本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍血treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)：

調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatorycells,簡(jiǎn)稱tregs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)能夠控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的t細(xì)胞亞群，由于其具有免疫抑制作用，早期亦稱做suppressortcells。tregs是高表達(dá)cd25且依賴il-2生存的cd4+t細(xì)胞亞群。根據(jù)tregs細(xì)胞發(fā)育的來(lái)源不同，可分為兩種類(lèi)型的cd4+cd25+tregs，自然tregs(ntregs)和可誘導(dǎo)的tregs(itregs)。ntregs在胸腺中發(fā)育，itregs在外周發(fā)育。我們通常所說(shuō)的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞是指在胸腺中發(fā)育的ntregs。到目前為止，人們對(duì)tregs的研究已有20多年的歷史，盡管對(duì)于體內(nèi)影響tregs發(fā)育的因素仍然不是很清楚，但tregs的免疫調(diào)節(jié)作用卻已經(jīng)得到證實(shí)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，tregs能夠抑制t細(xì)胞和b細(xì)胞增殖，并抑制抗體的產(chǎn)生，其發(fā)揮免疫抑制功能有多種可能機(jī)制。一是通過(guò)產(chǎn)生il-10等免疫抑制因子來(lái)抑制普通t細(xì)胞的活化增殖，二是通過(guò)上調(diào)自身il-2受體的表達(dá)，抑制其他t細(xì)胞與il-2的結(jié)合，從而影響其他t細(xì)胞的活化和增殖，三是通過(guò)表達(dá)ctla-4來(lái)與抗原提呈細(xì)胞表面分子cd80和cd86相結(jié)合，從而啟動(dòng)抑制信號(hào)。tregs還可以通過(guò)增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞的功能來(lái)抑制靶細(xì)胞?？傊?，tregs的抑制機(jī)制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的協(xié)同機(jī)制，目前還不是很清楚上述許多機(jī)制的靶向目標(biāo)是什么。但是可以確定的是，tregs發(fā)揮作用時(shí)并不是依賴單一的作用機(jī)制，而是通過(guò)多種抑制機(jī)制相結(jié)合共同發(fā)揮作用。

治療免疫性疾病的終極目標(biāo)是預(yù)防自身抗原反應(yīng)性t細(xì)胞或b細(xì)胞的激活及其引起的組織損害和炎癥反應(yīng)，但如果所有存在于同一微環(huán)境的t細(xì)胞均能被tregs從不同的途徑抑制，那么引起自身免疫反應(yīng)的特異性效應(yīng)t細(xì)胞也同樣可以被相對(duì)應(yīng)的tregs調(diào)控而達(dá)到治療效果。因此，tregs的免疫抑制功能對(duì)免疫性疾病的防治帶來(lái)了新的思路。近來(lái)的研究也表明，自身免疫性疾(如ⅰ型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力)的發(fā)病與血液中tregs的數(shù)目、功能或者tregs與效應(yīng)性t細(xì)胞的比率失衡有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，tregs還能用于治療gvhd，輸注cd4+cd25+tregs的細(xì)胞數(shù)量與cd4+的數(shù)目相當(dāng)就能夠抑制gvhd。其他免疫性疾病的治療也至少需要輸注1x10^9個(gè)tregs。但是機(jī)體內(nèi)cd4+cd25+tregs僅占cd4+t細(xì)胞的5％～10％，占人外周血單個(gè)核細(xì)胞只有1％～2％。這樣，從外周血分離提取cd4+cd25+細(xì)胞至少需要擴(kuò)增50到100倍才能獲得治療需要的最小數(shù)目的tregs細(xì)胞。因此，如何在體外高效擴(kuò)增tregs逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

