一種生物秸稈腐熟劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物秸稈腐熟劑及其制備方法，具體說，是一種以真菌、細(xì)菌為原料的生物秸稈腐熟劑及其生產(chǎn)方法。所述生物秸稈腐熟劑選用長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌、解淀粉類芽孢桿菌、白球擬酵母，作為復(fù)合菌種組配，主要產(chǎn)生纖維素分解酶、半纖維素分解酶、木質(zhì)素分解酶，菌種之間，具有良好的共生、互生作用，沒有拮抗作用。使用時，待作物秸稈(小麥、玉米、水稻)粉碎散于地面后，將腐熟劑均勻撒于田間，1hm2用量30kg，然后秸稈和腐熟劑一同翻入地下。
【專利說明】一種生物秸稈腐熟劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種有機物料腐熟劑，具體說，是一種以真菌、細(xì)菌為原料的生物秸桿腐熟劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中會產(chǎn)生大量農(nóng)作物秸桿，這些秸桿以玉米、小麥、水稻、棉花等大田作物秸桿為主。上世紀(jì)80年代以前，秸桿通常被農(nóng)民運回家作為生活燃料，或是被用于造紙，田間不會有大量秸桿存在。近年，由于生活水平的提高，農(nóng)民的生活能源逐漸被電力、天然氣和液化石油氣所取代，農(nóng)民不再需要把秸桿運回家作為生活燃料。大量存在于田間的作物秸桿反而成為農(nóng)民生產(chǎn)生活中的負(fù)擔(dān)。很多農(nóng)民為節(jié)約人力物力直接在田間把作物秸桿進行焚燒，產(chǎn)生大量濃煙，造成大量的環(huán)境污染，污染空氣，影響附近的機場航班起降、公路尤其是高速公路的正常交通。
[0003]一直以來，國家注重節(jié)約與環(huán)保，制定各項惠農(nóng)政策，鼓勵群眾實施秸桿就地還田，增肥地力。但秸桿就地還田后，由于其自然腐熟慢，影響下一茬作物的播種、生長。所以，群眾意愿不高，因此，急需一種促進秸桿加速分解的產(chǎn)品來解決上述問題。
[0004]各類農(nóng)作物秸桿雖然存在一定差異，但其主要成分都是由纖維素(多糖類大分子物質(zhì))、半纖維素和木質(zhì)素(高分子芳香族化合物)組成，簡稱為“三素”，“三素”的特點是分子量大(幾萬至千萬)、結(jié)構(gòu)緊密有序(有晶體和非晶體區(qū))、抗分解力強(非常穩(wěn)定)，又因多數(shù)作物秸桿的表面還存在大量蠟質(zhì)層，更增加了秸桿的分解難度?？梢姡菇諚U腐解的確是一件不易之事。需要能夠產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶的多種微生物共同參與，進行逐步有序的接力分解過程，才能完成秸桿“三素”的腐解。
[0005]微生物是產(chǎn)生“三素酶”的主要來源，在秸桿腐熟降解過程中發(fā)揮巨大的作用。秸桿腐熟的原理就是利用微生物產(chǎn)生的酶來加快分解秸桿中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，使其轉(zhuǎn)化為小分子有機物，進而轉(zhuǎn)化成能使作物吸收利用的養(yǎng)分，歸還土壤之中，實現(xiàn)土壤養(yǎng)分提升。
[0006]秸桿腐熟劑是篩選出能分解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的微生物菌株，通過微生物復(fù)合技術(shù)處理工藝，將這些菌株有效的組合在一起，而形成產(chǎn)品。應(yīng)用秸桿腐熟劑加速秸桿快速腐解，是實現(xiàn)秸桿直接還田不可或缺的有效措施。
[0007]目前，對于秸桿腐熟劑的研究正在興起，市場上銷售的秸桿腐熟劑和部分已申請的秸桿腐熟劑發(fā)明專利因不同原因，不同程度存在著不少欠缺，如:
[0008]1、現(xiàn)在生產(chǎn)的大多數(shù)秸桿腐熟劑都是針對畜禽糞便、農(nóng)家肥、秸桿或是其中兩種或三種混合物料在堆置條件下加快其分解而研制的產(chǎn)品，這些腐熟劑產(chǎn)品一是含菌量低、酶活數(shù)量少，二是厭氧菌發(fā)揮作用大。而就地還田多是秸桿是在有氧條件下進行分解。所以這些腐熟劑用在秸桿直接還田的腐熟，達不到實際生產(chǎn)所需要的標(biāo)準(zhǔn)。
