能同時(shí)響應(yīng)水楊酸sa和茉莉酸ja誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子。該誘導(dǎo)啟動(dòng)子是以煙草PR-1a啟動(dòng)子為基本骨架，利用巢式PCR擴(kuò)增方法將JA響應(yīng)元件插入PR-1a啟動(dòng)子獲得的一種新的融合啟動(dòng)子，命名為PR-1a-JA。誘導(dǎo)活性分析結(jié)果表明，PR-1a-JA不僅能夠同時(shí)響應(yīng)SA和JA的誘導(dǎo)，具有較高的SA誘導(dǎo)活性，而且能夠?qū)Σ≡恼T導(dǎo)發(fā)生響應(yīng)，響應(yīng)部位主要集中在侵染部位。無(wú)本底表達(dá)，不受高溫、低溫、高鹽、機(jī)械損傷等非生物脅迫的誘導(dǎo)。
【專利說(shuō)明】能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]自從人類(lèi)開(kāi)始栽培作物以來(lái)，植物病害便是作物生產(chǎn)的重要影響因素。作物病害不僅影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，甚至絕收，而且還影響產(chǎn)品的品質(zhì)，給人類(lèi)的健康帶來(lái)無(wú)形的危害。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，植物病害一直是農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因，平均每年因病害造成的農(nóng)作物損失占農(nóng)作物產(chǎn)量的10%以上。目前病蟲(chóng)防治仍以化學(xué)農(nóng)藥控制為主， 這不僅對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，還容易使病蟲(chóng)害產(chǎn)生抗性，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康與生存。實(shí)踐證明，推廣種植抗病品種是防治病害唯一經(jīng)濟(jì)有效的措施，因此，如何提高植株自身抗病性成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。
[0003]基因工程技術(shù)的應(yīng)用，為培育抗病植物品種開(kāi)辟了一條有效的途徑。即通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將抗病基因轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)，表達(dá)抗菌蛋白或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，從而提高植株自身抗病性。利用組成型啟動(dòng)子控制抗病基因在植物體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)是植物抗病基因工程研究的常用策略。但是，某些抗病基因在植株內(nèi)高量持續(xù)表達(dá)后，產(chǎn)生的異源蛋白對(duì)植物細(xì)胞具有一定的毒害作用，即使在無(wú)病原菌侵染時(shí)植物仍持續(xù)處于抗病反應(yīng)狀態(tài)，嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，雖然抗病性得到了有效提高，但是獲得的轉(zhuǎn)基因植物不能應(yīng)用于生產(chǎn)。
[0004]病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是一類(lèi)在受到病原菌侵染時(shí)才能激活的啟動(dòng)子，理論上這類(lèi)啟動(dòng)子可以調(diào)控目的基因在病原菌侵染時(shí)在侵染部位進(jìn)行表達(dá)。因此，利用這類(lèi)啟動(dòng)子控制抗病相關(guān)基因，不僅能提高轉(zhuǎn)基因植株的防御能力，而且可消除或削弱因抗病基因過(guò)高表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物持續(xù)積累而對(duì)植株產(chǎn)生的毒副作用。
[0005]水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)是兩大類(lèi)植物免疫信號(hào)分子，病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中普遍含有能夠響應(yīng)這些信號(hào)分子的元件，通過(guò)相關(guān)元件對(duì)這些信號(hào)分子進(jìn)行響應(yīng)，啟動(dòng)下游抗病基因表達(dá)，從而介導(dǎo)不同類(lèi)型病原菌侵染植物后的抗病反應(yīng)。水楊酸主要介導(dǎo)植物體對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的免疫反應(yīng)；茉莉酸主要介導(dǎo)植物體對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌、物理和植食昆蟲(chóng)傷害的免疫反應(yīng)。目前已經(jīng)報(bào)道獲得的絕大多數(shù)天然病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只能響應(yīng)其中一種信號(hào) ，其響應(yīng)的病原菌范圍非常有限。已報(bào)道能同時(shí)響應(yīng)水楊酸(SA)和茉莉酸(JA) 誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子主要是來(lái)自辣椒的CABPRl啟動(dòng)子,但是該啟動(dòng)子不僅能響應(yīng)水楊酸 (SA)和茉莉酸(JA)誘導(dǎo)，同時(shí)也能對(duì)生物和非生物脅迫的誘導(dǎo)作出響應(yīng)，未受脅迫也存在調(diào)控基因的表達(dá)，即該啟動(dòng)子存在一定的本底。這種存在本底，且對(duì)多種生物和非生物脅迫作出反應(yīng)的啟動(dòng)子與組成型啟動(dòng)子類(lèi)似，同樣難以應(yīng)用于植物抗病基因工程中。
