一種仔豬腹瀉抗性相關(guān)的分子標(biāo)記檢測方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用于豬腹瀉抗性性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。在序列表SEQ?ID?NO：1的第625bp處有一個G/T的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-BshN1多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴(kuò)增基因DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性的檢測方法。本發(fā)明為豬腹瀉抗性性狀標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記。
【專利說明】一種仔豬腹瀉抗性相關(guān)的分子標(biāo)記檢測方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種包含如SEQ ID NO:1所示仔豬基因核苷酸的核酸分子。本發(fā)明還涉及如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點以及檢測所述單核苷酸多態(tài)性位點的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究表明，GPI與生物體很多疾病有關(guān)。已知的與人沉積在老年性癡呆、感染性蛋白質(zhì)疾病(包括人的 Creutzfeld-Jakob 病，Gerstmann-straussler-scheinker 綜合癥，庫魯病和綿羊及山羊的瘙癢癥等)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、非洲昏睡病、瘧疾、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥、慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等有直接關(guān)系。
[0003]在白念珠菌耐藥基因研究中，GPII被認(rèn)為與耐藥有關(guān)(麻志萍等，2008)。在朊蛋白的有關(guān)研究中，GPI錨定位點的移除可減少對感染性朊蛋白疾病的易感性，保護(hù)了可溶性的PrPc轉(zhuǎn)變?yōu)橹С指腥拘噪玫鞍讖?fù)制的分子(張?zhí)瑁?008)。還有研究表明，缺氧狀態(tài)下，YC-1抑制人胰腺癌PC-3細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和GPI基因轉(zhuǎn)錄與其抑制HIF-1 α蛋白的表達(dá)有關(guān)，YC-1能夠抑制人胰腺癌PC-3細(xì)胞生長和增殖。同時有實驗表明，在鼠的肝臟內(nèi)腔隙中存在GP1-PLD，在移去肝臟以后，酶的活性明顯下降，在緊接著移植入肝后，酶的活性明顯增加，在嚴(yán)重肝疾病時，酶的活性依賴于肝的合成儲備功能，說明肝是其主要來源。在病毒性肝炎及支氣管炎肺炎時，其活性明顯上升，說明GP1-PLD也可作為一個急性期反應(yīng)物。競爭性RT-PCR監(jiān)測在不同惡性程度腫瘤細(xì)胞中GP1-PLD mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)釋放大量腫瘤可溶性預(yù)后標(biāo)記物的卵巢癌細(xì)胞與釋放少量標(biāo)記物的卵巢癌細(xì)胞相比，其GP1-PLDmRNA 的表達(dá)水平明顯增加(Xiao Guang-fen，2010)。
[0004]人的GPIl基因包含11個外顯子，定位于16pl3.3，靠近α血紅蛋白基因座，GPII基因在組織和細(xì)胞中的表達(dá)無所不在，尤其在骨髓、胎兒肝臟等造血組織中的表達(dá)顯著高于其他組織。GPIl基因目前已被確認(rèn)是GPI生物合成的必需組成部分。GPI編碼產(chǎn)物與糖基磷脂酰肌醇的合成密切相關(guān)。在生物體的免疫、代謝等多個方面發(fā)揮重要的作用?？梢灶A(yù)見，由于GPIl基因?qū)τ贕PI合成的重要性，GPIl基因?qū)τ谏矬w的疾病有著非常重要的調(diào)控作用。而目前對豬GPIl基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究卻還不太深入。
[0005]本發(fā)明選擇豬GPIl基因作為豬腹瀉抗性性狀的候選基因，以3個外來豬種(杜洛克豬、大白豬、長白豬)和I個本地豬種(寧鄉(xiāng)豬)為試驗材料，采用PCR-RFLP方法對GPIl基因G/T位點的基因頻率、基因型頻率進(jìn)行檢測，并分析其遺傳結(jié)構(gòu)，初步探討該基因與腹瀉抗性性狀的相關(guān)性。目前國內(nèi)外關(guān)于豬GPIl基因的相關(guān)研究很少。本發(fā)明將找到與仔豬腹瀉抗性有關(guān)的遺傳標(biāo)記，為篩選ETEC F4抗性豬提供可行的標(biāo)記輔助選擇方法，為選育ETEC F4抗性豬配套系提供理論研究依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于找到與仔豬腹瀉抗性有關(guān)的遺傳標(biāo)記，為篩選ETEC F4抗性豬提供可行的標(biāo)記輔助選擇方法，為ETEC F4抗性豬的早期選種提供依據(jù)，為選育ETEC F4抗性豬配套系提供理論研究依據(jù)。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008]利用比較基因組學(xué)方法，根據(jù)發(fā)明人提交到GenBank的GPIl基因序列(收錄號為JX125039)和人的GPIl基因的保守區(qū)設(shè)計引物，以豬的基因組DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增片段利用測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)SNP，并利用PCR — RFLP進(jìn)行基因分型，再利用獨立性卡方檢驗對檢測的該基因SNPs與腹瀉抗性的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行分析，以檢驗該SNPs的實際應(yīng)用效果。