[0009]2、部分產(chǎn)品菌種單一。很多產(chǎn)品為降低成本，只考慮菌株的生產(chǎn)制造成本和生產(chǎn)工藝的簡單可操作性，這種情況最常見的是單一使用某一種菌種，如:單一使用枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌是一種細(xì)菌，是目前生產(chǎn)工藝最熟練，價格最低，使用最多的可以分解纖維素和木質(zhì)素的常用菌。但單一使用這種細(xì)菌，受外界溫度、濕度等條件的影響的作用較大，菌的活性極易降低，造成秸桿分解速度減緩，腐熟效果不理想。
[0010]3、有的產(chǎn)品雖然幾個菌種配合，但細(xì)菌在其中占的比例較多，真菌相對較少。主要是因為真菌的制造和保存工藝較為復(fù)雜，而對于秸桿的有機成分來說，真正起分解作用的主要是真菌類。真菌含量少，會造成秸桿粉碎還田后腐熟的效果差。[0011]4、有的雖然真菌、細(xì)菌、放線菌、酵母菌配合，但并沒有考慮到各個菌種之間存在的抑制、共生、互生等影響。由于分解秸桿的“三素酶”是多酶體系，酶組分之間存在著明顯的協(xié)同作用，多菌株的配合、補充、才能促進物質(zhì)分解，雖然多菌種聯(lián)合效應(yīng)高于一個單一菌種，但必須指出的是:多個菌種的作用并不是多個菌種簡單效應(yīng)的算術(shù)加和，所以，應(yīng)該注意各個菌種之間相互的抑制作用的強弱。細(xì)菌和真菌之間具有比較強的相互作用，部分放線菌本身就有殺滅真菌和細(xì)菌的功能，放到組分中，只能降低組合的分解速度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是，為解決現(xiàn)有秸桿腐熟菌劑技術(shù)的不足，而提供一種快速促進農(nóng)作物秸桿粉碎后還田的生物腐熟劑及制備方法。
[0013]為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種生物秸桿腐熟劑，以長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌、解淀粉類芽孢桿菌和白球擬酵母作為復(fù)合菌種組配，使腐熟劑的有效活菌數(shù):長柄木霉2~10億個/g、土曲霉2~10億個/g、黃孢平革菌2~10億個/g、解淀粉類芽孢桿菌2~10億個/g、白球擬酵母2~10億個/g。
[0014]上述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0015](I)制備長柄木霉發(fā)酵物、土曲霉發(fā)酵物、黃孢平革菌發(fā)酵物、解淀粉類芽孢桿菌液、白球擬酵母菌液；其中:長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌，先進行液體發(fā)酵，再進行固體發(fā)酵；解淀粉類芽孢桿菌、白球擬酵母只進行液體發(fā)酵；
[0016]所述液體發(fā)酵過程:菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)；
[0017]所述固體發(fā)酵過程:清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)；
[0018](2)按比混合:根據(jù)混合罐的容積，以麥麩為載體,加入步驟(1)制備的長柄木霉發(fā)酵物，土曲霉發(fā)酵物，黃孢平革菌發(fā)酵物，解淀粉類芽孢桿菌液，白球擬酵母菌液，加入蒸餾水，混合后攪拌，使腐熟劑的有效活菌數(shù):長柄木霉2~10億個/g、土曲霉2~10億個/g、黃孢平革菌2~10億個/g、解淀粉類芽孢桿菌2~10億個/g、白球擬酵母2~10億個/g ;
[0019](3)鏈條粉碎，分級過篩，機械包裝，成品入庫。
[0020]具體說明如下:
[0021]所述制備長柄木霉發(fā)酵物:長柄木霉一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)一清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)，具體地步驟如下:
[0022]I)菌種斜面
[0023]將凍干的長柄木霉菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ；
[0024]2)三角瓶培養(yǎng)[0025]培養(yǎng)基制備:將瓊脂加熱溶化后，用0.lmol/L氫氧化鈉或0.lmol/L鹽酸調(diào)pH值5.0~5.2，然后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1 IMPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面?zhèn)溆?
