯度分離，通過Hetastarch(羥乙基淀粉；HES)法，通過使用CB裝置或者通過冷凍解凍步驟進行；

iii)可選地，將在步驟i)或ii)中獲得的細胞群冷凍，保存在液氮中，并在步驟iv)之前解凍；

iv)匯集在之前步驟UCB單位或其含有NK細胞的組分中獲得的n個UCB單位細胞，以生產(chǎn)匯集的NK細胞群；

v)可選地，或優(yōu)選地，使在步驟iv后獲得的匯集的NK細胞中含有的T細胞耗盡；和

vi)通過在合適的培養(yǎng)基中使所述匯集物中含有的NK細胞或其含有NK細胞的組分接觸而擴增并可選地激活在之前步驟中獲得的匯集的NK細胞，從而生產(chǎn)所述匯集的擴增且可選地激活的NK細胞群(優(yōu)選的是，在1～5周的持續(xù)時間)，優(yōu)選地是在9～28天的總持續(xù)時間，擴增步驟后NK細胞的擴增因子對于擴增/激活步驟而言為至少100，優(yōu)選200、300或500。

根據(jù)本發(fā)明的所有方法和與生產(chǎn)激活/擴增的NK細胞相關的所有方法特別適合用于從匯集的UCB單位制備激活的NK細胞，所述匯集的UCB單位具有以下KIR的錯誤表達：KIR2DL2和KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1和KIR3DL2。因此，在該情況下，根據(jù)本發(fā)明如上制備的激活/擴增的匯集的NK細胞對來自缺乏相應KIR的其它個體的細胞具有同種異體反應性，相反的是其耐受來自具有相同KIR配體的另一個體的細胞。

因此，通過本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)至少2個不同生產(chǎn)批次、優(yōu)選3個批次，更優(yōu)選4個批次的通過本發(fā)明的用于生產(chǎn)NK細胞的方法能夠獲得的匯集的激活/擴增的NK細胞的集合體或治療細胞庫，或者所述生產(chǎn)批次的至少2、3或4種組分的集合體，并且其中各個生產(chǎn)批次展示一種主要抑制性KIR的不同錯誤表達，所述主要抑制性KIR優(yōu)選選自KIR2DL2和KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1和KIR3DL2抑制性KIR的組。

此類至少2個不同生產(chǎn)批次、優(yōu)選3個批次，更優(yōu)選4個批次的通過本發(fā)明的用于生產(chǎn)匯集/擴增的NK細胞的方法能夠獲得的匯集的激活/擴增的NK細胞的集合體包含在本發(fā)明中。

在優(yōu)選實施方式中，所述集合體是儲存容器的集合體(collection)，其含有至少2、3或4個容器，每個容器含有匯集的激活/擴增的NK細胞，或其組分，其通過本發(fā)明的用于生產(chǎn)NK細胞的方法能夠獲得，并且展現(xiàn)一種主要抑制性KIR的特定錯誤表達。

根據(jù)本發(fā)明，所要求保護的集合體的治療一個患者所需的量的一個生產(chǎn)批次，或其組分可用于移植在有需要的患者中，優(yōu)選展示不表達特定主要KIR配體的靶細胞的患者，所述配體被將移植的匯集的激活/擴增的NK細胞生產(chǎn)批次識別。

可以通過任何公知的標準方法進行UCB/NK細胞或患者靶細胞的HLA/KIR基因分型/表型分型。

在優(yōu)選實施方式中，適合擴增和激活所述NK細胞的所述合適的培養(yǎng)基包含輔助細胞和/或至少一種合適的NK激活因子。

在優(yōu)選實施方式中，所述輔助細胞選自下述組：

-哺乳動物細胞，優(yōu)選人細胞，更優(yōu)選來自細胞的HLA型集合體(HLA-typed collection of cells)的細胞，并且可選的是，經(jīng)照射的細胞，特別是經(jīng)γ射線、X射線或紫外線照射的細胞，優(yōu)選經(jīng)γ射線照射的細胞；

-轉化的哺乳動物細胞，優(yōu)選人細胞，其中在所述細胞中，編碼殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)配體的一個基因的表達已經(jīng)被抑制。

在優(yōu)選實施方式中，來自細胞的HLA型集合體的細胞來自PLH細胞系，優(yōu)選選自ECACC N°.88052047，IHW 9047號和HOM-2，ID n°HC107505，IHW 9005號的組。

在優(yōu)選實施方式中，所述輔助細胞是轉化哺乳動物細胞，所述細胞中編碼KIR配體的一個基因的表達已經(jīng)被抑制并且還包括抑制或減少MHC-I表達和/或抑制ERK5基因的表達。制備此類輔助細胞的方法是本領域技術人員公知的(參見WO2012/146702，2012年11月1日公開，此處通過援引并入本文)。

可以通過本領域公知的任何方法進行所述輔助細胞中MHC-I表達的抑制或減少。例如，在國際專利申請公開WO2009141729A2中例舉了所述方法。通常而言，通過使用β-2-微球蛋白基因表達的抑制劑進行MHC-I表達的所述抑制或減少。

