抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該單鏈抗體的重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO.2所示；其還包括豬抗體恒定區(qū)Fc段基因序列，序列如SEQ ID NO.3所示；重鏈可變區(qū)基因序列與輕鏈可變區(qū)基因序列由連接肽linker序列連接，序列如SEQ ID NO.4所示。本發(fā)明中scFv?Fc的長(zhǎng)度為1128bp，翻譯成多肽鏈的分子量約為40kDa左右，是天然免疫球蛋白的1/4，分子量的減小能提高其在組織間的穿透性；Elisa結(jié)果顯示scFv?Fc可以對(duì)PEDV進(jìn)行識(shí)別。
【專利說明】
抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體，同時(shí)還涉及該抗體的制備 方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以不同年齡段豬的劇烈腹瀉、嘔吐和脫 水等為特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。針對(duì)PEDV的研究目前主要集中在利用基 因工程手段克隆其纖突蛋白（S)、主要嵌膜蛋白（M)和核衣殼蛋白（N)，表達(dá)產(chǎn)物再作為保護(hù) 性抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。如公開的經(jīng)典流行毒株CV777株和弱毒株ZJ08株 (CN103725651A)、SD10株(CN103820399A)。再如，鄭逢梅等應(yīng)用RT-PCR方法，從腹瀉仔豬樣 本中擴(kuò)增得到1段PEDV，即河南地區(qū)流行毒株N基因全長(zhǎng)序列，通過對(duì)其氨基酸序列的抗原 性分析建立了特異性、靈敏性和可重復(fù)性良好的間接ELISA方法，可用于臨床上PEDV抗體水 平的監(jiān)測(cè)和PED流行病學(xué)調(diào)查;滿坤等以玉米為生物反應(yīng)器，將PEDV主要中和抗原表位C0E 基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，獲得了高效表達(dá)PEDV-C0E的轉(zhuǎn)基因玉米穩(wěn)定株系，表達(dá)產(chǎn)物具有 顯著的免疫原性;楊蓉將擴(kuò)增出的長(zhǎng)度501bp的C0E抗原表位克隆入pET32a表達(dá)載體中，經(jīng) 誘導(dǎo)表達(dá)獲得了純度較高的重組蛋白；董麗娜等將PEDV-C0E抗原基因與乳酸乳球菌表面表 達(dá)載體PNZ8149連接后，電擊轉(zhuǎn)入食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)后PEDV部分S蛋 白成功表達(dá)，并具有反應(yīng)原性。在預(yù)防和治療PED方面，研究主要集中在滅活疫苗、弱毒疫 苗、核酸疫苗和聯(lián)苗，如CN103060325A公開的抗豬流行性腹瀉病毒PEDV的反義核酸及肽核 酸PNA，CN104383528A公開的豬流行性腹瀉滅活疫苗及其制備方法，CN104353069A公開的可 口服的豬流行性腹瀉病毒亞單位疫苗的制備方法，CN104248762A公開的豬流行性腹瀉疫苗 組合物及其制備方法和應(yīng)用，等等。
[0003] 然而，現(xiàn)有手段均需要依賴刺激豬的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，而新生仔豬 的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，不能針對(duì)PEDV產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，主動(dòng)免疫并不能保護(hù)仔豬 的PEDV感染，這使得被動(dòng)免疫在該病的防治中成為關(guān)鍵。如CN104788561A公開的抗豬傳染 性胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體及其制備方法，CN105412923A公開的用于治療 仔豬流行性腹瀉的卵黃抗體口服劑及其制備方法，CN105440132A公開的抗豬流行性腹瀉病 毒N蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用，CN103705918A公開的抗豬流行性腹瀉病毒高免血清及其 制備方法，等等。
[0004] 單鏈抗體(signal chain fragment，scFv)是一種基因工程產(chǎn)品，其原理是利用基 因重組的方法，將特異性抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)連接起來，形成一條多肽鏈，具有結(jié)合特 異性抗原乃至中和病毒的能力。另外，F(xiàn)c段還可決定動(dòng)物的種屬特異性，如人源化單鏈抗體 在狂犬病防控中的應(yīng)用。將scFv與不同動(dòng)物源Ig的Fc段結(jié)合，有助于二聚體的形成，不僅可 以延長(zhǎng)scFv-Fc在體內(nèi)的半衰期，而且可以激活補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒反應(yīng)(CDC)，與Fc受體結(jié)合 可以激活抗體依賴細(xì)胞毒反應(yīng)(ADCC)以及通過與Fc新生受體結(jié)合控制IgG的分解代謝，通 過ADCC和CDC效應(yīng)，吞噬免疫復(fù)合物介導(dǎo)抗原遞呈，釋放細(xì)胞因子和促炎癥因子。