[0026]菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔,置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于25~26°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于28~30°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用；
[0027]3)種子罐培養(yǎng)
[0028]培養(yǎng)基配方:玉米粉食品級，120目，1.0%;淀粉食品級，120目，2.0%;中溫豆柏粉食品級，120目，2.0%;魚粉食品級，120目，0.6%;玉米漿生物級，120目，0.5%;玉米秸桿飼料級120目，3.0%;硫酸亞鐵分析級，0.1%;硫酸錳分析級，0.1%;磷酸二氫鉀分析級，0.1%；硫酸鎂分析級，0.05%;硫酸銅分析級，0.05%;硫酸銨分析級，0.05%;泡敵食品級，0.05%;pH值5.0~5.2，所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；
[0029]空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0030]種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ；
[0031]種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種；
[0032]種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為IOX 150CFU/ml，將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至25°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)；
[0033]種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為25~26°C，壓力在0.05MPa，通氣量1: 0.8和攪拌速度120r/min條件下，培養(yǎng)18~24h，所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0034]種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵；
[0035]合格指標(biāo):菌體生長整齊，菌絲成簇或多數(shù)為菌絲團；
[0036]4)發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0037]發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0038]發(fā)酵罐投料:配比同種子發(fā)酵液，投料量不超過罐容積的70% ；
[0039]發(fā)酵罐滅菌實消:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種； [0040]發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度100~120r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1:0.4~0.5，以后逐漸增大至1:0.8。一般發(fā)酵周期為72~96h，在厚垣孢子大量形成時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0041]發(fā)酵罐檢測:投料后6h開始，每隔4h取樣一次檢測，至48h后，間隔期縮短為2h ；
[0042]放罐標(biāo)準(zhǔn):厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;雜菌量≥0.3% ；
[0043]5)清潔發(fā)酵室[0044]將發(fā)酵室地面及空間清理干凈，拌料場內(nèi)拌料機、鏈條、皮帶輸送機清洗干凈，晾干；拌料場周圍打掃干凈，工器具清洗晾干；將場地、設(shè)備用漂白粉上清劑噴灑消毒，靜置30min ；
[0045]6)備料
[0046]將種液運入拌料場，按質(zhì)量比麥麩:種液=10:3的比例運入麥麩；
[0047]7)投料混合
[0048]根據(jù)拌料機的生產(chǎn)能力，按照生產(chǎn)工藝要求和配料比，把菌種和麥麩加入到拌料機，攪拌5min ;把混勻的原料放于皮帶傳送機,進入同時開啟的鏈條粉碎機粉碎；粉碎均勻的濕料經(jīng)皮帶傳送機進入裝袋程序，扎口 ；
[0049]8)保溫培養(yǎng)
[0050]預(yù)先將發(fā)酵室及地面溫度保持在25°C以上，料袋單排碼放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保證發(fā)酵均勻。
[0051]所述制備土曲霉發(fā)酵物:土曲霉一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)一清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)，具體地步驟如下:
[0052]I)菌種斜面
[0053]將凍干的土霉菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28 ~30°C，培養(yǎng) 36 ~40h ；
[0054]2)三角瓶培養(yǎng)
[0055]培養(yǎng)基制備:去皮的馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml煮沸30min濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000ml，加`葡萄糖20g，溶化后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1IMPa壓力下滅菌30min,冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫?br> [0056]菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔,置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于25~26°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于26~28 °C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用；
[0057]3)種子罐培養(yǎng):
[0058]培養(yǎng)基配方:蔗糖2%，地瓜汁2%，蛋白胨2%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.3%，pH值5.0~5.2 ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；
[0059]空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0060]種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ；
[0061]種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種；
[0062]種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10X150CFU/ml ;將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至25°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)；
[0063]種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為25~26°C，壓力在0.05MPa，通氣量1: 0.8和攪拌速度120r/min條件下，培養(yǎng)18~24h，所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；[0064]種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵；
[0065]合格指標(biāo):菌體生長整齊，菌絲成簇或多數(shù)為菌絲團；
[0066]4)發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0067]發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0068]發(fā)酵罐投料:配比同種子發(fā)酵液，投料量不超過罐容積的70% ；
[0069]發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種；