如上所述，所述輔助細胞會呈現(xiàn)陰性ERK5表型。術語“呈現(xiàn)陰性ERK5表型的細胞”是指在細胞中存在的ERK5蛋白的表達水平或量(特別是線粒體中)與其表達水平相比，減少至少10％，優(yōu)選25％～90％，例如25％～50％或50％～75％的細胞，

可以通過本領域公知的任何方法進行所述細胞中ERK5基因表達的抑制或減少。例如，在國際專利申請公開WO2009141729A2中例舉了所述方法。通常而言，通過使用ER 5基因表達的抑制劑進行基因ER 5表達的所述抑制或減少。

在優(yōu)選實施方式中，所述輔助細胞已經(jīng)永生化，優(yōu)選通過愛潑斯坦-巴爾(Epstein Barr)病毒(EBV)轉化來永生化。

結果，所述輔助細胞會組成在培養(yǎng)物中無限期地增殖的細胞系。使細胞永生化的方法是本領域公知的，特別是使用用于將人淋巴細胞永生化的“愛潑斯坦-巴爾病毒”(“EBV”)方法。

在優(yōu)選實施方式中，所述合適的培養(yǎng)基作為合適的NK激活因子包含白介素-2(IL-2)、IL-7和/或IL-12和/或IL-15，或具有α-干擾素或β-干擾素，優(yōu)選人重組激活因子。

當不使用輔助細胞來激活NK細胞時，可以使用以下可能的含有NK細胞激活因子的培養(yǎng)基進行所述激活：

1/IL-2 5ng/ml+/-抗-CD3 50ng/ml+IL-7 10ng/ml+IL-12 10ng/ml，優(yōu)選7天后；

2/hIL-15 30ng/ml+hIL-21 30ng/ml(PeproTech)+氫化可的松10^-6M>CD34+，培養(yǎng)21天，因此對于成熟/激活NK細胞而言培養(yǎng)21天；

3/IL-2 500U/ml+珠CD335(NKp46)和CD2；

4/細胞因子混合物IL-7、SCF、IL-2、IL-15(高濃度)和GM-CSF、G-CSF、IL-6(低濃度)，用于NK細胞擴增，從D14～D42，在生物反應器中，從CD34+擴增；D0-9＝低分子肝素+細胞因子混合物(高濃度)SCF、Flt3L、TPO、IL-7和(低濃度)GM-CSF，G-CSF、IL-6(CD34+擴增)；J9-14＝低分子肝素+細胞因子混合物(強濃度)SCF、Flt3L、IL-15、IL-7和GM-CSF、G-CSF，IL-6(低濃度，NK分化)。

(也可以使用IL-18和IFNα)。

-在輔助細胞存在下的激活和擴增：

1/IL-2 500U/ml+自體同源/同種異體的經(jīng)照射喂養(yǎng)PBMC(25Gy)或EBV-LCL(100Gy)，D0時喂養(yǎng)細胞的比率：NK 20：1(或10：1，對于UCB單位放大(scale-up))

2/IL-2 200U/ml+絲裂霉素處理的喂養(yǎng)物(feeder)(PBMC+K562，比例1：1)比例喂養(yǎng)細胞：NK 8:1

3/D0時IL-2 500U/ml+同種異體的經(jīng)照射喂養(yǎng)物PBMC(5 000rad)，和(abd)在喂養(yǎng)基中或者與喂養(yǎng)細胞預溫育的D7比率喂養(yǎng)細胞：總10:1+OKT3(抗-CD3)30ng/ml

4/IL-2 500U/ml+經(jīng)照射喂養(yǎng)物Jurkat-KLl(300Gy)，在D0

5/IL-2 500U/ml+自體同源的經(jīng)照射喂養(yǎng)物PBMC(2000rad，+OKT3 10ng/ml，在開始刺激時喂養(yǎng)細胞的T淋巴細胞(未照射組分中(din)耗盡)，比率喂養(yǎng)細胞：NK 5：1 J0

6/IL-2+IL-15+喂養(yǎng)物經(jīng)照射喂養(yǎng)物K562-mb15-41BBL(100Gy)

在另一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中，使T細胞耗盡的步驟通過包含下述步驟的方法進行：

-使細胞與耗盡抗體(depleting antibody)接觸；和

-通過所述耗盡抗體檢測來除去所述細胞。

耗盡抗體優(yōu)選至少是選自由抗-CD3、抗-CD 14和抗-CD 20組成的組的抗體，優(yōu)選抗-CD3抗體。

在獲得的耗盡細胞群中，小于0.5％，或甚至小于0.1％或甚至小于0.001％是CD3陽性細胞。

在另一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中，各UCB單位或匯集的n個UCB單位是紅細胞/紅血球耗盡的(red cell-/erythrocytes depleted)，優(yōu)選通過密度梯度分離，更優(yōu)選通過Ficoll-密度梯度分離，通過Hetastarch(羥乙基淀粉；HES)法，通過使用CB裝置或者通過冷凍解凍步驟進行。