[0006]植物抗病基因工程研究中，利用病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Pathogen-1nducible promote) 調(diào)控基因的表達(dá)更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椴≡T導(dǎo)啟動(dòng)子可以首先對(duì)多種病原菌的入侵做出反應(yīng)，使目的基因在受病原菌侵染時(shí)而誘導(dǎo)表達(dá)。利用病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)是介導(dǎo)植物廣譜抗性策略的創(chuàng)新之處。因此，病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子在植物抗病基因工程中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。理想的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有病原誘導(dǎo)因子廣、本底活性低、啟動(dòng)表達(dá)快、 不受創(chuàng)傷和其他非生物脅迫誘導(dǎo)等特點(diǎn)。而天然存在的啟動(dòng)子均不兼具上述這些特性，這就一定程度上限制了這些啟動(dòng)子在植物抗病基因工程中的廣泛應(yīng)用。實(shí)際上，目前抗病基因工程中幾乎沒(méi)有理想可用的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。因此，獲得具有前述特點(diǎn)的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)植物抗病基因工程具有重要意義。
[0007]植物病原菌按其生活習(xí)性劃分為活體營(yíng)養(yǎng)型、死體營(yíng)養(yǎng)型和兼性營(yíng)養(yǎng)型三大類(lèi)。 植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型的免疫反應(yīng)與SA信號(hào)途徑有關(guān)，對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型的免疫反應(yīng)與JA信號(hào)途徑有關(guān)，而這兩種信號(hào)途徑相互拮抗，因此，除了植物自身具有的免疫功能外，通過(guò)基因工程手段難以獲得植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)和死體營(yíng)養(yǎng)病原菌同時(shí)兼抗的特性，同時(shí)也難以達(dá)到對(duì)兼性營(yíng)養(yǎng)病原菌不同的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段同時(shí)兼抗的目的。但是，如果一個(gè)啟動(dòng)子能同時(shí)應(yīng)答SA 和JA的誘導(dǎo)，那么，理論上通過(guò)基因工程手段就可以在病原菌不同的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段都能有效誘導(dǎo)基因的表達(dá)，達(dá)到提高植物對(duì)更多病害的抗性的目的。
[0008]因此，人工構(gòu)建能夠同時(shí)響應(yīng)水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，并篩選獲得無(wú)本底，活性高、反應(yīng)快、僅受病原菌的誘導(dǎo)，而不受非生物脅迫誘導(dǎo)的病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子， 不僅可以擴(kuò)大病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子對(duì)病原菌的響應(yīng)范圍，而且對(duì)于基因工程中選育廣譜抗病植株，以及實(shí)現(xiàn)對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)和死體營(yíng)養(yǎng)兼性菌的有效防治均具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明是針對(duì)目前病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子存在的不足，利用生物技術(shù)手段成功改造提供一種能同時(shí)受水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子不僅能受水楊酸 (SA)或茉莉酸(JA)的誘導(dǎo)，也能受水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)的同時(shí)誘導(dǎo)，同時(shí)也能受煙草赤星病菌的誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)表達(dá)主要集中在侵染部位；此外，該啟動(dòng)子受SA誘導(dǎo)活性高、無(wú)本底、不受如損傷、高鹽、低溫、高溫等非生物脅迫的誘導(dǎo)?？梢岳帽景l(fā)明的啟動(dòng)子構(gòu)建各種植物表達(dá)載體，用于通過(guò)基因工程技術(shù)改良作物的性狀。
