來(lái)源于小麥的抗逆性相關(guān)蛋白TaNAC47及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了來(lái)源于小麥的TaNAC47蛋白及其相關(guān)生物材料在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。TaNAC47是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明TaNAC47蛋白及其相關(guān)生物材料可以提高植物的抗逆性，在提高植物抗旱、抗鹽和抗凍害性方面具有重要作用。本發(fā)明公開(kāi)的TaNAC47蛋白及其生物材料在提高植物抗旱、抗鹽和抗凍害性方面具有重要作用。
【專利說(shuō)明】
來(lái)源于小麥的抗逆性相關(guān)蛋白TaNAC47及其相關(guān)生物材料 與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中來(lái)源于小麥的TaNAC47蛋白及其相關(guān)生物材料與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 作物在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到干旱、低溫和高鹽等非生物逆境的脅迫影響。 這些逆境脅迫因子在全球會(huì)引起作物減產(chǎn)大約50% (Kr印s J. A.，Wu Y.，Chang H. S.，Zhu T., Wang X. &Harper J. F. (2002). Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiology 130, 2129 - 214)。近年來(lái)，氣候異 常，水資源奇缺，可用耕地減少，鹽堿地增多，這些不利因素嚴(yán)重威脅我國(guó)國(guó)家糧食安全。小 麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物，培育高產(chǎn)抗逆的小麥品種是保證國(guó)家糧食安全的重要措施，抗 逆相關(guān)基因的挖掘是抗逆分子育種的基石。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提高植物的抗逆性（如抗凍性、抗鹽性和抗旱 性）。
[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了植物抗逆性相關(guān)蛋白。
[0005] 本發(fā)明所提供的植物抗逆性相關(guān)蛋白，名稱為T(mén)aNAC47,來(lái)源于普通小麥 (Triticum aestivum)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0006] a)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0007] b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0008] 上述植物抗逆性相關(guān)蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009] 其中，序列表中序列2由291個(gè)氨基酸殘基組成。
[0010] 上述b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0011] 上述b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變得到。
[0012] 與TaNAC47相關(guān)的生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 本發(fā)明所提供的與TaNAC47相關(guān)的生物材料，為下述BI)至B5)中的任一種： [0014] BI)編碼TaNAC47所述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0015] B2)包含BI)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0016] B3)包含BI)所述核酸分子的重組載體、或包含B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0017] B4)包含BI)所述核酸分子的重組微生物、或包含B2)所述表達(dá)盒的重組微生物、 或包含B3)所述重組載體的重組微生物；
[0018] B5)包含BI)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或包含B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞系、或包含B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0019] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。BI)所述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)或4) 所不的基因：
[0020] 1)其編碼序列是序列表中序列1的第232-1107位核苷酸的DNA分子或CDNA分 子；
[0021] 2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子或cDNA分子；
[0022] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1 所述蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子；
[0023] 4)與1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要 求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子。
[0024] 其中，序列表中序列1由1277個(gè)核苷酸組成，其編碼序列是序列表中序列1的第 232-1107位核苷酸，編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。
[0025] 這里使用的術(shù)語(yǔ)"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉 眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比 (%)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0026] 上述基因中，所述嚴(yán)格條件可為如下：50°C，在7%十二烷基硫酸鈉（SDS)、0. 5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2 X SSC，0. 1 % SDS中漂洗；還可為：50°C，在 7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，1XSSC，0. 1% SDS 中漂洗； 還可為：50°C，在 7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5XSSC， 0. 1% SDS中漂洗；還可為：50°C，在7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS 中漂洗；還可為：50°C，在 7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA 的混 合溶液中雜交，在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可為：在6XSSC，0. 5% SDS的溶液 中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。
[0027] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼TaNAC47的核酸分子的表達(dá)盒（TaNAC47基 因表達(dá)盒），是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)TaNAC47的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)TaNAC47 基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止TaNAC47轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步,所述表達(dá)盒還可包括 增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異 的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng) 子35S :來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao等人（1999) Plant Physiol 120:979-992);來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)I(PRl)(由水楊酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯）誘導(dǎo)）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子（PIN2) 或LAP啟動(dòng)子（均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)）；熱休克啟動(dòng)子（美國(guó)專利5,187,267);四環(huán) 素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（美國(guó)專利5,057, 422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子 pF128 (CN101063139B (中國(guó)專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子（例 如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子（Beachy等人（1985) EMBO J.4 :3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的 所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子 (NOS終止子）、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂 氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子（參見(jiàn)，例如：〇dell等人（I9S5)Nature313:810 ;Rosenberg等 人（1987) Gene, 56:125 ;Guerineau 等人（1991) Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot (1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0028] 可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述TaNAC47基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體， 所述植物表達(dá)載體包括Gateway系統(tǒng)載體和雙元農(nóng)桿菌載體等，如pD0NR?