[0005] 目前，國(guó)內(nèi)外嵌合抗體的研究熱點(diǎn)主要集中在人源化的單鏈抗體構(gòu)建，已有商品 化的含人抗體恒定區(qū)Fc段的表達(dá)載體，如InvivoGen的pFUSE-hlgGl-Fcl，就是將人類免疫 球蛋白IgGl的Fc段構(gòu)建成表達(dá)載體，通過將單鏈抗體scFv克隆入載體相應(yīng)位點(diǎn)，經(jīng)表達(dá)產(chǎn) 生scFv和Fc融合的重組抗體。關(guān)于人源化單鏈抗體已有諸多報(bào)道，而豬源化或其他種屬的 類似表達(dá)載體尚未有商品化產(chǎn)品，也鮮有類似的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體。
[0007] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體的制備方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] 抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體，其重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 1所 示，輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 所述抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體還包括豬抗體恒定區(qū)Fc段基因序列，其 序列如SEQ ID N0.3所示。
[0011] 具體的，重鏈可變區(qū)基因序列與輕鏈可變區(qū)基因序列由連接肽linker序列連接， 其序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012] 抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)構(gòu)建 BL21/pET28a-scFv_Fc
[0014] 利用限制性內(nèi)切酶SacI和Sail分別對(duì)載體pET28a和合成序列scFv-Fc(如SEQ ID NO.6所示，該序列帶有SacI、SalI酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，電泳后膠回收目的片段，連接后轉(zhuǎn) 化BL21(DE3)，經(jīng)鑒定得到BL21/pET28a-scFv-Fc ;
[0015] 2)制備豬源化單鏈抗體scFv-Fc
[0016] 取BL21/pET28a-scFv-Fc擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，即得。
[0017] 步驟1)中雙酶切可采用分步法雙酶切，第一步酶切的反應(yīng)體系為：10unitsAiL SacI lyL，10 XL Buffer 2yL，合成序列scFv-Fc或載體pET28a lyg，dH20補(bǔ)足20yL，37°C溫 育2h;回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行第二步酶切，酶切反應(yīng)體系為：10unitsAiL Sail lyL，10XH Buffer 2yL，酶切產(chǎn)物lyg，dH20補(bǔ)足20yL，37 °C溫育2h。
[0018] 步驟2)中誘導(dǎo)采用IPTG，其終濃度為0.6mM，誘導(dǎo)溫度37°C，時(shí)間8小時(shí)。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 目前，豬流行性腹瀉病毒的防治仍缺乏合適有效的防疫方法，在自然狀態(tài)下，PEDV 通過消化道感染小腸粘膜，這也就說明分泌型的免疫球蛋白對(duì)于預(yù)防該病毒的感染具有重 要作用。為保護(hù)仔豬免受PEDV的感染，利用母乳提供被動(dòng)免疫是一種有效的手段，然而為獲 得有效的母乳，如何接種抗原刺激母豬產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體就成為了關(guān)鍵點(diǎn)。但不幸的是， 在國(guó)內(nèi)這種方法并不都能有效防止病毒感染。結(jié)合當(dāng)下豬流行性腹瀉病的流行趨勢(shì)，單鏈 抗體能表現(xiàn)出較高的病毒結(jié)合活性，使得新型抗體藥物的研制成為新的研究方向。針對(duì) PEDV單鏈抗體的研究在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，究其原因有三個(gè)方面，其一，該病毒在流行過程中常 常出現(xiàn)變異，其二，該病毒的分離較為困難，其三，該病毒的抗體基因尚未公布，這也就造成 在研究該病毒相應(yīng)抗體的過程中出現(xiàn)較大的困難和盲點(diǎn)。