[0010]本發(fā)明首先提 供了一種能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于，該誘導(dǎo)啟動(dòng)子含有SEQl所示的核苷酸序列,命名為PR-la-JA。
[0011]進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)啟動(dòng)子，是以煙草PR-1a啟動(dòng)子為基本骨架，利用巢式PCR擴(kuò)增方法將JA響應(yīng)元件插入PR-1a啟動(dòng)子獲得的一種新的誘導(dǎo)啟動(dòng)子；
[0012]所述的JA響應(yīng)元件，至少含有SEQ2所示的核苷酸序列。
[0013]本發(fā)明還提供所述能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0014]I)設(shè)計(jì)SEQ2所示的核苷酸序列，它包含2個(gè)G-box、2個(gè)GCC_box及來(lái)自煙草NtPMT 啟動(dòng)子G-box元件及GCC基序的中間連接序列；
[0015]2)以煙草DNA為模板，以SEQ7和SEQ8為弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEMT 載體，經(jīng)篩選驗(yàn)證獲得pGEMT-PR-la載體；
[0016]3)以pGEMT-PR-la質(zhì)粒為模板，SEQ3和SEQ4為引物對(duì)，SEQ5和SEQ6為引物對(duì)， 分別進(jìn)行擴(kuò)增得到兩個(gè)片段，并利用這兩個(gè)片段的重疊部分進(jìn)行退火延伸，得到重疊延伸片段；
[0017]4)利用步驟3)獲得的重疊延伸片段為模板，以SEQ3和SEQ6為引物對(duì)，擴(kuò)增獲得新的誘導(dǎo)啟動(dòng)子PR-1a-JA的序列。
[0018]本發(fā)明還提及所述誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，其為擴(kuò)增誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列的引物。
[0019]該誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，在遺傳育種或基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0020]該誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列應(yīng)用于重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或重組菌。
[0021]該誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列插入PBI121等植物表達(dá)載體而獲得重組載體。
[0022]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0023]本發(fā)明首次提供了一種誘導(dǎo)啟動(dòng)子PR-1a-JA，利用轉(zhuǎn)基因煙草研究證明，該啟動(dòng)子不僅能對(duì)SA的誘導(dǎo)作出反應(yīng)，而且能響應(yīng)JA的誘導(dǎo)；還能對(duì)SA和JA的同時(shí)誘導(dǎo)作出應(yīng)答。進(jìn)一步的研究證明，該啟動(dòng)子無(wú)本底，受病原菌誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)活性高，該啟動(dòng)子能對(duì)病原菌的誘導(dǎo)快速作出反應(yīng)，且誘導(dǎo)反應(yīng)主要集中在侵染部位。而且不受如損傷、高溫、低溫、高鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)。符合植物抗病基因工程研究需要的理想啟動(dòng)子的特點(diǎn)，可為植物抗病基因工程提供可應(yīng)用的啟動(dòng)子。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是JA反應(yīng)模塊插入PR-1a的示意圖。
[0025]圖2是PR-la-JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測(cè)結(jié)果；
[0026]M:DNA Marker (DL2000)；1:野生型煙草；2:陽(yáng)性對(duì)照，pBI121_PR-la_JA::GUS 質(zhì)粒；3-16:PR-la-JA: AUS轉(zhuǎn)基因煙草植株；17:水對(duì)照。
[0027]圖3是PR-la-JA::⑶`S轉(zhuǎn)基因煙草受SA誘導(dǎo)后的⑶S染色結(jié)果。
[0028]圖4是PR-la-JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草受MeJA誘導(dǎo)后的⑶S染色結(jié)果。
[0029]圖5是PR-la-JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草受SA和MeJA同時(shí)誘導(dǎo)后的⑶S染色結(jié)果。
[0030]圖6是PR-la-JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草接種赤星病菌后⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0031]赤星病菌指接種赤星病菌的PR-la-JA::GUS轉(zhuǎn)基因煙草葉片；對(duì)照指接種PDA培