[0070]發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度100~120r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.4~0.5);以后逐漸增大至1: 0.8，一般發(fā)酵周期為72~96h，在厚垣孢子大量形成時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0071]發(fā)酵罐檢測:投料后6h開始，每隔4h取樣一次檢測，至48h后，間隔期縮短為2h ；
[0072]放罐標(biāo)準(zhǔn):厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;雜菌量≤0.3% ；
[0073]5)清潔發(fā)酵室
[0074]將發(fā)酵室地面及空間清理干凈，拌料場內(nèi)拌料機、鏈條、皮帶輸送機清洗干凈，晾干；拌料場周圍打掃干凈，工器具清洗晾干；將場地、設(shè)備用漂白粉上清劑噴灑消毒，靜置30min ；
[0075]6)備料
[0076]將種液運入拌料場，按麥麩:種液=10:3的比例運入麥麩；
[0077]7)投料混合
[0078]根據(jù)拌料機的生產(chǎn)能力，按照生產(chǎn)工藝要求和配料比，把菌種和麥麩加入到拌料機，攪拌5min ;把混勻的原料放于皮帶傳送機,進入同時開戶的鏈條粉碎機粉碎,粉碎均勻的濕料經(jīng)皮帶傳送機進入裝袋程序，扎口 ；
[0079]8)保溫培養(yǎng)
[0080]預(yù)先將發(fā)酵室及地面溫度保持在25°C以上；將料袋單排碼放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保證發(fā)酵均勻。
[0081]所述制備黃孢平革菌發(fā)酵物:黃孢平革菌一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)一清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)，具體地步驟如下:
[0082]I)菌種斜面
[0083]將凍干的黃孢平革菌菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ；
[0084]2)三角瓶培養(yǎng)
[0085]培養(yǎng)基:去皮的馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml煮沸30min濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000ml，加葡萄糖20g，溶化后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1 IMPa壓力下滅菌30min,冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫?br> [0086]菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔,置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于25~26°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于27~28 °C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用；
[0087]3)種子罐培養(yǎng):
[0088]培養(yǎng)基配方:葡萄糖1%，磷酸二氫鉀0.2%，酒石酸銨0.02%,氯化鈣0.001%,硫酸鎂0.025%,維生素B10.0001%,七水硫酸銅0.008%,七水硫酸鋅0.004%, pH值5.0~5.2 ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；
[0089]空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0090]種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ；
[0091]種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種；
[0092]種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為IOX 150CFU/ml，將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至25°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)；
[0093]種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為25~26°C，壓力在0.05MPa，通氣量1: 0.8和攪拌速度120r/min條件下，培養(yǎng)18~24h，所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0094]種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵；
[0095]合格指標(biāo):菌 體生 長整齊，菌絲成簇或多數(shù)為菌絲團；
[0096]4)發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0097]發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0098]發(fā)酵罐投料:配比同種子發(fā)酵液。投料量不超過罐容積的70% ；
[0099]發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種；
[0100]發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度100~120r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.4~0.5)，以后逐漸增大至1: 0.8，一般發(fā)酵周期為72~96h，在厚垣孢子大量形成時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0101]發(fā)酵罐檢測:投料后6h開始，每隔4h取樣一次檢測，至48h后，間隔期縮短為2h ；
[0102]放罐標(biāo)準(zhǔn):厚垣孢子含量≤4X150CFU/ml;雜菌量≤0.3% ；
[0103]5)清潔發(fā)酵室
[0104]將發(fā)酵室地面及空間清理干凈，拌料場內(nèi)拌料機、鏈條、皮帶輸送機清洗干凈，晾干；拌料場周圍打掃干凈，工器具清洗晾干；將場地、設(shè)備用漂白粉上清劑噴灑消毒，靜置30min ；
[0105]6)備料
[0106]將種液運入拌料場，按麥麩:種液=10:3的比例運入麥麩；
[0107]7)投料混合
[0108]根據(jù)拌料機的生產(chǎn)能 力，按照生產(chǎn)工藝要求和配料比，把菌種和麥麩加入到拌料機，攪拌5min ;把混勻的原料放于皮帶傳送機,進入同時開戶的鏈條粉碎機粉碎,粉碎均勻的濕料經(jīng)皮帶傳送機進入裝袋程序，扎口 ；
[0109]8)保溫培養(yǎng)
[0110]預(yù)先將發(fā)酵室及地面溫度保持在25°C以上；將料袋平躺于地面，單排碼放；隔4h，倒垛，料袋揉搓，保證發(fā)酵均勻。
[0111]所述制備解淀粉類芽孢桿菌液:解淀粉類芽孢桿菌一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體地步驟如下:
[0112]I)菌種斜面
[0113]將凍干的解淀粉類芽孢桿菌菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ；
[0114]2)三角瓶培養(yǎng)
[0115]培養(yǎng)基制備:LB培養(yǎng)基，酵母膏5g;瓊脂2%;NACL10g;蛋白胨IOg;蒸餾水1000ml ；PH7.0 ;分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1lMPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫?br> [0116]菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔,置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于20°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于20°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用；
[0117]3)種子罐培養(yǎng)
[0118]培養(yǎng)基配方:花生餅粉0.5%，魚粉0.3%，玉米漿0.5%，葡萄糖0.3%，泡敵0.3% ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為`蒸餾水；
[0119]空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0120]種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ；
[0121]種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種；