/Zeo、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯 區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷 酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)?；颍ㄈ?胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類 似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編 碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái) 源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié) 構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 螢光素酶基因等）、抗生素的標(biāo)記基因（如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基 因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，賦予對(duì) methatrexate抗性的dhfr基因和賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因），抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因 等（如抗除莠劑基因）或提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。
[0029] 所述重組微生物具體可為細(xì)菌，酵母，藻和真菌。其中，細(xì)菌可來(lái)自埃希氏 菌屬（Escherichia),歐文氏菌（Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium)、黃桿菌屬 (Flavobacterium),產(chǎn)喊菌屬（Alcaligenes),假單胞菌屬（Pseudomonas),芽胞桿菌屬 (Bacillus)等。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系為非植物繁殖材料。
[0030] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了 TaNAC47或上述與TaNAC47相關(guān)的生物材 料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用，或在制備調(diào)控植物抗逆性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0031] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗逆性可為提高植物抗逆性。所述受體植物具體可為 被子植物；進(jìn)一步，所述被子植物可為雙子葉植物或單子葉植物；所述被子植物可為十字 花科植物。所述抗逆性可為抗凍性、抗鹽性和抗旱性中的三種、兩種或一種。
[0032] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種利用TaNAC47的編碼基因培育抗逆性 轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0033] 本發(fā)明所提供的培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入TaNAC47 的編碼基因得到抗逆性高于所述受體植物的抗逆性轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
[0034] 上述方法中，所述受體植物具體可為被子植物；進(jìn)一步，所述被子植物可為雙子葉 植物或單子葉植物；所述被子植物可為十字花科植物。
[0035] 上述方法中，所述TaNAC47的編碼基因可為上述1)或2)或3)或4)所示的基因； 上述方法中，其中所述TaNAC47基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體植物中，以達(dá)到更好的 表達(dá)效果：
[0036] 1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體種子植 物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述TaNAC47基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以 符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好 地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于 約 60% ;
[0037] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列進(jìn)行修飾；
[0038] 3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括 組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的 選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；
[0039] 4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于 CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā) 明基因進(jìn)行連接；
[0040] 5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列（例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序 列（例如來(lái)源于TMV, MCMV和AMV)。
[0041] 上述方法中，所述TaNAC47基因通過(guò)含有TaNAC47基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體 (TaNAC47基因表達(dá)載體）導(dǎo)入所述受體植物中，所述TaNAC47基因表達(dá)盒中，啟動(dòng)TaNAC47 基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。
[0042] 所述TaNAC47基因表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微 注射，電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織。
[0043] 上文中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代 轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育 種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包 括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0044] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，-KTC低溫處理后，1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因植株的存活率為 87% ±0. 8%，野生型植株的存活率為41% ;150mM NaCl處理后，1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基 因 L9株系、LlO株系和Lll株系的根長(zhǎng)分別是野生型植株根長(zhǎng)的1. 4倍、1. 4倍和1. 5倍； 部分野生型植株的葉子呈現(xiàn)白化現(xiàn)象，野生型植株的白化率為34% ±0.6%，1~3代純合轉(zhuǎn) TaNAC47基因擬南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的所有植株的葉子未出現(xiàn)白化現(xiàn)象，均保 持綠色狀態(tài)；干旱處理35天后復(fù)水的野生型的幼苗全部死亡，而1~ 3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因 有一定比例的存活，1代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因 L9株系、LlO株系和Lll株系的存活率分別 為9. 5% ±0. 4、39% ±0. 8、50% ±0. 4。說(shuō)明本發(fā)明所提供的TaNAC47蛋白是一種與植物 抗逆相關(guān)的蛋白，可用于提高植物的抗凍性、抗鹽性和抗旱性。
[0045] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1為T(mén)aNAC47基因在4°C處理前（Oh)、處理后1、3、6、12、24和48h后的相對(duì)表 達(dá)量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。
[0047] 圖2為T(mén)aNAC47基因在250mM NaCl溶液處理前（Oh)、處理后1、3、6、12、24和48h 后的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。
[0048] 圖3為T(mén)aNAC47基因在16. 1%的PEG6000溶液處理前（Oh)、處理后1、3、6、12、24 和48h后的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。
[0049] 圖4為T(mén)aNAC47基因在200μΜΑΒΑ溶液處理前（Oh)、處理后1、3、6、12、24和48h 后的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。
[0050] 圖5為1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的抗凍性分析:A為低溫處理前擬南芥幼 苗的生長(zhǎng)狀態(tài)；B為-KTC低溫處理后擬南芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0051] 11':野生型擬南芥幼苗山9、1^10、1^11:三個(gè)1'3代純合轉(zhuǎn)了 &熟047基因擬南芥株系。