養(yǎng)基塊的PR-la-JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草；12hr，Id......7d指PR-la-JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草葉片
接種赤星病菌的時(shí)間。
[0032]圖7PR-la_JA::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草受非生物脅迫后⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0033]CK指野生型煙草植株葉片。
[0034]具體實(shí)施實(shí)例
[0035]以下的實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施實(shí)例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征。除特殊說(shuō)明，本發(fā)明所采用的均為本發(fā)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)獲得。
[0036]1、PR-1a啟動(dòng)序列的獲得:
[0037]1.1煙草DNA的提取:
[0038]取野生型煙草葉片約lOOmg，利用新型植物基因組DNA快速提取試劑盒(Aidlab)， 按說(shuō)明書(shū)步驟提取煙草基因組DNA。
[0039]1.2 PR-1a啟動(dòng)子的獲得:
[0040]在5’端添加Hind III，3’端添加BamHI酶切位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)引物SEQ7和SEQ8，然后以步驟1.1獲得的煙草基因組DNA為模板，利用Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)擴(kuò)增目標(biāo)片段。擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，并用回收試劑盒(BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit)進(jìn)行目的片段的回收。然后利用T4連接酶(Promega),將回收片段連接 A pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽(yáng)性克隆，獲得pGEMT_Pr_la載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后獲得PR-1a啟動(dòng)子序列。
[0041]2、PR-1a-JA啟動(dòng)子序列的獲得:
[0042]2.1設(shè)計(jì)72bp的JA反應(yīng)模塊(反應(yīng)元件及中間連接序列):
[0043]根據(jù)應(yīng)答JA的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的特點(diǎn)，JA的主要反應(yīng)元件是G-box和GCC-box。為了提高JA誘導(dǎo)反應(yīng)的強(qiáng)度，分別將這兩個(gè)反應(yīng)元件增加一倍，同時(shí)用一段來(lái)自煙草NtPMT啟動(dòng)子G-box元件及GCC基序的中間連接序列連接兩個(gè)加倍的JA反應(yīng)主要元件,得到72bp 的JA反應(yīng)模塊，具體序列見(jiàn)SEQ2。
[0044]2.2 PR-1a啟動(dòng)子片段的獲得:
[0045]通過(guò)http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE/signalup.html 和 http:// bioinformatics.Psb.ugent.be/webtools/plantcare/html 網(wǎng)站，利用植物啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PR-1a啟動(dòng)子進(jìn)行元件預(yù)測(cè)分析。為了成功構(gòu)建PR-1a-JA啟動(dòng)子,其JA反應(yīng)元件插入 PR-1a啟動(dòng)子時(shí)不能破壞該啟動(dòng)子自身的SA響應(yīng)元件及其他相關(guān)作用元件，同時(shí)要避開(kāi)其 TATA框和CAAT盒等核心啟動(dòng)元件。根據(jù)該啟動(dòng)子的特點(diǎn)，選擇在其_604bp的位置插入設(shè)計(jì)的72bp的JA反應(yīng)模塊,示意圖見(jiàn)圖1。
[0046]根據(jù)上述設(shè)計(jì)思路和PR-1a啟動(dòng)子的特點(diǎn)，按照PCR反應(yīng)要求，分別設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物SEQ3和SEQ4，SEQ5和SEQ6，然后以pGEMT_Pr_la質(zhì)粒為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增， 分別獲得PR-1a啟動(dòng)子的兩個(gè)片段，并利用這兩個(gè)片段的重疊部分進(jìn)行退火延伸，得到重疊延伸片段。
[0047]所述SEQ3、SEQ4、SEQ5和SEQ6由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。