[0122]種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10X150CFU/ml ;并在80°C恒溫水浴中處理30min ;將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至30°C的種子罐內(nèi)進行
培養(yǎng)；
[0123]種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為28~301:，壓力在0.0510^，通氣量1:1和攪拌速度220r/min條件下，培養(yǎng)8~IOh,所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0124]種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵；
[0125]合格指標(biāo):菌體生長整齊，處于對數(shù)生長期，含菌量2X 150CFU/ml，無雜菌污染；
[0126]4)發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0127]發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0128]發(fā)酵罐投料:花生餅粉2.0%，魚粉0.3%，玉米漿1.8%，糊精0.5%，硫酸鎂0.075%,碳酸鈣0.5%，磷酸二氫鉀0.04%，泡敵0.05%, pH值7.0~7.5，所述百分比為質(zhì)量體積百分t匕，溶劑為蒸餾水；投料量不超過罐容積的70% ；[0129]發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種；
[0130]發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度180~200r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.7~0.8);以后逐漸增大至1:1 ;一般發(fā)酵周期為18~24h，在芽孢大量形成、個別芽孢大量脫落時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0131]發(fā)酵罐檢測:投料后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，至18h后，間隔期縮短為Ih ；
[0132]放罐標(biāo)準(zhǔn):芽孢含量≥70% ;含菌量≥50X150CFU/ml;雜菌量≥0.3%。
[0133]所述制備白球擬酵母菌液:白球擬酵母一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)—發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體地步驟如下:
[0134]I)菌種斜面
[0135]將凍干的白球擬酵母菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ；
[0136]2)三角瓶培養(yǎng)
[0137]培養(yǎng)基制備:12波美度麥芽技100ml，瓊脂2.0%:將瓊脂加熱溶化后，用0.lmol/1氫氧化鈉或0.l%mol/l鹽酸調(diào)pH值5.0~6.0 ;然后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1lMPa壓力下滅菌30min,冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫?br> [0138]菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔,置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于26~28°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于26~28 °C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24~28h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，菌體大小一致的，放置于冰箱中存放備用；
[0139]3)種子罐培養(yǎng)
[0140]培養(yǎng)基配方:葡萄糖食品級，5.0% ;蛋白胨生物級，0.5% ;酵母膏生物級0.5% ;硫酸鎂化學(xué)級，0.1% ;磷酸二氫鉀化學(xué)級，0.1% ;消泡劑生物級，0.05%，pH6.0~6.5 ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；
[0141]空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0142]種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ；
[0143]種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種；
[0144]種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10X150CFU/m ;將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至30°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)；
[0145]種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為26~28°C，壓力在0.05MPa，通氣量1: 0.6和攪拌速度220r/min條件下，培養(yǎng)8~10h，所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0146]種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵；
[0147]合格指標(biāo):菌體生長整齊，出芽率≥30%，含菌量2X 150CFU/ml，無雜菌污染；
[0148]4)發(fā)酵罐培養(yǎng)[0149]發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；
[0150]發(fā)酵罐投料:葡萄糖食品級，5.0% ;蛋白胨生物級，0.5% ;酵母膏生物級0.5% ;硫酸鎂化學(xué)級，0.1% ;磷酸二氫鉀化學(xué)級，0.1% ;消泡劑生物級，0.05%，pH6.0~6.5，所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；投料量不超過罐容積的70% ；
[0151]發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種；
[0152]發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度180~200r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.4~0.5);以后逐漸增大至1: 0.6，一般發(fā)酵周期為18~24h，檢驗結(jié)果符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；
[0153]發(fā)酵罐檢測:投料后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，至12h后，間隔期縮短為Ih ；
[0154]放罐標(biāo)準(zhǔn):芽孢含量≥70% ;含菌量≥10X150CFU/ml;雜菌量≤0.3%。
[0155]發(fā)明具有如下積極效果:
[0156]1、本發(fā)明最后篩選出產(chǎn)“三素酶”(纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶)能力較強的長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌、解淀粉類芽孢桿菌、白球擬酵母微生物菌種，通過試驗發(fā)現(xiàn)這些菌種之間，具有良好的共生、互生作用，沒有拮抗作用，從而最終確定將:“長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌、解淀粉類芽孢桿菌、白球擬酵母”作為生物秸桿腐熟劑的復(fù)合組配。
[0157]2、本發(fā)明的生物秸桿腐熟劑主要技術(shù)指標(biāo)均同于或優(yōu)于國標(biāo):
[0158]本發(fā)明的生物秸桿腐熟劑嚴(yán)格按照GB20287 — 2006《農(nóng)用微生物菌劑》生產(chǎn)，主要指標(biāo)均優(yōu)于國標(biāo)要求，(具體指標(biāo)詳見產(chǎn)品質(zhì)量檢測報告)，酶活等參數(shù)的測定方法按照NY/T2321-2013《微生物肥料產(chǎn)品檢測規(guī)程》。
[0159]
【權(quán)利要求】
