穩(wěn)定表達(dá)siRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明篩選到能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV跨膜蛋白gp120和gp41的hMSC-env細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可用于制備siRNA的生物納米粒。由于gp120蛋白對(duì)CD4分子具有親和性，使制備的siRNA生物納米粒具有靶向性。本發(fā)明在人CD4+T淋巴細(xì)胞和人造血干細(xì)胞（Human?Hematopoietic?Stem?Cell,hHSC）中檢測(cè)了獲得的生物納米粒對(duì)HIV活病毒的抑制效率，證實(shí)了其可直接作為防治艾滋病的藥物。
【專利說明】穩(wěn)定表達(dá)siRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞系
[0001]本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?01210410507.5，申請(qǐng)日為2012-10-24，發(fā)明名稱為“靶向HIV-1特異siRNA生物納米粒及其制備和應(yīng)用”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0002]本發(fā)明涉及一種可穩(wěn)定表達(dá)siRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞系，本發(fā)明還涉及所述間充質(zhì)干細(xì)胞系在制備防治艾滋病藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0003]基因治療是當(dāng)前艾滋病治療的新方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)又稱為依賴于RNA的基因沉默機(jī)制，是通過雙鏈RNA (double-strand RNA, dsRNA)特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA表達(dá)的現(xiàn)象。即在胞質(zhì)中，雙鏈RNA引發(fā)了同源mRNA的降解，故也被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene-silencing, PTGS)。
[0004]RNAi治療AIDS的研究現(xiàn)狀
[0005]siRNAs或miRNAs可以特異地結(jié)合靶mRNA，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，最終導(dǎo)致基因特異性沉默。RNAi技術(shù)很可能為抗HIV治療的研究打開突破口。
[0006]基因沉默靶點(diǎn)的確 立
[0007]HIV-1基因組編碼區(qū)由9個(gè)開放讀框組成，包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env),2個(gè)調(diào)芐基因(tat、rev)和4個(gè)輔助基因(vif、vpr、vpu、nef )。非結(jié)構(gòu)基因曾被認(rèn)為不是HIV-1病毒復(fù)制所必需的“非必需基因”，但是近年來越來越多的研究表明HIV-1的非結(jié)構(gòu)基因在病毒的致病機(jī)理、感染性、潛伏上都有著重要的作用，因此本發(fā)明將非結(jié)構(gòu)基因作為抗病毒治療的靶點(diǎn)。HIV-1Tat蛋白不僅參與反式激活病毒的表達(dá)，還參與AIDS相關(guān)疾病的病理機(jī)理，如神經(jīng)毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-1的病毒復(fù)制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以與Rev應(yīng)答元件(Rev response element, RRE)結(jié)合,介導(dǎo)未拼接和不完全拼接的mRNA從胞核向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶的合成，引發(fā)HIV基因表達(dá)由早期向晚期的轉(zhuǎn)換。Vpr可以在病毒復(fù)制的早期，反式激活HIV-1LTR，促進(jìn)病毒基因的表達(dá)；介導(dǎo)和增強(qiáng)整合前復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運(yùn)；改變細(xì)胞基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯及細(xì)胞凋亡。病毒感染因子(Viral Infectivity Factor,Vif)可以抵抗載脂蛋白 B mRNA編輯酶催化多妝樣蛋白 3G(human protein apoliprotein B mRNA-editingenzyme-catalytic polypeptide-1 ike-3G,AP0BEC3G)的抗病毒活性，增強(qiáng) HIV-1 毒粒的感染力。
[0008]研究顯示，HIV的gag和nef基因均可以通過RNAi進(jìn)行沉默，RNAi方法治療艾滋病已經(jīng)成為艾滋病治療研究的熱點(diǎn)，研究顯示通過RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV復(fù)制。但其技術(shù)本身仍存siRNA穩(wěn)定性差、容易降解、無靶向性等問題。以重組病毒載體方式導(dǎo)入的siRNA雖然穩(wěn)定性較高，但是又帶來導(dǎo)入效率及載體基因整合等問題。
[0009]人間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)具有多向分化潛能，自身免疫原性低，取材方便。目前美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)其用于自身免疫疾病及基因治療載體等多個(gè)方面的臨床試驗(yàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0010]本發(fā)明的目的是篩選到能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV跨膜蛋白gpl20和gp41的hMSC-env細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可用于制備siRNA的生物納米粒。由于gpl20蛋白對(duì)CD4分子具有親和性，使制備的siRNA生物納米粒具有靶向性。
[0011]本發(fā)明提供了一種靶向Hiv-1特異性siRNA慢病毒為載體間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的siRNA生物納米粒，經(jīng)體外HIV活病毒攻擊實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治療。
[0012]本發(fā)明有如下創(chuàng)新點(diǎn):
[0013]其一,本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可使HIV-1非結(jié)構(gòu)基因vpr, tat, vif, rev基因沉默的6個(gè)siRNAs序列
[0014]本發(fā)明人針對(duì)HIV-1病毒基因組的vpr, tat, rev, vif基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了 14條干擾RNA序列，經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)其中以下6條siRNA序列可以特異地靶向HIV-lvpr，tat, vif,rev:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種可表達(dá)HIV-1跨膜蛋白gpl20hMSC-env細(xì)胞系，名稱為hMSC-env，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6707。
2.權(quán)利要求1所述細(xì)胞系在制備siRNA的生物納米粒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的生物納米粒，具有以下特征: 1)大小在10-500nm之間； 2)具有人間充質(zhì)干細(xì)胞(HumanMesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜； 3)鑲嵌病毒的膜蛋白gpl20； 4)含有靶向HIV-1特異性siRNA，所述siRNA選自SEQID NO:1~SEQ ID NO:6所示序列的I~6種。
4.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞`系在制備治療和預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103695372SQ201310685292
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月24日
【發(fā)明者】滕智平, 馬晶, 郝彥哲, 楊怡姝, 孫曉梅, 曾毅 申請(qǐng)人:曾毅, 滕智平, 楊怡姝