[0009](I)PCR引物設(shè)計與序列獲得
[0010]利用Primer Premier軟件，根據(jù)不同物種的GPII基因的保守序列制備了檢測上述序列表SEQ ID NO:1基因片段突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5' -CTTGGAGCTAAG CAGTGATGTG-3'，反向引物為 5' -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'。該引物對的退火溫度為62°C，以豬的基因組DNA為模板，構(gòu)建20 μ L的擴(kuò)增體系，經(jīng)過預(yù)變性、變性一退火一延伸33個循環(huán)以及后延伸的反應(yīng)過程，獲得了目的片段，片段核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所述。
[0011](2) SNP發(fā)現(xiàn)與檢測方法建立
[0012]發(fā)明人通過對擴(kuò)增序列測序，得到了一種與仔豬腹瀉抗性相關(guān)的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所述。序列表SEQ ID NO:1序列的625bp處有I個G/T的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-BshNl多態(tài)性，PCR產(chǎn)物經(jīng)BshNl酶切后，顯示出GG、GT和TT
二種基因型。
[0013]發(fā)明設(shè)計了擴(kuò)增包含該 SNPs的引物，經(jīng)分析G/T位點的突變可以采用BshNl進(jìn)行酶切檢測多態(tài)性。在擴(kuò)增的809bp的片段上，存在I個BshNl的酶切位點，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后結(jié)果顯示，在GPIl基因的G/T位點存在3種基因型，GG型(809bp)、GT型(345bp、464bp、809bp)和 TT 基因型(345bp、464bp)。
[0014](3)基因型一腹瀉抗性關(guān)聯(lián)分析
[0015]利用獨立性卡方檢驗對基因型與腹瀉性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析表明在杜洛克豬、長白豬、大白豬中T基因為優(yōu)勢等位基因，T基因頻率分別為1，0.99,0.97，而在寧鄉(xiāng)豬中G基因為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.85。GPIl基因的基因型分布在以這四個豬種為代表的中外豬種中差異較大，三個外來品種的仔豬的基因型分布與寧鄉(xiāng)豬中的分布差異極顯著(P < 0.01)，仔豬外顯子的兩種基因型TT型、GT型間的腹瀉抗性差異顯著(0.0Kp< 0.05)，尤其在大白豬、長白豬外顯子的兩種基因型TT型、GT型間的腹瀉抗性差異極顯著(P <0.01)，表明杜洛克、長白豬、大白豬TT基因型的腹瀉個體非常集中，在杜洛克、長白豬、大白豬這三個品種豬中TT型將可能是腹瀉抗性的參考遺傳標(biāo)記。
[0016]利用上述制備的與豬腹瀉抗性相關(guān)的分子標(biāo)記對不同豬品種的腹瀉情況進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，從而完成了本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 GPII基因SNPs位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
[0018]圖2 GPII基因SNPs位點的酶切電泳結(jié)果
[0019]泳道1，5，6，7，9，12:GG基因型;泳道2，3，4，11:GT基因型;泳道8，10:TT基因型；【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地解釋，但【具體實施方式】并不對本發(fā)明做任何限定。
[0021]實施例1:
[0022]1.引物設(shè)計
[0023]利用比較基因組學(xué)方法根據(jù)豬的GPIl基因(GenBank收錄號為JX125039)的第I外顯子，以該基因在GenBank作BLAST，序列比對后篩選出GPIl基因候選SNPs位點，選取GPIl基因的第625bp候選SNPs位點，以JX125039.seq序列為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計引物，運用PCR —RFLP技術(shù)驗證該位點的存在。
[0024]引物序列M-F:5' -CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3'，
[0025]M-R:5/ -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'
[0026]2.PCR條件的DNA提取
[0027]DNA樣品來自4個品種共183頭，其中新五豐原種豬場杜洛克豬26頭、大白豬55頭、長白豬34頭；地方品種寧鄉(xiāng)豬68頭。取小塊供試豬耳組織提取DNA。