在另一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中，各UCB單位或匯集的n個UCB單位通過包括將紅細胞裂解的方法，特別是通過包括將在各UCB單位或在n個UCB單位的匯集細胞中的細胞冷凍和解凍的步驟的方法而將紅細胞耗盡。

在另一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中，用于步驟b)或用于步驟i)的UCB單位是來自冷凍儲存的UCB單位的解凍UCB單位。

在另一優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的方法中，用于步驟b)或用于步驟i)的UCB單位是來自冷凍儲存的UCB單位的解凍UCB單位。

將在所述方法最后獲得的所述匯集的UCB單位，或含有細胞的其組分優(yōu)選儲存在低于-70℃，優(yōu)選低于-80℃的溫度下，更優(yōu)選儲存于液氮中。

在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法，其中：

-在使用前將各UCB單位初步稀釋在合適的培養(yǎng)基中，優(yōu)選稀釋在RPMI培養(yǎng)基中；和/或

-在將各UCB單位中或匯集的n個UCB單位中的紅細胞/紅血球耗盡后，將收集的細胞再懸浮于合適的培養(yǎng)基中，優(yōu)選再懸浮于RMPI培養(yǎng)基中，或者再懸浮于培養(yǎng)基型X-VIVO^TM(Lonza)、AIM-V^TM培養(yǎng)基(Invitrogen)或CellGro^TM(CellGenix)中，該培養(yǎng)基可選地含有AB陰性胎牛血清(FBS)；和/或

-如果將來自各紅細胞耗盡的UCB單位或來自匯集的紅細胞耗盡的UCB單位的收集細胞冷凍儲存，則將收集細胞再懸浮于包含白細胞冷凍保護劑的合適培養(yǎng)物中。

更優(yōu)選的是，用于NK細胞擴增/激活的合適培養(yǎng)基中存在的NK細胞和輔助細胞的比例為0.01～2，優(yōu)選0.05～1.0，更優(yōu)選0.1～0.5。

更優(yōu)選的是，用于NK細胞擴增/激活的合適培養(yǎng)基中存在的輔助細胞與待擴增/激活的NK細胞是HLA-KIR錯配的。

根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的匯集的、激活的和/或擴增的NK細胞的方法，其中所述方法還包括CD56+NK細胞富集的步驟。

根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，本發(fā)明涉及用于從UCB單位生產(chǎn)擴增的、可選激活的NK細胞群的至少兩種不同匯集物的方法，其中被各匯集的n個UCB的NK細胞識別的主要HLA I類組是不同的，并且來自n個UCB單位的擴增的、可選激活的NK細胞群的各匯集物通過根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)匯集的激活的和/或擴增的NK細胞的方法生產(chǎn)。

更具體而言，本發(fā)明涉及用于從根據(jù)本發(fā)明的UCB單位生產(chǎn)擴增的、可選激活的NK細胞群的至少2、3優(yōu)選4種不同匯集物的方法，其中被各匯集的n個UCB的NK細胞識別的主要HLA I類組是不同的，并且選自由下述組成的組：被KIR3DL2識別的HLA A3/A11，被KIR3DL1識別的HLA Bw4，被KIR2DL2/3識別的HLA C組1，和被KIR2DL2識別的HLA C組2。

根據(jù)另一實施方式，本專利申請的發(fā)明涉及下述細胞群：

-通過本發(fā)明的方法獲得的細胞群，或

-通過本發(fā)明的方法能夠獲得的細胞群，并且其中所述“能夠獲得”的細胞群含有源自至少n個UCB單位的細胞，優(yōu)選NK細胞，或者其含有NK細胞的組分，n≥2，優(yōu)選2<n≤100或3≤n≤50，更優(yōu)選3≤n≤25，并且優(yōu)選的是，其中對于主要HLAI類組的基因型而言所述n個UCB單位還呈現(xiàn)相同模式，優(yōu)選其中被各匯集的n個UCB的NK細胞識別的主要HLA I類組是不同的，并且選自由下述組成的組：被KIR3DL2識別的HLA A3/A11，被KIR3DL1識別的HLA Bw4，被KIR2DL2/3識別的HLA C組1，和被KIR2DL2識別的HLA C組2。

更優(yōu)選的是，可根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的所述細胞群還對于各匯集的n個UCB而言展示KIR之一的錯誤表達，所述KIR選自KIR2DL2和KIR2DL3、KIR2DL1、KIR3DL1和KIR3DL2的組。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得，或通過根據(jù)本發(fā)明的方法能夠獲得的匯集的和激活的和/或擴增的細胞群，特別是NK細胞群的組合物。

本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得，或根據(jù)本發(fā)明的方法能夠獲得的匯集的和激活的和/或擴增的細胞群，特別是NK細胞群的藥物組合物，其用作藥物。