最初研究者認(rèn)為tregs細(xì)胞在體外處于反應(yīng)狀態(tài)，在體外不能擴(kuò)增，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)tregs可以在體外擴(kuò)增。目前，已報(bào)道的tregs體外擴(kuò)增的方法主要是用anti-cd3/anti-28和il-2在體外與純化后的tregs細(xì)胞混合培養(yǎng)，打破tregs的無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)10～15倍。最近，又有研究人員報(bào)道了一種高效的擴(kuò)增方法，他們?cè)隗w外應(yīng)用足量anti-cd3、anti-cd28和整合素2使純化的cd4+cd25+tregs在不到兩周的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增了200倍。但目前報(bào)道的這些方法均需要在體外擴(kuò)增前，用免疫磁珠對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，操作繁瑣，同時(shí)還增加了細(xì)胞污染的可能性，不利于在臨床上大規(guī)模推廣應(yīng)用。而且，已有研究表明，cd4+cd25-t細(xì)胞可以在白介素7、白介素15以及雌激素等的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化成cd4+cd25+tregs，然而其擴(kuò)增倍數(shù)和擴(kuò)增周期不理想，且也需要提前純化，操作繁復(fù)。

此外，成體外周血tregs在臨床應(yīng)用中還存在其它的局限性，比如：在自身免疫性疾病患者中，可能存在細(xì)胞數(shù)量明顯減少，或者功能失調(diào)，因此無(wú)法通過(guò)提取自身的tregs進(jìn)行治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種臍血treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，以解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種臍血treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，所述提取方法包括以下步驟；

s1：從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞；

s2：采用培養(yǎng)基將單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)整至(0.1x106)～(10x106)/ml，然后將該密度的單個(gè)核細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶，添加滅活血漿；

第一天：向培養(yǎng)瓶中加入擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2；

s3：第四天：補(bǔ)加培養(yǎng)基，并添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2并使其終濃度與步驟s2中各種成分的終濃度一致；

s4：第六天：補(bǔ)加培養(yǎng)基，并添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2并使其終濃度均保持不變；

s5：第九天：補(bǔ)加培養(yǎng)基，并添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2并使其終濃度均保持不變；

s6：第十二天：收集細(xì)胞，其細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)250倍，細(xì)胞純度大于80％。

進(jìn)一步地，步驟s1中，分離單個(gè)核細(xì)胞的方法為：取臍血，并在600～900g/min離心10～20min，收集上層血漿，將血漿置于50～60℃滅活20～40min，2500rpm/min離心后備用；然后加入等體積pbs稀釋剩余的血細(xì)胞，用常規(guī)密度梯度離心的方法分離臍血。

進(jìn)一步地，步驟s2中，采用培養(yǎng)基將單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)整至1x106/ml，然后進(jìn)行接種，接種后添加滅活血漿至該滅活血漿終濃度為3～7％。

進(jìn)一步地，所述滅活血漿添加至其終濃度為5％為止。

進(jìn)一步地，步驟s2中，所述擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2的加入量為：加入至其終濃度分別為擬雌內(nèi)酯1～500ng/ml、tgf-β1～10ng/ml、cd3/cd28單克隆抗體0.5～4μg/ml和il-21000～3000u/ml為止。

進(jìn)一步地，步驟s2中，所述擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2的加入量為：加入至其終濃度分別為擬雌內(nèi)酯100ng/ml、tgf-β5ng/ml、cd3/cd28單克隆抗體2μg/ml和il-22000u/ml為止。