1. 一種生物秸桿腐熟劑，其特征在于，以長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌、解淀粉類芽孢桿菌和白球擬酵母作為復(fù)合菌種組配，使腐熟劑的有效活菌數(shù):長柄木霉2~10億個/g、土曲霉2~10億個/g、黃孢平革菌2~10億個/g、解淀粉類芽孢桿菌2~10億個/g、白球擬酵母2~10億個/g。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備長柄木霉發(fā)酵物、土曲霉發(fā)酵物、黃孢平革菌發(fā)酵物、解淀粉類芽孢桿菌菌液、白球擬酵母菌液；其中:長柄木霉、土曲霉、黃孢平革菌，先進行液體發(fā)酵，再進行固體發(fā)酵；解淀粉類芽孢桿菌、白球擬酵母只進行液體發(fā)酵； 所述液體發(fā)酵過程:菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)； 所述固體發(fā)酵過程:清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)； (2)按比混合:根據(jù)混合罐的容積，以麥麩為載體,加入步驟(1)制備的長柄木霉發(fā)酵物，土曲霉發(fā)酵物，黃孢平革菌發(fā)酵物，解淀粉類芽孢桿菌菌液，白球擬酵母菌液，加入蒸餾水，混合后攪拌，使腐熟劑的有效活菌數(shù):長柄木霉2~10億個/g、土曲霉2~10億個/g、黃孢平革菌2~10億個/g、解淀粉類芽孢桿菌2~10億個/g、白球擬酵母2~10億個/g ; (3 )鏈條粉碎，分級過篩，機械包裝，成品入庫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于， 所述制備長柄木霉發(fā)酵物:長柄木霉一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)一清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)，具體地步驟如下: 1)菌種斜面 將凍干的長柄木霉菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在.28 ~30°C，培養(yǎng) 36 ~40h ； 2)三角瓶培養(yǎng) 培養(yǎng)基制備:將瓊脂加熱溶化后，用0.lmol/L氫氧化鈉或0.lmol/L鹽酸調(diào)pH值5.0~.5.2，然后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1lMPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫? 菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔，置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于25~26°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于28~30°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用； 3)種子罐培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方:玉米粉食品級，120目，1.0%;淀粉食品級，120目，2.0%;中溫豆柏粉食品級，120目，2.0%;魚粉食品級，120目，0.6%;玉米漿生物級，120目，0.5%;玉米秸桿飼料級.120目，3.0%;硫酸亞鐵分析級，0.1%;硫酸錳分析級，0.1%;磷酸二氫鉀分析級，0.1%；硫酸鎂分析級，0.05%;硫酸銅分析級，0.05%;硫酸銨分析級，0.05%;泡敵食品級，0.05%;pH值.5.0~5.2，所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水； 空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌.30min ； 種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ； 種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種； 種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10 X 150CFU/ml，將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至25°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)； 種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為25~26°C，壓力在0.05MPa,通氣量1: 0.8和攪拌速度120r/min條件下，培養(yǎng)18~24h,所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵； 合格指標(biāo):菌體生長整齊，菌絲成簇或多數(shù)為菌絲團； .4)發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ； 發(fā)酵罐投料:配比同種子發(fā)酵液，投料量不超過罐容積的70% ； 發(fā)酵罐滅菌實消:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至.25°C即可接種； 發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度100~120r/min，罐壓0.05MPa，移種4h內(nèi)通氣量為1:0.4~.0.5，以后逐漸增大至1:0.8。一般發(fā)酵周期為72~96h，在厚垣孢子大量形成時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ； 發(fā)酵罐檢測:投料后6h開始，每隔4h取樣一次檢測，至48h后，間隔期縮短為2h ； 放罐標(biāo)準(zhǔn):厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;雜菌量≤0.3% ；.5)清潔發(fā)酵室 將發(fā)酵室地面及空間清理干凈，拌料場內(nèi)拌料機、鏈條、皮帶輸送機清洗干凈，晾干；拌料場周圍打掃干凈，工器具清洗晾干；將場地、設(shè)備用漂白粉上清劑噴灑消毒，靜置30min ； . 6)備料 將種液運入拌料場，按質(zhì)量比麥麩:種液=10:3的比例運入麥麩； .7)投料混合 根據(jù)拌料機的生產(chǎn)能力，按照生產(chǎn)工藝要求和配料比,把菌種和麥麩加入到拌料機,攪拌5min ;把混勻的原料放于皮帶傳送機,進入同時開啟的鏈條粉碎機粉碎；粉碎均勻的濕料經(jīng)皮帶傳送機進入裝袋程序，扎口 ； .8)保溫培養(yǎng) 預(yù)先將發(fā)酵室及地面溫度保持在25°C以上，料袋單排碼放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保證發(fā)酵均勻。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于， 所述制備土曲霉發(fā)酵物:土曲霉一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)—清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)，具體地步驟如下: .1)菌種斜面 將凍干的土霉菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在.28 ~30°C，培養(yǎng) 36 ~40h ； .2)三角瓶培養(yǎng) 培養(yǎng)基制備:去皮的馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml煮沸30min濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000ml，加葡萄糖20g，溶化后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1 IMPa壓力下滅菌30min,冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫? 菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔，置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于25~26°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于26~28°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用； 3)種子罐培養(yǎng): 培養(yǎng)基配方:蔗糖2%，地瓜汁2%，蛋白胨2%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂.0.3%，pH值5.0~5.2 ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水； 