[0021] 本發(fā)明利用多對(duì)引物，篩選出抗PEDV抗體的可變區(qū)基因，利用基因工程手段在體 外將VH和VL進(jìn)行重組，包含通用連接肽[(Gly)4Ser]3,構(gòu)建成VH-[(Gly)4Ser]3-VL;與此同 時(shí)，從豬脾臟中擴(kuò)增出豬抗體恒定區(qū)Fc，與scFv構(gòu)建成為嵌合抗體，長(zhǎng)度為1128bp，翻譯成 多肽鏈的分子量約為40kDa左右，是天然免疫球蛋白的1/4,分子量的減小可以提高其在組 織間的穿透性。根據(jù)E1 i sa結(jié)果初步判斷原核表達(dá)的豬源化嵌合單鏈抗體s cFv-Fc可以對(duì) PEDV進(jìn)行識(shí)別，這就為發(fā)揮Fc段的功能奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0022] 圖1為pET28a和scFv-Fc雙酶切電泳圖；
[0023] 圖2為不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果；
[0024] 圖3為不同誘導(dǎo)時(shí)間SDS-PAGE結(jié)果；
[0025] 圖4為不同誘導(dǎo)溫度SDS-PAGE結(jié)果；
[0026]圖5為鎳柱洗脫曲線；
[0027]圖6為目的蛋白透析流程圖；
[0028]圖7為Elisa鑒定單鏈抗體scFv-Fc與PEDV的結(jié)合活性；
[0029] 圖8為pET28a-scFv_Fc載體的構(gòu)建流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體，其基因序列結(jié)構(gòu)為VH-Linker-1-Fc，序列 如SEQ ID N0.5所示，其中重鏈可變區(qū)基因序列Vh如SEQ ID NO. 1所示，連接肽linker序列 如SEQ ID N0.4所示，輕鏈可變區(qū)基因序列VL如SEQ ID N0.2所示，豬抗體恒定區(qū)Fc段基因 序列如SEQ ID N0.3所示。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0035] 1)構(gòu)建 BL21/pET28a-scFv_Fc
[0036] 包含有重鏈可變區(qū)基因序列VH(如SEQ ID NO. 1所示）、連接肽linker序列（如SEQ ID NO.4所示）、輕鏈可變區(qū)基因序列VL(如SEQ ID NO.2所示）、豬抗體恒定區(qū)Fc段基因序列 (如SEQ ID N0.3所示）以及5 '端酶切位點(diǎn)SacI和3 '端酶切位點(diǎn)SalI的scFv-Fc序列由上海 生工生物工程股份有限公司合成，序列如SEQ ID N0.6所示。
[0037] 利用限制性內(nèi)切酶SacI和Sail分別對(duì)載體pET28a和合成序列scFv-Fc進(jìn)行分步法 雙酶切，分步法雙酶切體系為：1此SacI(10units/yL)，2yL 10XL Buffer，lyg合成序列 scFv-Fc或載體pET28a，dH20補(bǔ)足20yL，37°C溫育2h;隨后用DNA純化試劑盒回收，進(jìn)行下一 步酶切，體系為：lyL SalI(10unitsAiL)，2yL 10XH 8虹€66 1以8上步酶切產(chǎn)物，(1!120補(bǔ)足 20yL，37°C溫育2h，l%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段（電泳圖見圖1，圖中Ml為 DL5000Marker，M2 為DL2000Marker，l 為pET28a雙酶切，2 為 scFv-Fc合成序列雙酶切），將目 的基因 scFv-Fc定向克隆至pET28a，連接體系為：2yL pET28a酶切產(chǎn)物(5358bp)，lyL合成序 列scFv-Fc酶切產(chǎn)物（約 1130bp)，lyL T4DNA Ligase(350units/yL)，lyL 10XT4DNA Ligase Buffer，dH20補(bǔ)足ΙΟμΜ連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取單克隆并進(jìn)行菌液PCR和酶 切鑒定，保存陽性單克隆，命名為BL21/pET28a-scFv-Fc。
[0038] 2)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
[0039] 將BL21/pET28a-scFv-Fc按照1%接種量接種至卡納青霉素抗性LB培養(yǎng)基中，37 °C、220rpm搖床培養(yǎng)過夜;次日，將過夜培養(yǎng)物按照3 %接種量接種至卡納青霉素抗性LB培 養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖床培養(yǎng)3.5小時(shí)（3~4小時(shí)均可），待0D6QQ達(dá)到0.7時(shí)（0.6~0.8均 可），加入IPTG使其終濃度為0.6mM，37 °C、220rpm搖床培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)，8000rpm離心 lOmin收集菌體。