本發(fā)明還涉及還包含藥學上可接受的載體的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

在本說明書中，“藥學上可接受的載體”是指成為藥物組合物的一部分的化合物或者化合物的組合，其不引起二次反應并且例如促進活性化合物的施用、增加其體內(nèi)壽命和/或功效、增加其在溶液中的穩(wěn)定性或者改善其保存。所述藥學上可接受的載體是本領域公知的，并且會被本領域技術人員根據(jù)選擇的活性化合物的性質和施用模式來采用。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于哺乳動物細胞、優(yōu)選用于人細胞的儲存容器的集合體，其中各個所述儲存容器含有生產(chǎn)批次的細胞群的組分，所述細胞群通過根據(jù)本發(fā)明的方法能夠獲得或者獲得。

優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的用于哺乳動物細胞的儲存容器的集合體含有擴增和/或激活的NK細胞。

優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的用于哺乳動物細胞的儲存容器的集合體或所述根據(jù)本發(fā)明的所述組合物含有至少10⁷，優(yōu)選2～10×10⁷或10～100×10⁷個激活和/或擴增的NK細胞，這取決于待治療患者的重量。

優(yōu)選的是，每一個根據(jù)本發(fā)明的所述儲存容器集合體，或所述根據(jù)本發(fā)明的所述組合物含有NK細胞，并基本上不含CD3+T細胞，優(yōu)選小于0.1％或小于0.01％。

優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的用于哺乳動物細胞的儲存容器的集合體或根據(jù)本發(fā)明的所述組合物含有：

-至少75％，優(yōu)選大于85％或90％的展示標志物CD56+的NK細胞；和/或

-至少75％，優(yōu)選大于80％的展示CD45RAdim的NK細胞。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的儲存容器的集合體的儲存容器，或者根據(jù)本發(fā)明的所述組合物，其用于抑制腫瘤細胞的增殖，優(yōu)選用于預防和/或治療癌或用于治療感染。

在優(yōu)選實施方式中，所述腫瘤細胞或待治療的癌選自下述組：血液病惡性腫瘤細胞，實體瘤細胞或癌細胞、優(yōu)選白血病細胞，急性T細胞白血病細胞，慢性粒細胞性淋巴瘤(CML)細胞，急性骨髓性白血病細胞，慢性粒細胞性白血病(CML)細胞，多發(fā)性骨髓瘤細胞，或肺、結腸、前列腺、成膠質細胞瘤癌癥。

根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明制備的匯集的激活的和/或擴增的NK細胞，或者根據(jù)本發(fā)明的所述組合物還可用于治療感染病或免疫異常/自體免疫疾病。

在優(yōu)選實施方式中，將根據(jù)本發(fā)明的儲存容器或組合物中含有的細胞根據(jù)待治療的疾病/病理學通過系統(tǒng)性或局部途徑施用于至受試對象。優(yōu)選的是，所述化合物可通過肌內(nèi)、皮內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下途徑，或通過口服途徑而系統(tǒng)性地施用。還可以以數(shù)個劑量、隨著時間推移而分散地施用根據(jù)本發(fā)明的包含抗體的組合物。

最佳的施用模式、給藥方案和藥物制劑形式可以根據(jù)建立適于患者的治療時通常考慮的標準而確定，例如患者的年齡或重量，患者總體健康的嚴重性、對治療的耐受性和關注的副作用。

通過以下附圖和實施例而進一步說明本發(fā)明。但是，這些實施例和附圖不應以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明：

圖1-1～1-3(圖1的子圖1、2和3)是說明本發(fā)明的制造過程的實例的示意圖。

圖2和3說明在CD3耗盡后或者未經(jīng)CD3耗盡的情況下獲得的NK增殖。

圖4說明從匯集的CD3耗盡的UCB單位獲得的NK增殖。

圖5說明從5個匯集的CD3耗盡的UCB單位獲得的NK增殖。

圖6說明在從之前未經(jīng)CD3耗盡的匯集的UCB單位獲得的NK增殖。

圖7說明在用CD3未耗盡的UCB培養(yǎng)9天后從匯集的UCB單位獲得的NK增殖。

圖8說明利用2個KIR-HLA匹配的UCB獲得并且用PLH輔助細胞擴增的NK增殖擴增因子。

圖9說明用2個KIR-HLA錯配和匹配的UCB獲得并且用PLH輔助細胞擴增的NK增殖擴增因子。

實施例1：材料和方法

A)細胞：

PLH(實施例4)：無HLA-C1，ECACC庫n°88052047，IHW 9047號

該細胞系通過來自斯堪的納維亞婦女的B淋巴細胞的EBV永生化而獲得。該細胞是完全HLA基因分型，并且對于表達來自C組2的HLA Class I等位基因(A3/A11和Bw4型)具有特異性，但是對于來自C組1的不具有特異性(完整信息在IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫)。

該細胞系用作NK擴增/激活程序的輔助細胞，因為其允許選擇輔助細胞和UCB(表達HLA C組1，和潛在的相關抑制性受體KIR2DL2/3)之間的特定HLA錯配。由于一些病毒誘導的用于NK激活受體的配體的膜表達，通過EBV感染進行轉化增加了其NK激活能力。