進(jìn)一步地，步驟s3中，培養(yǎng)基的補(bǔ)加量為步驟s2中接種至培養(yǎng)瓶中體積量的0.5～0.7倍，優(yōu)選0.6倍；

步驟s4中，培養(yǎng)基的補(bǔ)加量為步驟s2中接種至培養(yǎng)瓶中體積量的1.3～2.0倍，優(yōu)選1.6倍；

步驟s5中，培養(yǎng)基的補(bǔ)加量為步驟s2中接種至培養(yǎng)瓶中體積量的3～5倍，優(yōu)選4倍。

進(jìn)一步地，步驟s3中，培養(yǎng)基的補(bǔ)加量為步驟s2中接種至培養(yǎng)瓶中體積量的0.6倍；

步驟s4中，培養(yǎng)基的補(bǔ)加量為步驟s2中接種至培養(yǎng)瓶中體積量的1.6倍；

步驟s5中，培養(yǎng)基的補(bǔ)加量為步驟s2中接種至培養(yǎng)瓶中體積量的4倍。

進(jìn)一步地，步驟s2～s6的細(xì)胞培養(yǎng)中，所述的培養(yǎng)基為rpmi1640培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，步驟s2～s6中，細(xì)胞培養(yǎng)均在37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本發(fā)明至少具有以下有益效果：

本發(fā)明給出了一種臍血treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，該方法采用擬雌內(nèi)酯+tgf-β共同作用誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞中的cd4+cd25-t轉(zhuǎn)變?yōu)閏d4+cd25+tregs，增加tregs擴(kuò)增的基礎(chǔ)數(shù)目，且該方法無(wú)需預(yù)先純化，就可以在短時(shí)間內(nèi)高效擴(kuò)增tregs，培養(yǎng)十天左右便可達(dá)到250倍左右的擴(kuò)增量，純度能夠達(dá)到將近90％左右，可直接用于后續(xù)的治療等，無(wú)需進(jìn)一步純化，極其方便。而且擬雌內(nèi)酯可上調(diào)stat5的磷酸化水平從而有助于tregs擴(kuò)增，tgf-β也有助于提高tregs的純度，擬雌內(nèi)酯與tgf-β共同作用便能夠高效誘導(dǎo)擴(kuò)增增tregs且無(wú)需預(yù)先進(jìn)行純化或篩選，大大簡(jiǎn)化了擴(kuò)增方法、增加了擴(kuò)增倍數(shù)、縮短了擴(kuò)增周期，其具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

此外，本發(fā)明采用臍血來(lái)源廣泛，具有免疫抑制作用，臍血來(lái)源的tregs免于移植受體的免疫排斥反應(yīng)，并能在體內(nèi)更好地發(fā)揮免疫抑制功能。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明背景技術(shù)中所述的單個(gè)核細(xì)胞中cd4+cd25-t細(xì)胞和cd4+cd25+tregs含量對(duì)比圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例所述的tregs擴(kuò)增倍數(shù)的示意圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例所述的本發(fā)明的tregs純度的示意圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例所述的本發(fā)明的p-stat5的表達(dá)水平示意圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例所述的本發(fā)明的tregs的免疫抑制率示意圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。以下提供的本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通方法人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

分離臍血單個(gè)核細(xì)胞的過(guò)程為：新生兒臍血采自婦產(chǎn)科足月健康新生兒，胎兒娩出后，從胎盤(pán)臍靜脈穿刺采血100ml放入含有枸櫞酸抗凝劑的采血袋中，血液在采集后的4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室處理。取臍血100ml，750g/min離心15min。收集上層血漿，將血漿置于56℃滅活30min，2500rpm/min離心后備用；加入等體積(1:1)pbs稀釋剩余的血細(xì)胞，用常規(guī)密度梯度離心的方法分離單個(gè)核細(xì)胞。

實(shí)施例2

流式檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中的細(xì)胞比例：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)施例3所分離的單個(gè)核細(xì)胞中cd4+cd25-t細(xì)胞和cd4+cd25+tregs的比例。