空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌.30min ； 種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ； 種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種； 種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10X150CFU/ml ;將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至25°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)； 種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為25~26°C，壓力在0.05MPa,通氣量1: 0.8和攪拌速度120r/min條件下,培養(yǎng)18~24h,所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵； 合格指標(biāo):菌體生長整齊，菌絲成簇或多數(shù)為菌絲團； 4)發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ； 發(fā)酵罐投料:配比同種子發(fā)酵液，投料量不超過罐容積的70% ； 發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種； 發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度100~120r/min,罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.4~.0.5)；以后逐漸增大至1: 0.8，一般發(fā)酵周期為72~96h，在厚垣孢子大量形成時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ； 發(fā)酵罐檢測:投料后6h開始，每隔4h取樣一次檢測，至48h后，間隔期縮短為2h ； 放罐標(biāo)準(zhǔn):厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;雜菌量≤0.3% ； 5)清潔發(fā)酵室 將發(fā)酵室地面及空間清理干凈，拌料場內(nèi)拌料機、鏈條、皮帶輸送機清洗干凈，晾干；拌料場周圍打掃干凈，工器具清洗晾干；將場地、設(shè)備用漂白粉上清劑噴灑消毒，靜置30min ； 6)備料 將種液運入拌料場，按麥麩:種液=10:3的比例運入麥麩； 7)投料混合 根據(jù)拌料機的生產(chǎn)能力，按照生產(chǎn)工藝要求和配料比，把菌種和麥麩加入到拌料機，攪拌5min ;把混勻的原料放于皮帶傳送機,進入同時開戶的鏈條粉碎機粉碎,粉碎均勻的濕料經(jīng)皮帶傳送機進入裝袋程序，扎口 ； . 8)保溫培養(yǎng) 預(yù)先將發(fā)酵室及地面溫度保持在25V以上；將料袋單排碼放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保證發(fā)酵均勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于， 所述制備黃孢平革菌發(fā)酵物:黃孢平革菌一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)一清潔發(fā)酵室一備料一投料混合一保溫培養(yǎng)，具體地步驟如下: . 1)菌種斜面 將凍干的黃孢平革菌菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ； . 2)三角瓶培養(yǎng) 培養(yǎng)基:去皮的馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml煮沸30min濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000ml，加葡萄糖20g，溶化后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1lMPa壓力下滅菌.30min,冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫? 菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔，置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于25~26°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于27~28°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用； . 3)種子罐培養(yǎng): 培養(yǎng)基配方:葡萄糖1%，磷酸二氫鉀0.2%，酒石酸銨0.02%，氯化鈣0.001%，硫酸鎂.0.025%，維生素B10.0001%,七水硫酸銅0.008%,七水硫酸鋅0.004%, pH值5.0~5.2 ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水； 空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌.30min ； 種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ； 種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25V即可接種； 種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10 X 150CFU/ml，將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至25°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)； 種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為25~26°C，壓力在0.05MPa,通氣量1: 0.8和攪拌速度120r/min條件下，培養(yǎng)18~24h,所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵； 合格指標(biāo):菌體生長整齊，菌絲成簇或多數(shù)為菌絲團； . 4)發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ； 發(fā)酵罐投料:配比同種子發(fā)酵液。投料量不超過罐容積的70% ；發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至25°C即可接種； 發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度100~120r/min,罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.4~.0.5)，以后逐漸增大至1:0.8，一般發(fā)酵周期為72~96h，在厚垣孢子大量形成時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ； 發(fā)酵罐檢測:投料后6h開始，每隔4h取樣一次檢測，至48h后，間隔期縮短為2h ； 放罐標(biāo)準(zhǔn):厚垣孢子含量≥4X150CFU/ml;雜菌量≤0.3% ； 5)清潔發(fā)酵室 將發(fā)酵室地面及空間清理干凈，拌料場內(nèi)拌料機、鏈條、皮帶輸送機清洗干凈，晾干；拌料場周圍打掃干凈，工器具清洗晾干；將場地、設(shè)備用漂白粉上清劑噴灑消毒，靜置30min ； 6)備料 將種液運入拌料場，按麥麩:種液=10:3的比例運入麥麩； 7)投料混合 根據(jù)拌料機的生產(chǎn)能力，按照生產(chǎn)工藝要求和配料比，把菌種和麥麩加入到拌料機，攪拌5min ;把混勻的原料放于皮帶傳送機,進入同時開戶的鏈條粉碎機粉碎,粉碎均勻的濕料經(jīng)皮帶傳送機進入裝袋程序，扎口 ； 8)保溫培養(yǎng) 預(yù)先將發(fā)酵室及地面溫度保持在25°C以上；將料袋平躺于地面，單排碼放；隔4h，倒垛，料袋揉搓，保證發(fā)酵均勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于， 所述制備解淀粉類芽孢桿菌液:解淀粉類芽孢桿菌一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體地步驟如下: 1)菌種斜面 將凍干的解淀粉類芽孢桿菌菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ； 2)三角瓶培養(yǎng) 培養(yǎng)基制備:LB培養(yǎng)基，酵母膏5g;瓊脂2%;NACL10g;蛋白胨IOg;蒸餾水1000ml ；PH7.0 ;分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1lMPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫? 