[0048]2.3 PR-1a-JA啟動(dòng)子的獲得:`[0049]以上述步驟2.2獲得的重疊延伸片段為模板，以SEQ3和SEQ6為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，并用回收試劑盒(BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit)進(jìn)行擴(kuò)增片段的回收。然后利用T4連接酶(Promega),將回收片段連接到pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽(yáng)性克隆，獲得pGEMT_PR_Ia-JA載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后獲得PR-1a-JA啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子含有SEQl所示的核苷酸序列。
[0050]3、pBI121-PR-la-JA::⑶S植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得:
[0051]3.1 pBI121-PR-la-JA::⑶S植物表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0052]將步驟2.3獲得的pGEMT-PR-la-JA質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒分別用Hind III和BamHI 進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，前者回收約ieoobp的小片段，后者回收大片段，然后利用T4DNA連接酶連接回收的片段，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，篩選陽(yáng)性克隆， 提取質(zhì)粒再利用Hind III和BamHI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，獲得pBI121_PR-la-JA::⑶S植物表達(dá)載體。
[0053]所述PBI121質(zhì)粒為由日本信州大學(xué)小島峰雄教授贈(zèng)送。
[0054]3.2含有pBI121-PR-la_JA::⑶S植物表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌的獲得:
[0055]利用電轉(zhuǎn)化法，將步驟3.1獲得的pBI121-PR-la_JA::⑶S植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，利用抗生素篩選標(biāo)記基因進(jìn)行抗性篩選，獲得陽(yáng)性克隆，再提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒并用Hind III和BamHI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，獲得含有pBI121_PR-la-JA::⑶S植物表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌。
[0056]4、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得:
[0057]4.1煙草的遺傳轉(zhuǎn)化:
[0058]將含pBI121-PR-la_JA::⑶S植物表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌接種入液體YEB培養(yǎng)基， 28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至0D6001.0~1.2。菌液離心后收集菌體，并用等體積MSB液
體培養(yǎng)基重懸菌體，重懸液即為轉(zhuǎn)化用浸染液。
[0059]培養(yǎng)約IOd的煙草無(wú)菌苗葉片,切成3_5mm介方的葉盤(pán),于浸染液內(nèi)浸染Ihr,去除菌液，然后將葉盤(pán)接種于共培養(yǎng)基(葉片陽(yáng)面朝上)，24°C暗培養(yǎng)48hr。共培養(yǎng)完成后，外植體繼代入附加100mg/L卡那霉素和200mg/L頭孢霉素的篩選脫菌培養(yǎng)基，25°C、16hr光照 /8hr暗培養(yǎng)的光周期培養(yǎng)2周繼代一次，至葉盤(pán)邊緣產(chǎn)生幼芽，將幼芽切下繼代入MSB培養(yǎng)基生根成苗，幼苗生長(zhǎng)至3-4葉移栽入花盆做進(jìn)一步的分析。
[0060]4.2煙草的PCR驗(yàn)證:
[0061]以再生煙草植株幼嫩葉片為材料，利用新型植物基因組DNA快速提取試劑盒 (Aidlab)，按說(shuō)明書(shū)步驟提取再生煙草基因組DNA。
[0062]以 SEQ9 (5， -TCAGGAAGTGATGGAGC-3’)和 SEQlO (5' -GGTATCGGTGTGAGCGT-3') 為引物，擴(kuò)增PR-la-JA::GUS的部分序列，產(chǎn)物1063bp。20 U L PCR擴(kuò)增體系包括:2XTaq Plus Master MixlO ii L,模板 DNAl ii L (約 IOng),上下游引物各 I ii L (5 ii mol/L),雙蒸水 7u L0 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C 5min ；95°C 30S，56°C 30S，72°C 30S，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0063]PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，PR-la_JA::⑶S序列已經(jīng)整合入煙草植株。凡PCR擴(kuò)增能獲得約1063bp特異帶的煙草植株均用于PR-1a-JA啟動(dòng)子的特性分析。
[0064]5、PR-1a-JA啟動(dòng)子受SA和JA誘導(dǎo)的反應(yīng)特性分析:
[0065]5.1⑶S組織化學(xué)染色