不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果見圖2,圖中Μ為低分子量蛋白 Marker，1 為BL21/pET28a 誘導(dǎo)，2為BL21/pET28a-scFv-Fc未誘導(dǎo)，3 ~9為BL21/pET28a-scFv-Fc分別在0 · 2mM、0 · 4mM、0 · 6mM、0 · 8mM、1 · OmM、1 · 2mM、1 · 4mM IPTG濃度下誘導(dǎo)。不同誘 導(dǎo)時(shí)間SDS-PAGE結(jié)果見圖3,圖中M為低分子量蛋白marker，l為BL21/pET28a誘導(dǎo)，2為BL21/ pET28a_scFv_Fc 未誘導(dǎo)，3~9 為pET28a_scFv_Fc 誘導(dǎo)211、411、511、611、711、811、911。不同誘導(dǎo)溫 度SDS-PAGE結(jié)果見圖4,圖中Μ為低分子量蛋白marker，l為BL21/pET28a誘導(dǎo)，2~4為BL21/ pET28a-scFv-Fc在25°C、30°C、37°C分別誘導(dǎo)。
[0040] 3)目的蛋白的檢測(cè)及純化
[00411用對(duì)上步中收集的菌體進(jìn)行兩次洗滌，隨后加入超聲緩沖液(50mM Tris-HCl， ImM EDTA，150mM NaCl，0.5%(w/v)Triton-X 100，pH 8.0)，冰上超聲破碎，4°C、12000rpm 離心30min，分別取未誘導(dǎo)全菌、誘導(dǎo)后全菌、破碎后上清和破碎后沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳 檢測(cè)，結(jié)果表明該蛋白以包涵體形式表達(dá)。
[0042] 取破碎后收集的沉淀，加入包涵體洗滌液（50mM Tris-HCl，lmM EDTA，150mM NaCl，2M Urea，l%(w/v)Triton-X 100，pH 8.0)洗滌兩次，隨后向其中加入包涵體溶解液 (50mM Tris-HCl，lmM EDTA，150mM NaCl，8M Urea，l%(w/v)Triton-X 100，pH 8.0)，室溫 放置1小時(shí)，4°C、12000rpm離心30min收集上清，過鎳柱進(jìn)行親和層析純化，隨后向柱中加入 平衡buffer(100mM NaH2P〇4，10mM Tris-HC1，8M Urea，pH 8.0)，直至A280接近0,向柱中加 入一個(gè)柱體積的洗滌buffer(100mM NaH2P〇4，10mM Tris-HCl，10mM咪唑，8M Urea，pH 8.0)， 洗滌未結(jié)合蛋白質(zhì)，隨后向其中加入30ml洗脫buffer(100mM NaH2P〇4，10mM Tris-HCl， 250mM咪唑，8M Urea，pH 8.0)，收集洗脫液，每管lml;利用BCA法測(cè)定30管洗脫液的蛋白濃 度，制作洗脫曲線(見圖5 )，根據(jù)洗脫曲線確定第2、3、4管為有效洗脫液。
[0043] 4)目的蛋白的透析及超濾
[0044] 目的蛋白透析流程見圖6;收集透析袋中蛋白溶液，將蛋白溶液加入超濾管柱子， 將超濾管放入離心機(jī)，4°C、15000g離心，離心時(shí)間根據(jù)柱子上余留蛋白溶液體積來確定;離 心約5min后柱子上余留蛋白體積達(dá)到預(yù)期體積，此時(shí)終止超濾操作，將每個(gè)超濾管中的蛋 白溶液移入新的1.5ml離心管，此即為最后純化復(fù)性scFv-Fc蛋白，經(jīng)過BCA法測(cè)定蛋白濃 度，達(dá) 0.72mg/ml。
[0045] 試驗(yàn)例
[0046] Elisa鑒定單鏈抗體scFv-Fc與PEDV的結(jié)合活性：
[0047] 1)包被抗原：用包被緩沖液將抗原（PEDV和PRV) 1:100稀釋，加入酶標(biāo)板（100μΙ/ 孔），同時(shí)設(shè)置不包被抗原的對(duì)照孔，將酶標(biāo)板放置在37°C濕盒中孵育lh，隨后放入4°C過 夜；第二天取出，甩干包被液，用浸泡洗滌法洗滌酶標(biāo)孔，加滿PBST后立即甩干，隨后加入 300μ1/孔的PBST，脫色搖床上浸泡2min，甩干，重復(fù)3遍；
[0048] 2)封閉：每孔加入300μ1封閉液，放入37 °C濕盒中孵育2h，浸泡洗滌法洗滌酶標(biāo)孔；
[0049] 3)加待檢樣品：用封閉液對(duì)待檢重組scFv蛋白作倍比稀釋，稀釋后的豬陽性血清 為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔(未免疫豬血清)和空白孔，每孔加入1〇〇μ1，37Γ濕盒中 孵育lh，浸泡洗滌法洗滌酶標(biāo)孔；
[0050] 4)加酶標(biāo)二抗：用封閉液對(duì)HRP anti-labeled 6 X His進(jìn)行稀釋，稀釋度為1: 2000，每孔加入100μΙ，37°C避光孵育lh，浸泡洗滌法洗滌酶標(biāo)孔；
[0051 ] 5)顯色：將TMB底物顯色試劑盒中A和B按照1:100混合成工作液，每孔加底物顯色 工作液100μ1，37Γ避光孵育15-30min，直至顯色至預(yù)期深淺；
[0052] 6)終止反應(yīng):每孔加 100μΙ終止液（1M H2S〇4)，孔中溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色；
[0053] 7)讀數(shù):終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)，在酶標(biāo)儀上450nm讀取各孔溶液的吸光值；