HOM-2(實施例4):無HLA-C2，ID n°HC107505，IHW 9005號

該細胞系通過來自加拿大/北美婦女的B淋巴細胞的EBV永生化而獲得。該細胞是完全HLA基因分型，并且對于表達來自C組1的HLA Class I位基因(A3/A11和Bw4型)具有特異性，但是對于來自C組2的不具有特異性(完整信息在IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫)。

該細胞系用作NK擴增/激活程序的輔助細胞，因為其允許選擇輔助細胞和UCB(表達HLA C組2，和潛在的相關抑制性受體KIR2DL1)之間的特定HLA錯配。由于一些病毒誘導的用于NK激活受體的配體的膜表達，通過EBV感染進行轉化增加了其NK激活能力。

B)培養(yǎng)基、緩沖液和細胞因子：

1/用于淋巴細胞的分離的Ficoll和泛影葡胺鈉(sodium diatrizoate)的密度梯度細胞分離培養(yǎng)基：Histopaque-1077，來自Sigma Aldrich，Saint Louis，MO，USA。

2/用于計數(shù)細胞和用Muse機觀察其活力、用7AAD和熒光DNA探針標記細胞的試劑盒：計數(shù)和活力試劑盒，來自Millipore，Darmstadt，德國。

3/細胞培養(yǎng)基：RPMI 1640Glutamax，來自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，購自France distributor Thermo Fisher Scientific。

4/在細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源：胎牛血清，來自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，購自France distributor Thermo Fisher Scientific。

5/細胞冷凍用有機溶劑：二甲基亞砜，DMSO來自B.Braun，Melsungen，德國。

6/流式細胞儀標記用緩沖液：PBS，來自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，購自France distributor Thermo Fisher Scientific。

7/NK擴增/激活用細胞因子：重組人rhIL-2，來自ebioscience，San Diego，CA，USA。

8/NK擴增/激活用細胞因子：重組人rh-IL15，來自Miltenyi，Bergisch Gladbach，德國。

實施例2:制造過程實施例

過程細節(jié)：參見圖1-1～1-3

-在第一次冷凍前通過ficoll UCB單核細胞分離處理UCB

-用手動磁性耗盡試劑盒完成CD3耗盡。

-匯集的UCB對于主要HLA I類組的基因型而言呈現(xiàn)相同的模式(各HLA組被NK細胞通過主要抑制性KIR識別)：被KIR3DL2識別的HLA A3/A11；被KIR3DL1識別的HLA Bw4；被KIR2DL2/3識別的HLA C組1；和被KIR2DL1識別的HLA C組2。

-用輔助細胞激活匯集的UCB，所述輔助細胞丟失被表達的匯集UCB iKIR識別的HLA中的一種。

-將NK細胞擴增20-24天。

-所用細胞因子是IL-2(100IU/ml)和IL-15(5ng/ml)。這些濃度可以修改以獲得類似的結果。

-輔助細胞是具有特異性HLA基因型(一種主要HLA I類組丟失)的EBV用生化細胞系(表達病毒誘導激活配體的細胞)。

-輔助細胞可以用不同方式以不同的照射劑量照射(此處，主要使用20秒的紫外照射，但是最后一次實驗還使用105Gy的γ照射，其顯示更好的擴增結果)。

-經(jīng)照射的輔助細胞可以與之前的冷凍保存一起使用或不經(jīng)冷凍保存使用：新照射的細胞或作為經(jīng)照射的冷凍保存細胞(在冷凍前立即照射)。

-對于3個最后實驗，向UCB細胞添加經(jīng)照射的輔助細胞，NK：輔助細胞的比例為1：4，各自3-4天(0；4；8；12；+/-15；+/-18天)。使用1：2的比例或者總細胞：輔助細胞為1：1～1：3的比例，獲得一些結果(之前和其它未示出的結果)，添加頻率為3天～7天。該參數(shù)可以變化，仍然獲得相似的擴增/激活結果。

-在所示實驗中，在所述方法的最后不進行CD56+選擇，因為源自匯集的CD3-耗盡的UCB的NK細胞表示在方法的最后已經(jīng)超過90％的活細胞。CD56選擇步驟不是必需的，但是可能會改善NK純度，對于藥物產(chǎn)品而言是優(yōu)選的(并且可能是完全需要的)。

所述方法的一些步驟可以改變：

-在第一冷凍之前使用符合GMP的方法對UCB進行不同處理，例如Hetastarch^TM或PrepaCyte CB^TM裝置(或其它現(xiàn)有的臨床接受的方法)。

-即使目前的臨床前和臨床知識顯示iKIR-HLA錯配給出比iKIR-HLA匹配更好的結果，仍可能在本發(fā)明的情況下iKIR-HLA在臨床結果中具有不同的影響。目前，基于文獻知識的開發(fā)應該伴隨著使用NK/輔助細胞錯配和NK/患者相同的錯配的方法。如果不必要，將來的臨床前和臨床數(shù)據(jù)可能改變該參數(shù)。