[0066]⑶S組織化學(xué)染色參照J(rèn)efferson和Bevan (1987)的方法進(jìn)行，具體方法如下: 將需要染色的植物組織材料放入配制的GUS染色液中，37°C避光染色12hr，以充分染色，然后用95%的乙醇脫色3~5次，直至材料完全沒(méi)有綠色為止。最后用體視鏡觀察并拍照，或用相機(jī)拍照。
[0067]5.2 PR-1a-JA啟動(dòng)子受SA和JA誘導(dǎo)的反應(yīng)特性分析:
[0068]以轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片為材料，分別用ImM水楊酸(SA)、0.01%的茉莉酸甲酯 (MeJA)、以及ImM SA+0.01%MeJA分別浸泡葉片8hr，然后用自來(lái)水漂洗干凈，再用濕潤(rùn)的脫脂棉包裹葉柄進(jìn)行保濕培養(yǎng)，以同期水處理作對(duì)照。自處理開(kāi)始，間隔12hr分別用約6mm 直徑的打孔器切取葉圓片，按上述步驟5.1的方法進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。GUS染色結(jié)果表明，時(shí)程試驗(yàn)中，水處理對(duì)照樣品均未染成藍(lán)色；lmM SA誘導(dǎo)處理后8hr轉(zhuǎn)基因煙草葉片便能藍(lán)色，直至處理后的132hr，且染色較深(圖3);0.01%MeJA誘導(dǎo)處理后24hr轉(zhuǎn)基因煙草葉片開(kāi)始染成藍(lán)色，直至處理后的120hr (圖4);lmM SA和0.01%MeJA同時(shí)進(jìn)行處理8hr，轉(zhuǎn)基因煙草葉片開(kāi)始染成較深的藍(lán)色，直到處理后144hr仍然能染成藍(lán)色(圖5)。結(jié)果說(shuō)明， PR-1 a-JA啟動(dòng)子既能分別對(duì)SA或JA的誘導(dǎo)作出反應(yīng)，也能對(duì)SA和JA的同時(shí)誘導(dǎo)作出應(yīng)答，且不存在本底反應(yīng)。[0069]6、PR-la-JA啟動(dòng)子受病原菌誘導(dǎo)的反應(yīng)特性分析:
[0070]6.1接種致病菌的獲得:
[0071]保存的煙草赤星病菌首先于90mm PDA平板上活化培養(yǎng)，約I周，用6mm直徑的打孔器切取菌苔，然后接種入新的90mm PDA平板中央，26°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)至菌苔直徑約80mm， 然后再用6mm打孔器于菌苔邊緣切取菌塊，作為接種用致病菌。
[0072]6.2 PR-1a-JA啟動(dòng)子受病原菌誘導(dǎo)的反應(yīng)特性分析:
[0073]隨機(jī)選取10株能同時(shí)響應(yīng)SA和JA的轉(zhuǎn)基因煙草植株，取其幼嫩葉片，采用離體葉片接種法，接種煙草赤星病菌。首先于葉片的主葉脈中部，人為損傷葉片，然后將上述獲得的接種菌塊接種到損傷處，促進(jìn)病原菌的侵染，以同期接種同樣大小PDA培養(yǎng)基塊作為接種對(duì)照。所有接種材料于濕度75%，26°C光照培養(yǎng)箱，光照16hr，暗培養(yǎng)8hr的光周期條件下培養(yǎng)，并間隔12hr取完整葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，以明確PR-1a-JA啟動(dòng)子受病原菌誘導(dǎo)的特性。結(jié)果表明，接種12hr，轉(zhuǎn)基因煙草便能染成藍(lán)色，直至接種后7d藍(lán)色漸漸褪去(圖6，赤星病菌)，而同期接種PDA培養(yǎng)基塊的對(duì)照卻沒(méi)有染成藍(lán)色(圖6，對(duì)照)。 [0074]7、PR-1a-JA啟動(dòng)子受非生物脅迫誘導(dǎo)的反應(yīng)特性分析:
[0075]7.1 PR-1a-JA啟動(dòng)子對(duì)損傷誘導(dǎo)的反應(yīng)
[0076]隨機(jī)選取同時(shí)應(yīng)答SA和JA的轉(zhuǎn)基因煙草株系10個(gè)，取生長(zhǎng)完全的幼嫩葉片，用 9_孔徑的打孔器切取葉圓片，并將葉圓片漂浮于水面進(jìn)行光照保濕培養(yǎng)，間隔12hr，每個(gè)株系取5個(gè)葉圓片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，以檢測(cè)PR-1a-JA啟動(dòng)子對(duì)損傷的誘導(dǎo)反應(yīng)。
[0077]連續(xù)染色檢測(cè)I周，所有用于檢測(cè)的株系均未獲得染成藍(lán)色的組織(圖7)。3次重復(fù)試驗(yàn)獲得的結(jié)果完全相同。結(jié)果表明，PR-1a-JA啟動(dòng)子不受損傷的誘導(dǎo)。
[0078]7.2 PR-1a-JA啟動(dòng)子受NaCl誘導(dǎo)的反應(yīng):
[0079]隨機(jī)選取同時(shí)應(yīng)答SA和JA的轉(zhuǎn)基因煙草株系10個(gè)，取生長(zhǎng)完全的幼嫩葉片，用 9mm孔徑的打孔器切取葉圓片，葉圓片和完整葉片同時(shí)漂浮于l%NaCl溶液進(jìn)行培養(yǎng)，間隔 12hr取葉圓片，完整葉片則用打孔器切取葉圓片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，以檢測(cè)PR-1a-JA 啟動(dòng)子對(duì)鹽脅迫誘導(dǎo)的反應(yīng)。
[0080]連續(xù)染色檢測(cè)I周，所有用于檢測(cè)的株系均未獲得染成藍(lán)色的組織(圖7)。3次重復(fù)試驗(yàn)獲得的結(jié)果完全相同。結(jié)果表明，PR-1a-JA啟動(dòng)子不受鹽脅迫的誘導(dǎo)。
[0081]7.3 PR-1a-JA啟動(dòng)子受高溫和低溫脅迫的反應(yīng):