[0054] 8)結(jié)果判定：當(dāng)陽性對(duì)照孔0D450值彡1.0、陰性對(duì)照孔0D450值〈0.2且P/N>2.0時(shí)， 試驗(yàn)成立(如圖7所示）。
[0055] 注：P/N=(待檢樣品孔0D45Q值一空白孔0D45Q值）/(陰性對(duì)照孔0D45Q值一空白孔 OD450值）。
[0056] 初構(gòu)建pET28a-scFv-Fc表達(dá)載體的技術(shù)簡(jiǎn)介：
[0057]本發(fā)明采用兩套不同的方法獲得基因序列的scFv，一方面通過抗PEDV的雜交瘤細(xì) 胞中獲得，即從抗PEDV雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板，采用PCR方 法擴(kuò)增重鏈、輕鏈可變區(qū)基因，通過連接肽將VH和VL基因連接起來得到單鏈抗體基因 scFv; 另一方面，先用原核系統(tǒng)表達(dá)PEDV的抗原中和表位S1蛋白，然后將該重組蛋白免疫小鼠，提 取免疫小鼠脾臟的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，利用PCR方法擴(kuò)增抗體V H序列和I 序列。與此同時(shí)，提取豬脾細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄全套cDNA，以此為模板，利用特異性引物擴(kuò)增 抗體Fc序列。通過S0E-PCR方法拼接得到單鏈抗體scFv-Fc，該基因全長(zhǎng)1128bp，包含366bp 重鏈可變區(qū)，354bp輕鏈可變區(qū)，45bp連接序列（Gly4Ser)3，363bp豬抗體Fc段。合成帶有 SacI、SalI酶切位點(diǎn)的scFv-Fc序列（如SEQIDN0.6所示），利用限制性內(nèi)切酶SacI和Sal I分別對(duì)表達(dá)載體pET28a和合成序列scFv-Fc雙酶切，電泳后膠回收目的片段，將目的基因 scFv-Fc定向克隆至pET28a，得到pET28a_scFv_Fc。載體構(gòu)建流程示意圖見圖8。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體，其特征在于：其重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 1所示，輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于:還包括豬抗體恒定區(qū)Fc段基因序列， 其序列如SEQ ID NO.3所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單鏈抗體，其特征在于:重鏈可變區(qū)基因序列與輕鏈可變區(qū)基 因序列由連接肽linker序列連接，其序列如SEQ ID NO.4所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的單鏈抗體，其特征在于:其基因序列如SEQ ID NO.5所示。5. 抗豬流行性腹瀉病毒豬源化單鏈抗體的制備方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 構(gòu)建 BL21/pET28a-scFv-Fc 利用限制性內(nèi)切酶SacI和Sail分別對(duì)載體pET28a和合成序列scFv-Fc進(jìn)行雙酶切，電 泳后膠回收目的片段，連接后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)鑒定得到BL21/pET28a-scFv-Fc; 合成序列scFv-Fc如SEQ ID NO.6所示； 2) 制備豬源化單鏈抗體scFv-Fc 取BL21/pET28a-scFv-Fc擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，即得。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:步驟1)中雙酶切為分步法雙酶切，第 一步酶切的反應(yīng)體系為：lOunits/yL SacI lyL，10 XL Buffer 2yL，合成序列scFv-Fc或載 體pET28a Iyg，dH20補(bǔ)足20yL，37°C溫育2h;回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行第二步酶切，酶切反應(yīng)體 系為：IOunitsAxL Sail IyL，10 XH Buffer 2yL，酶切產(chǎn)物Iyg，ClH2O補(bǔ)足20yL，37°C溫育 2h〇7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：步驟2)中誘導(dǎo)采用IPTG，其終濃度為 0.6mM，誘導(dǎo)溫度37°C，時(shí)間8小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105906712SQ201610502893
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】楊國(guó)慶, 劉慧敏, 常洪濤, 宋曉峰
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)