-NK擴增培養(yǎng)持續(xù)時間可以優(yōu)化：14～28天。

-IL-2和IL-15濃度可以優(yōu)化。

-CD3-耗盡會利用自動的臨床可接受裝置例如cliniMACS完成。

-CD3-耗盡也可以在紅細胞消除和體積減少之后立即完成(在NK回收方面可能結果更好)。

-結果之一證明在一些未定義的情況下，CD3-耗盡對于UCB匯集的NK細胞良好的擴增/激活而言不是必需的。

-為了獲得重要量的特征在于獨特的藥學上定義的批次的激活的由多供體獲得的NK細胞，優(yōu)先的是可以在所述方法的不同時刻匯集CD3-耗盡的UCB單位：擴增培養(yǎng)之前，在擴增培養(yǎng)過程中，或在擴增培養(yǎng)的最后。

實施例3：目標

1.第一實驗

由于已知來自不同供體的T淋巴細胞會通過HLA差異識別而相互殺死，并且由于NK細胞需要激活子信號以具有細胞毒性，本發(fā)明人試圖了解是否可以匯集表達相同的主要HLA組(根據(jù)抑制性KIR對其的識別)而非相同HLA等位基因的CD3-耗盡的UCB。匯集來自3個UCB的全部的單核細胞和CD3-耗盡的單核細胞以驗證CD3-耗盡是否是必需的。

2.第二實驗

由于發(fā)明人想要生產(chǎn)4類對于各主要iKIR HLA對而言呈現(xiàn)iKIR-HLA錯配的NK細胞，發(fā)明人需要調(diào)查UCB的成功匯集是否僅歸因于之前使用的第一特定HLA基因分型，或者是否能夠用UCB的另一HLA基因分型重現(xiàn)。發(fā)明人試圖了解使用另一iKIR-HLA錯配的另一輔助細胞系是否會允許從表達相同HLA組的3個CD3-耗盡UCB的匯集物進行NK擴增/激活。

3.第三實驗

由于要治療約100名患者，發(fā)明人需要匯集10個UCB，發(fā)明人試圖了解表達相同HLA阻的5個UCB(一半)的匯集物是否能進行相同的NK擴增/激活。

實施例4：實驗進行

1.第一實驗

將通過Ficoll分離獲得的UCB單核細胞冷凍保存，然后解凍并使用干細胞試劑盒對一部分進行CD3-耗盡。將3個具有相同的主要HLA類1組A3/A11+、Bw4+、C1+、C2+基因型的CD3-耗盡的UCB或總UCB匯集，并與每4天添加的IL-2、IL-15和經(jīng)照射的輔助細胞PLH(A3/A11+、Bw4+、C1-、C2+基因型)一起培養(yǎng)21-25天。

2.第二實驗

將通過Ficoll分離獲得的UCB單核細胞冷凍保存，然后解凍并使用干細胞試劑盒進行CD3-耗盡。將3個具有相同的主要HLA類1組A3/A11-、Bw4+、C1-、C2+基因型的CD3-耗盡的UCB匯集并，與每4天添加的IL-2、IL-15和經(jīng)照射的輔助細胞HOM-2(A3/A11+、Bw4+、C1+、C2-基因型)一起培養(yǎng)21-25天。

3.第三實驗

將通過Ficoll分離獲得的UCB單核細胞冷凍保存，然后解凍并使用干細胞試劑盒進行CD3-耗盡。將5個具有相同的主要HLA類1組A3/A11-、Bw4+、C1+、C2-基因型的CD3-耗盡的UCB匯集，并與每4天添加的IL-2、IL-15和經(jīng)照射的輔助細胞PLH(A3/A11+、Bw4+、C1-、C2+基因型)一起培養(yǎng)21天。

4.評價參數(shù)

使用MUSE Millipore系統(tǒng)和培養(yǎng)中細胞組分的流式細胞術表征將活NK細胞常規(guī)計數(shù)。

NK細胞的激活標志物的表達通過流式細胞術而常規(guī)評價(CD16用于單克隆抗體療法的有效協(xié)同效應；CD69作為通用激活受體)。

在培養(yǎng)20天時，對于實驗2和3評價對公知的K562靶細胞和腫瘤細胞的細胞毒性，并評價對腫瘤細胞的細胞毒性(NK:K562比例3：1，NK：純化B淋巴細胞比例3：1，NK：AML細胞(在患者的全PBMC樣品中)比例10：1，溫育2h)。

實施例5：結果

1.第一實驗(參見圖2和3)

UCB 1:HLA A11:01/A29:02,B35:01/B44:02,C04:01/C16/01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+

UCB2:HLA A11:01/A23:01,B35:02/B49:01,C04:01/07:01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+

UCB3:HLA A2/A3,B18/B51,C5/C14>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+

在CD3-耗盡后從分離的UCB進行NK增殖顯示更好的結果，因為T淋巴細胞與NK細胞就利用所用的細胞因子增殖而競爭(并且針對EBV抗原的CD8-T淋巴細胞也被輔助細胞刺激)。