菌種活化和擴大培養(yǎng):在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔，置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于20°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于20°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48~72h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放備用； 3)種子罐培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方:花生餅粉0.5%，魚粉0.3%，玉米漿0.5%，葡萄糖0.3%，泡敵0.3% ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水； 空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌.30min ； 種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ； 種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種； 種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10X150CFU/ml ;并在80°C恒溫水浴中處理30min ;將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至30°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng); 種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為28~30°C，壓力在0.05MPa,通氣量1:1和攪拌速度220r/min條件下,培養(yǎng)8~IOh,所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ； 種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵； 合格指標(biāo):菌體生長整齊，處于對數(shù)生長期，含菌量2X150CFU/ml，無雜菌污染； . 4)發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；發(fā)酵罐投料:花生餅粉2.0%，魚粉0.3%，玉米漿1.8%，糊精0.5%，硫酸鎂0.075%,碳酸鈣0.5%，磷酸二氫鉀0.04%，泡敵0.05%, pH值7.0~7.5，所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；投料量不超過罐容積的70% ； 發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種； 發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度180~200r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.7~.0.8);以后逐漸增大至1:1 ;一般發(fā)酵周期為18~24h，在芽孢大量形成、個別芽孢大量脫落時，符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ； 發(fā)酵罐檢測:投料后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，至18h后，間隔期縮短為Ih ； 放罐標(biāo)準(zhǔn):芽孢含量≥70% ;含菌量≥50X150CFU/ml;雜菌量≥0.3%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物秸桿腐熟劑的制備方法，其特征在于， 所述制備白球擬酵母菌液:白球擬酵母一菌種斜面一三角瓶培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體地步驟如下: .1)菌種斜面 將凍干的白球擬酵母菌種在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的試管斜面上，將溫度控制在28~30°C，培養(yǎng)36~40h ； . 2)三角瓶培養(yǎng) 培養(yǎng)基制備:12波美度麥芽技100ml，瓊脂2.0%:將瓊脂加熱溶化后，用0.lmol/1氫氧化鈉或0.l%mol/l鹽酸調(diào)pH值5.0~6.0 ;然后分裝三角瓶，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.1IMPa壓力下滅菌30min,冷卻后制成斜面?zhèn)溆茫? 菌種活化和擴大培養(yǎng) :在無菌條件下從原菌菌種斜面上挑選少許菌苔，置放三角瓶斜面內(nèi)進行“之”字畫線，然后置于26~28°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌，菌體生長整齊，再置于26~28 °C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24~28h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片，染色檢查無雜菌，菌體大小一致的，放置于冰箱中存放備用； . 3)種子罐培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方:葡萄糖食品級，5.0% ;蛋白胨生物級，0.5% ;酵母膏生物級0.5% ;硫酸鎂化學(xué)級，0.1% ;磷酸二氫鉀化學(xué)級，0.1% ;消泡劑生物級，0.05%，pH6.0~6.5 ;所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水； 空種子罐滅菌:發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.1lMPa壓力下滅菌30min ； 種子罐裝料:參照培養(yǎng)基配方按比例裝料，投料量不得超過罐容積的70% ； 種子罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種； 種子罐接種:在無菌條件下將每個三角瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為IOX 150CFU/m;將制備好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按質(zhì)量比1%的比例接種于冷卻至30°C的種子罐內(nèi)進行培養(yǎng)； 種子罐培養(yǎng)條件控制:接種后在溫度為26~28°C，壓力在0.05MPa,通氣量1: 0.6和攪拌速度220r/min條件下,培養(yǎng)8~IOh,所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ；種子罐培養(yǎng)條件檢測:接種后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，檢測內(nèi)容包括菌體生長情況，含菌量，PH值，達到指標(biāo)即可移到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵； 合格指標(biāo):菌體生長整齊，出芽率≥30%，含菌量2X150CFU/ml，無雜菌污染； 4)發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐空消:發(fā)酵罐在接種前嚴(yán)格滅菌處理，洗凈后在0.1lMPa壓力下滅菌30min ；發(fā)酵罐投料:葡萄糖食品級，5.0% ;蛋白胨生物級，0.5% ;酵母膏生物級0.5% ;硫酸鎂化學(xué)級，0.1% ;磷酸二氫鉀化學(xué)級，0.1% ;消泡劑生物級，0.05%，pH6.0~6.5，所述百分比為質(zhì)量體積百分比，溶劑為蒸餾水；投料量不超過罐容積的70% ； 發(fā)酵罐滅菌:裝好料后，在0.1lMPa壓力下，溫度達到121°C，滅菌30min，冷卻至30°C即可接種； 發(fā)酵罐培養(yǎng):攪拌速度180~200r/min，罐壓0.05MPa,移種4h內(nèi)通氣量為1: (0.4~.0.5)；以后逐漸增大至1: 0.6，一般發(fā)酵周期為18~24h，檢驗結(jié)果符合放罐指標(biāo)，即可放罐；所述通氣量為每min進出空氣體積比V/V/min ； 發(fā)酵罐檢測:投料后4h開始，每隔2h取樣一次檢測，至12h后，間隔期縮短為Ih ； 放罐標(biāo)準(zhǔn):芽孢含量≥70% ;含菌量≥10X150CFU/ml;雜菌量≤0.3%。
【文檔編號】C12R1/885GK103614321SQ201310579323
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】邵鳳成, 劉淑君, 蔣濤, 韓利紅, 張雪梅, 趙金勝, 王淑君, 李洪云, 顧永海 申請人:天津市武清區(qū)植保植檢站