收集分離得到的單個(gè)核細(xì)胞，每組1x10^6個(gè)細(xì)胞，均在750g室溫離心5min，棄上清；2mlpbs重復(fù)洗滌細(xì)胞3次后，用100ulpbs重懸細(xì)胞；并加入10ulapc-cd4和10ulpe-cd25抗體雙染作為試驗(yàn)組，并設(shè)置10ulapc-cd4和10ulpe-cd25抗體單染組作熒光補(bǔ)償，不染色細(xì)胞組作為陰性本底。4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后每管加入2mlpbs，750g室溫離心5min，棄上清。并繼續(xù)用2mlpbs重復(fù)洗滌2次后，加200ulpbs重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：cd4+cd25-t細(xì)胞的比例為38.4％，cd4+cd25+tregs的比例僅為1.29％，含量極低，如圖1所示。

實(shí)施例3

一種臍血treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，所述提取方法包括以下步驟；

s1：分離單個(gè)核細(xì)胞：取臍血100ml，并在800g/min離心10min，收集上層血漿，將血漿置于54℃滅活40min，2500rpm/min離心后備用；然后加入等體積pbs稀釋剩余的血細(xì)胞，用常規(guī)密度梯度離心的方法分離臍血；

s2：用rpmi1640調(diào)整細(xì)胞密度至0.5x10⁶/ml，每瓶5ml接種至t25培養(yǎng)瓶；添加滅活血漿，使血漿終濃度為5.5％。

s3：第一天：加入擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2，并使各種成分的終濃度為：擬雌內(nèi)酯100ng/ml、tgf-β5ng/ml、cd3/cd28單克隆抗體2μg/ml、il-22000u/ml；

s4：第四天：補(bǔ)加3mlrpmi1640，添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、cd3/cd28單克隆抗體、tgf-β、il-2，并使這幾種成分的終濃度均保持不變，即擬雌內(nèi)酯100ng/ml、tgf-β5ng/ml、cd3/cd28單克隆抗體2μg/ml、il-22000u/ml；

s5：第六天：補(bǔ)加8mlrpmi1640，并添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、cd3/cd28單克隆抗體、tgf-β、il-2，并使這幾種成分的終濃度均保持不變；

s6：第九天：補(bǔ)加20mlrpmi1640，添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、cd3/cd28單克隆抗體、tgf-β、il-2，并使這幾種成分的終濃度均保持不變；

s7：第十二天：收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并進(jìn)行流式檢測(cè)其tregs含量，通過(guò)上述方法，在培養(yǎng)至第12天時(shí)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)250倍，細(xì)胞純度約為87％左右。

上述步驟s2～s6的細(xì)胞培養(yǎng)中，且均在37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)施例4

一種臍血treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，所述提取方法包括以下步驟；

s1：分離單個(gè)核細(xì)胞：取臍血100ml，并在750g/min離心15min，收集上層血漿，將血漿置于56℃滅活30min，2500rpm/min離心后備用；然后加入等體積pbs稀釋剩余的血細(xì)胞，用常規(guī)密度梯度離心的方法分離臍血；

s2：用rpmi1640調(diào)整細(xì)胞密度至1x10⁶/ml，每瓶5ml接種至t25培養(yǎng)瓶；添加滅活血漿，使血漿終濃度為5％。

s3：第一天：加入擬雌內(nèi)酯、tgf-β、cd3/cd28單克隆抗體和il-2，并使各種成分的終濃度為：擬雌內(nèi)酯110ng/ml、tgf-β4ng/ml、cd3/cd28單克隆抗體1.5μg/ml、il-21600u/ml；

s4：第四天：補(bǔ)加4mlrpmi1640，添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、cd3/cd28單克隆抗體、tgf-β、il-2，并使這幾種成分的終濃度均保持不變；

s5：第六天：補(bǔ)加8mlrpmi1640，并添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、cd3/cd28單克隆抗體、tgf-β、il-2，并使這幾種成分的終濃度均保持不變；

s6：第九天：補(bǔ)加22mlrpmi1640，添加滅活血漿、擬雌內(nèi)酯、cd3/cd28單克隆抗體、tgf-β、il-2，并使這幾種成分的終濃度均保持不變；

s7：第十二天：收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并進(jìn)行流式檢測(cè)其tregs含量，通過(guò)上述方法，在培養(yǎng)至第12天時(shí)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)250倍，細(xì)胞純度約為83％左右。