來自匯集的CD3-耗盡UCB的NK與來自分離的UCB的NK類似地增殖，但是如果UCB未CD3-耗盡，則來自不同供體的T淋巴細胞相互具有細胞毒性，并且NK細胞不能增殖。

表1:

NK擴增因子在該實驗中由于技術問題而相對低。

激活受體良好地表達，并且針對所培養(yǎng)的NK細胞的通用靶標K562的細胞毒性與未激活的NK細胞相比更好。

該實驗顯示，對于NK擴增而言具有相同的主要HLA組基因分型的匯集的UCB是可行的，但是需要預先CD3-耗盡。擴增的NK細胞被良好地激活。

2.第二實驗(參見圖4)

UCB1:HLA A01/02,B27:05/B40:02/C02:02/C15:02>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+

UCB2:HLA A2/A31,B50/B51,C06:02/15:02>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+

UCB3:HLA A23/A24,B44/B44,C4/C5>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+

從匯集的具有該新基因型的CD3-耗盡UCB進行NK增殖與用分離的CD3-耗盡UCB進行的NK增殖相似。

表2:

在該實驗中NK擴增因子較高(無技術問題)，但是仍然能夠通過特異性針對新的輔助細胞系對程序優(yōu)化而改善。

激活受體非常良好地表達。針對所培養(yǎng)的NK細胞的通用靶標K562的細胞毒性與未激活的NK細胞相比更好，進行2小時溫育，發(fā)明人觀察到針對B淋巴瘤腫瘤細胞的顯著細胞毒性。

匯集具有另一主要HLA組基因型的CD3-耗盡UCB，并且擴增具有另一iKIR-HLA錯配的NK細胞和另一輔助細胞系是可行的。擴增的NK細胞被良好地激活。

3.第三實驗(參見圖5)

UCB:HLA A3/A11-,Bw4+,C1+,C2-

表3:

從5個匯集的CD3-耗盡的UCB進行NK增殖是良好的。

在該實驗中NK擴增因子較高。

激活受體非常良好地表達。針對所培養(yǎng)的NK細胞的通用靶標K562的細胞毒性與未激活的NK細胞相比更好，進行2小時溫育，發(fā)明人觀察到針對AML腫瘤細胞的小特異性細胞毒性(但是在20小時后發(fā)明人不能觀察到細胞毒性，因為此時患者細胞由于解凍而死亡)。

匯集5個CD3-耗盡的UCB，并且用發(fā)明人的制造方法以重要的擴增因子擴增NK細胞是可行的。擴增的NK細胞被良好地激活。

4.互補結果

實驗顯示從不進行預先CD3–耗盡的UCB匯集的NK細胞的良好擴增(無重現(xiàn)性檢驗)：(參見圖6)

3用PLH擴增的iKIR-HLA錯配UCB

UCB 1:HLA A2:01/A68:01；B38:01/B57:01；C6:02/C12:03>C1+,C2+,A3/A11-,Bw4+

UCB 2:HLA A1:01/A2:01；B52:01/B57:01；C6:02/C12:02>C1+,C2+,A3/A11-,Bw4+

UCB 3:HLA A02/02；B15:09/B50:02；C06/C07>C1+,C2+,A3/A11-,Bw4-

在不進行預先CD3–耗盡的情況下NK擴增在分離的或者匯集的UCB中是相似的。

-顯示9天培養(yǎng)后(用CD3-未耗盡的UCB)匯集的可行性的實驗

1/相同的之前的實驗(參見圖7)

表4：

可以匯集9天激活的NK細胞(此處不進行預先CD3-耗盡)，保持顯著但較低的NK擴增。

2/利用以PLH擴增的2個iKIR-HLA錯配UCB的實驗：(參見圖8)

UCB 1:HLA A11:01/A29:02,B35:01/B44:02,C04:01/C16/01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+

UCB2:HLA A11:01/A23:01,B35:02/B49:01,C04:01/07:01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+

當9天擴增后NK在CD3-未耗盡的匯集UCB中不適當?shù)財U增(增加NK％和NK激活狀態(tài)，但仍然具有高度T淋巴細胞％)時，似乎克服了該問題。它們顯示針對B淋巴瘤腫瘤細胞的體外相似的良好細胞毒性(過夜，比例E:T 1：1)。

3/利用以PLH擴增的2個iKIR-HLA錯配UCB的實驗：(參見圖9)

UCB1:HLA A02:02/30:01,B42:01/B53:01,C04:01/17:01>HLA A3/A11-,Bw4+,C1-,C2+

UCB2:HLA A11:01/A23:01,B35:02/B49:01,C04:01/07:01>HLA A3/A11+,Bw4+,C1+,C2+

表5:

來自CD3-未耗盡iKIR-HLA錯配的匯集的UCB的NK細胞顯示較低的擴增因子，并且9天擴增后匯集這些UCB提供更好的NK擴增。它們顯示針對B淋巴瘤腫瘤細胞的體外相似的良好細胞毒性(過夜，比例E:T 1：1)。

實施例6：展望

1.方法優(yōu)化

優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的匯集的激活/擴增的NK細胞的制造方法適應藥物管理義務，并且所述方法的每一步適于最佳品質保證。