[0082]隨機(jī)選取同時(shí)應(yīng)答SA和JA的轉(zhuǎn)基因煙草株系10個(gè)，取生長(zhǎng)完全的幼嫩葉片，用濕紗布包裹葉柄，同時(shí)輔以保鮮膜覆蓋進(jìn)行保濕，然后將轉(zhuǎn)基因煙草葉片的一組置4°C凍庫(kù)內(nèi)，輔以光照進(jìn)行培養(yǎng)，另一組則置40°C光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，所有材料每天光照16hr，暗培養(yǎng)8hr。自處理開(kāi)始間隔12hr用9mm打孔器切取葉圓片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，以檢測(cè) PR-1a-JA啟動(dòng)子對(duì)高溫和低溫誘導(dǎo)的反應(yīng)。
[0083]連續(xù)I周⑶S組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，所有用于檢測(cè)的株系均未獲得染成藍(lán)色的組織(圖7)。3次重復(fù)試驗(yàn)獲得的結(jié)果完全相同。結(jié)果表明，PR-1a-JA啟動(dòng)子不受高溫和低溫的誘導(dǎo)。
[0084]綜上，本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，不僅能應(yīng)答SA的誘導(dǎo)，而且能應(yīng)答JA的誘導(dǎo)， 還能應(yīng)答SA和JA的同時(shí)誘導(dǎo)。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子不受如損傷、低溫、高溫、高鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)。能對(duì)病原菌的誘導(dǎo)快速作出反應(yīng)，且誘導(dǎo)表達(dá)部位主要集中在病原菌的侵染部位。
[0085]含有上述任一序列 的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或重組菌都是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于，該誘導(dǎo)啟動(dòng)子含有SEQl所示的核苷酸序列，命名為PR-la-JA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于，該誘導(dǎo)啟動(dòng)子是以煙草PR-1a啟動(dòng)子為基本骨架，利用巢式PCR擴(kuò)增方法將JA響應(yīng)元件插入PR-1a啟動(dòng)子獲得的一種新的誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于，所述的JA響應(yīng)元件,至少含有SEQ2所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:1)設(shè)計(jì)SEQ2所示的核苷酸序列，它包含2個(gè)G-box、2個(gè)GCC_box及來(lái)自煙草NtPMT啟動(dòng)子G-box元件及GCC基序的中間連接序列；2)以煙草DNA為模板，以SEQ7和SEQ8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEMT載體，經(jīng)篩選驗(yàn)證獲得pGEMT-PR-la載體；3)以pGEMT-PR-la質(zhì)粒為模板，SEQ3和SEQ4為引物對(duì)，SEQ5和SEQ6為引物對(duì)，分別進(jìn)行擴(kuò)增得到兩個(gè)片段，并利用這兩個(gè)片段的重疊部分進(jìn)行退火延伸，得到重疊延伸片段；4)利用步驟3)獲得的重疊延伸片段為模板，以SEQ3和SEQ6為引物對(duì)，擴(kuò)增獲得誘導(dǎo)啟動(dòng)子PR-1a-JA的序列。
5.能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于:擴(kuò)增權(quán)利要求1、2或3所述的誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列的引物。
6.能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于:將權(quán)利要求1、2或3所述的誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列在遺傳育種或基因表達(dá)中的應(yīng)用。
7.能同時(shí)響應(yīng)水楊酸S·A和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于:將權(quán)利要求1、2或3所述的誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列應(yīng)用于重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或重組菌。
8.能同時(shí)響應(yīng)水楊酸SA和茉莉酸JA誘導(dǎo)的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于:將權(quán)利要求1、2或3所述的誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列插入PBI121等植物表達(dá)載體而獲得重組載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103589731SQ201310582793
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】李先碧, 裴炎, 劉文英, 張覓, 宋水清, 侯磊, 余琛 申請(qǐng)人:西南大學(xué)