上述步驟s2～s6的細(xì)胞培養(yǎng)中，且均在37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)施例5：

為了獲知擬雌內(nèi)酯的最佳濃度，將單個(gè)核細(xì)胞分為7組，記為試驗(yàn)1～試驗(yàn)7，各組中擬雌內(nèi)酯的終濃度分別為：0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；其他的實(shí)驗(yàn)條件、培養(yǎng)基、接種量、培養(yǎng)基添加量、培養(yǎng)天數(shù)等等均與實(shí)施例4相同。各種成分的加量或中濃度如下表1所示。

表1各種成分的終濃度

第十二天收集細(xì)胞，對(duì)各組計(jì)數(shù)，并采用實(shí)施例2的方法對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行流式檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2～3所示，擬雌內(nèi)酯濃度為100ng/ml時(shí)，在培養(yǎng)至第12天時(shí)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)250倍，細(xì)胞純度大于80％，將近90％，且其擴(kuò)增倍數(shù)與tregs純度不再隨擬雌內(nèi)酯濃度的增高而升高。

實(shí)施例6：stat5磷酸化水平檢測(cè)

收集實(shí)施例5中試驗(yàn)1和試驗(yàn)5所培養(yǎng)的tregs各2×10⁶，用4℃預(yù)冷的pbs充分洗滌3次后，加入4℃的ripa裂解緩沖液200μl重懸細(xì)胞，冰上裂解20min。離心收集上清蛋白液，并取150μl蛋白液加入37.5μl5×蛋白buffer，100℃煮沸5min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將蛋白液加入凝膠中電泳，電壓60v電泳5min后，用80v電壓電泳60min。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，100v，2h。將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，tbst稍加漂洗，浸沒(méi)于封閉液中緩慢搖蕩1h。

將含有目的蛋白的膜分別轉(zhuǎn)入裝有4ml一抗(rabbitphospho-stat5alpha(tyr694)monoclonalantibody)的自封袋中，水平搖床上50rpm1h，轉(zhuǎn)到4℃過(guò)夜。第二天將膜取出，用tbst漂洗四次。將轉(zhuǎn)有目的蛋白的膜和內(nèi)參蛋白的膜分別放在2號(hào)自封袋中，加入稀釋(1：5000)對(duì)應(yīng)一抗的二抗(goatanti-rabbitigg(h+l)secondaryantibody)，室溫輕搖一小時(shí)，一抗和二抗均購(gòu)自ebioscience。二抗孵育結(jié)束后，用pbst漂洗膜四次。避光加入顯色劑顯色拍照。

結(jié)果如圖4所示，試驗(yàn)5所培養(yǎng)的細(xì)胞p-stat5的表達(dá)水平明顯升高。

實(shí)施例7：tregs免疫抑制能力檢測(cè)

采用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)按實(shí)施例3的方法擴(kuò)增后tregs的免疫抑制功能。

提取成體外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，用cfse標(biāo)記為效應(yīng)細(xì)胞，并給予anti-cd3/cd28磁珠的刺激。在96孔板中每孔加入1x10⁵個(gè)pbmc，按磁珠︰pbmc為1︰3的比例加入磁珠。取實(shí)施例3中試驗(yàn)5培養(yǎng)至第12天的tregs，并按tregs細(xì)胞︰pbmc為1︰1、1︰2、1︰4、1︰8和1:16的比例依次加入treg細(xì)胞。37℃、5％co2培養(yǎng)4天。用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析treg細(xì)胞的體外抑制能力，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)tregs細(xì)胞具有顯著的免疫抑制能力，且當(dāng)tregs細(xì)胞︰pbmc為1︰1時(shí)，抑制率接近100％。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有各種改動(dòng)和變化。凡在本發(fā)明的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。