-首先，例如，必須設定UCB單位的接受標準，如大于1.4或1.6×10⁶總有核細胞(目前1.85×10⁶個總有核細胞，對于我們的局部UCB庫而言)，對于NK百分比而言具有潛在最小的閾值，例如7％(在UCB總有核細胞中通常觀察到的3-15％NK)。

-在以上實施例中用于UCB單核細胞(UCBMC)分離的“Ficoll”法可以容易地被適應性良好的標準和用于臨床應用的公知方法和藥物條件代替，例如使用具有袋的密封滅菌的單應用系統(tǒng)，使用合適的步驟例如HES 6％和離心紅細胞消除和體積減少，或Prepacyte CB分離系統(tǒng)。這些系統(tǒng)必然提高第一步中的總有核細胞回收。

-優(yōu)選的是，UCBMC的CD3-耗盡可以更好地適合合規(guī)性和/或用于藥物應用的GMP方法，例如利用合適的臨床上可升級的材料如CliniMACS^TM，和通過確定對于最佳細胞回收和最佳CD3–耗盡品質而言，首先在冷凍保存之前或之后是否需要CD3-耗盡的最佳步驟時間。

-優(yōu)選的是，用于UCBMC的冰冷、冷凍保存和解凍步驟可以在制造方法的驗證后使用臨床應用用授權步驟改善?？梢允褂糜糜诖芊庀到y(tǒng)的合適材料，并且冷凍保存條件(培養(yǎng)基，細胞濃度)可以由本領域技術人員針對本發(fā)明的方法而容易地優(yōu)化。在解凍后僅這些優(yōu)化步驟應該必然地提高總細胞回收。同時，應該設定用于各解凍的UCBMC進一步進入根據(jù)藥物指南的制造方法的接受標準。

-優(yōu)選的是，HLA-基因分型和抑制性KIR表達評價方法應該經(jīng)驗證以選擇允許針對擴增/激活步驟匯集的不同UCB單位：選擇標準應該針對各個批次設定。

-優(yōu)選的是，符合GMP的可升級的輔助細胞(無論它們是否會包括在本發(fā)明的方法中)，關于NK擴增：激活進行最終篩選以用于集落選擇。最終的輔助細胞必須被良好地表征以用于治療劑生產(chǎn)方法。該優(yōu)化步驟也可以改善NK擴增/激活結果。

-優(yōu)選的是，照射步驟會經(jīng)優(yōu)化和驗證以用于具有臨床適應性品質參數(shù)的最佳擴增/激活結果，并且會設定冷凍保存的經(jīng)照射輔助細胞的接受標準，包括不增殖評價、細胞活力、EBV失活等等。

-會對經(jīng)照射的輔助細胞提取物添加步驟進行優(yōu)化以用于在包含輔助細胞的工序中使用的最終集落。

-優(yōu)選的是，使用生物反應器中的動力學培養(yǎng)密封系統(tǒng)以用于具有至少5個，優(yōu)選10個匯集的UCB單位的擴增/激活步驟，例如已經(jīng)針對NK培養(yǎng)物測試的Wave system^TM(GE Healthcare)。

-優(yōu)選的是，可以使用用于擴增/激活步驟的培養(yǎng)基，其使用無動物血清培養(yǎng)基，如來自Lonza的X-VIVO^TM培養(yǎng)基、來自Cellgenix的CellGro SCGM^TM，或來自nvitrogen的AIM V^TM(如已經(jīng)針對NK培養(yǎng)物進行了測試)。

-優(yōu)選的是，使用利用合適的臨床上可升級的材料(例如CliniMACS^TM)擴增/激活的NK細胞的CD56陽性選擇。

2.藥物開發(fā)：最終產(chǎn)品表征和接受標準

優(yōu)選的是，接受最終經(jīng)擴增/激活產(chǎn)品的標準必須包括在所述工序中，包括產(chǎn)品鑒定步驟(遺傳穩(wěn)定性、嵌合性、表型)和標準效力評價步驟。

-優(yōu)選的是，可以檢查本發(fā)明工序前后NK細胞的遺傳穩(wěn)定性，觀察其核型(例如通過本領域技術人員公知的G帶核型分型或cytoscanHD顯微陣列方法)，并且必須定義來自不同供體的最終匯集NK細胞的嵌合性(例如通過標準多重PCR STR法)。

-優(yōu)選的是，為了更好地鑒定和表征最終產(chǎn)物和定義接受標準，評價更多NK表型標志物(NKG2D、NKG2C、CD94、NKp44、NKp30、NKp46、CD158...)的表達(例如通過流式細胞術)。

-優(yōu)選的是，用針對通常使用的公知靶細胞的驗證細胞毒性檢驗測試各產(chǎn)品批次。

-優(yōu)選的是，在最終工序步驟期間或之后必須驗證不存在污染物，例如細菌、真菌、支原體和病毒(特別是EBV)，以及不存在內(nèi)毒素和制造過程中使用的細胞因子。