[0028]PCR 條件:
[0029]PCR 反應(yīng)體系(總 體積 20 μ L):10Xbuffer2 μ L, 2mmol/L dNTPsl.6 μ L, 20mmol/L MgCl2L 6 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L，DNA 模板(IOOng/ μ L) I μ L，上下游引物(IOpmoI/ μ L)各 0.5 μ L，ddH2012.4 μ L。
[0030]反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸50s，共33個循環(huán)；72 C后延伸5min,最后4 C保存。
[0031]取10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2 μ L溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻后，點樣于1%的瓊脂糖凝膠(含0.05%ΕΒ)上，然后點6 μ LlOObp DNA Markers作為參照。5V/cm電泳0.5~1.0h。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增結(jié)果并拍照，結(jié)果如圖1所示。將純化后的PCR產(chǎn)物后送鉬尚生物技術(shù)公司測序。
[0032]3.PCR 產(chǎn)物的 BshNl 酶切
[0033]在IOul PCR產(chǎn)物中加入8ullOX內(nèi)切酶緩沖液、0.2ul限制性內(nèi)切酶和2ul雙蒸水，總體積為20.2ul，37°C消化4-10h。G/T位點用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，5V/cm電壓電泳0.5h，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照，酶切結(jié)果如圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列如SEQ ID NO:I所示，擴(kuò)增片斷為豬GPIl基因的87bp到895bp之間，為第I外顯子的片斷，共809bp，為PCR-RFLP-BshNl分子標(biāo)記，圖2是本發(fā)明中GPIl基因，PCR-RFLP的三種基因的TT、GT和GG電泳結(jié)果。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL20001adder)
[0034]PCR-RFLP-BshNl多態(tài)性在各品種中的分布情況如下表1所示，由表1可以看出，在杜洛克豬、長白豬、大白豬中T基因為優(yōu)勢等位基因，T基因頻率分別為1，0.99,0.97，而在寧鄉(xiāng)豬中G基因為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.85。從四個品種的基因型頻率分布來看，TT基因型在外來品種的杜洛克豬、長白豬、大白豬中的分布占優(yōu)勢，而在寧鄉(xiāng)豬中，兩個基因型的分布差異較大；卡方檢驗結(jié)果表明，本試驗中的三個外來品種杜洛克豬、長白豬和大白豬均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，屬于平衡群體；而本地豬種寧鄉(xiāng)豬不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),不屬于平衡群體。[0035]表1不同品種GPIl基因G/T位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種仔豬腹瀉抗性相關(guān)的GPIl基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仔豬腹瀉抗性相關(guān)的GPIl基因片段，其特征在于，序列表SEQID NO:1的625bp處有I個G/T的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-BshNl多態(tài)性。
3.檢測權(quán)利要求2所述的一種仔豬腹瀉抗性相關(guān)的GPIl基因片段突變的引物對，其特征在于:所述的引物對的正向引物為Y -CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3 ,，反向引物為5' -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'。
4.制備如權(quán)利要求2所述的仔豬腹瀉抗性相關(guān)的GPIl基因片段的方法，按照以下步驟: 利用權(quán)利要求3所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用限制性內(nèi)切酶BshNl對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，最后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測TT、GT和GG基因型的分布。
5. 權(quán)利要求2所述的仔豬腹瀉抗性相關(guān)的基因片段在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK103525822SQ201310502527
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】何俊, 張珈榕, 馬海明, 蔣雋, 賀長青 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)