[0052] 圖6為1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的抗鹽性分析：左圖為在不含NaCl的MS 培養(yǎng)基上擬南芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)；中圖為在含150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)的擬南 芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)；右圖為在含200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)的擬南芥幼苗的生長(zhǎng) 狀態(tài)。
[0053] 11':野生型擬南芥幼苗山9、1^10、1^11:三個(gè)1'3代純合轉(zhuǎn)了&熟047基因擬南芥株系。
[0054] 圖7為1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的抗旱性分析：左圖為22°C，12h光照下 培養(yǎng)3周的擬南芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)；中圖為干旱處理35天后擬南芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)；右圖 為復(fù)水5天后擬南芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0055] 11':野生型擬南芥幼苗山9、1^10、1^11:三個(gè)1'3代純合轉(zhuǎn)了&熟047基因擬南芥株系。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。下述實(shí) 施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú) 特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取 平均值。
[0057] KOD-Plus高保真酶購(gòu)自Τ0Υ0Β0,產(chǎn)品目錄號(hào)為K0D-201。入門(mén)載體pD0NR?/Zeo 為 invitrogen 公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為 12535-035。BP Clonase?II Enzyme Mix 購(gòu)自 invitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 11789-013。LR Clonase?II Enzyme Mix 購(gòu)自 invitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為11791-019。
[0058] 目標(biāo)載體 pEarleyGate 100(Ishikawa K, Maejima K, Komatsu K, Netsu 0,Keima T,Shiraishi Τ,Okano Υ,Hashimoto Μ, Yamaji Υ,Namba S.Fig mosaic emaravirus ρ4 protein is involved in cell-to-cell movement. Journal of General Virology, 2013, 94:682 - 686)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本 申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
[0059] GV3101 : : pMP90 (Yasmin A1Debener T. Transient gene expression in rose petals via Agrobacterium infiltration.Plant Cell Tiss Organ Cult. 2010, 102:245-250)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本申請(qǐng) 實(shí)驗(yàn)。
[0060] 擬南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0 亞型）（Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I, Kim J. A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics. 2004, 36:167-171)。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本申 請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
[0061] 小麥（Triticum aestivum) (Petersen G，Seberg 0,Yde M，Berthelsen K. Phylogenetics relationships of Triticum and Aegilops and evidence for the origin of the A, B and D genomes of common wheat(Triticum aestivum). Molecular Phylogenetics and Evolution. 2006, 39:70-82)。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究 所獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
[0062] 中國(guó)春小麥（Chinese Spring Wheat) (Anderson 0, Huo N, Gu Y. The gene space in wheat: the complete y-gliadin gene family from the wheat cultivar Chinese spring. Functional and Integrative Genomics. 2013, 13:261-273)。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
[0063] 實(shí)施例1、小麥TaNAC47蛋白及其編碼基因的克隆
[0064] 本發(fā)明的發(fā)明人為了研究小麥NAC基因在植物抗逆方面的功能，通過(guò)生物信息學(xué) 的方法,從實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)序的30000條非冗余的小麥全長(zhǎng)cDNA序列中篩選出28個(gè)編碼小 麥NAC蛋白的基因。通過(guò)半定量PCR的方法，對(duì)該28個(gè)小麥NAC基因在逆境條件下的表達(dá) 模式進(jìn)行研究，篩選出受逆境誘導(dǎo)表達(dá)的TaNAC47基因。
[0065] TaNAC47基因全長(zhǎng)cDNA為1277bp，核苷酸序列如序列表中序列1的第1-1277位核 苷酸所示，其編碼序列如序列表中序列1的自5'末端第232-1107位核苷酸所示（876bp)， 編碼的蛋白命名為T(mén)aNAC47,其氨基酸序列如序列表中序列2所示，由291個(gè)氨基酸殘基組 成。
[0066] 實(shí)施例2、TaNAC47基因在不同逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式
[0067] -、TaNAC47基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式
[0068] 對(duì)兩葉一心期的中國(guó)春小麥幼苗進(jìn)行4°C處理，分別在處理前（Oh)、處理后1、3、 6、12、24和48h提取小麥幼苗葉子組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，以上游引 物 1 :5' -CGGCGATACTGCCAAAG-3' 和下游引物 2 :5' -CGGCGACAGGAACGAG-3' 為引物，進(jìn)行實(shí) 時(shí)定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。結(jié)果如圖 1所示，表明TaNAC47基因響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)。
[0069] 二、TaNAC47基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式
[0070] 對(duì)兩葉一心期的中國(guó)春小麥幼苗進(jìn)行250mM NaCl溶液處理，分別在處理前（Oh)、 處理后1、3、6、12、24和48h提取小麥幼苗根組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板， 以上游引物1和下游引物2為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相對(duì)表達(dá) 量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。結(jié)果如圖2所示，表明TaNAC47基因響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)。
[0071] 三、TaNAC47基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式
[0072] 對(duì)兩葉一心期的中國(guó)春小麥幼苗進(jìn)行16. 1%的PEG6000處理，分別在處理前 (Oh)、處理后1、3、6、12、24和48h提取小麥幼苗根組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以該cDNA為 模板，以上游引物1和下游引物2為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相 對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。結(jié)果如圖3所示，表明TaNAC47基因響應(yīng)干旱脅迫 誘導(dǎo)。
[0073] 四、TaNAC47基因在ABA脅迫下的表達(dá)模式
[0074] 對(duì)兩葉一心期的中國(guó)春小麥幼苗進(jìn)行200 μ M ABA溶液處理，分別在處理前（Oh)、 處理后1、3、6、12、24和48h提取小麥幼苗根組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板， 以上游引物1和下游引物2為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相對(duì)表達(dá) 量。內(nèi)參是小麥Tubulin基因。結(jié)果如圖4所示，表明TaNAC47基因響應(yīng)ABA誘導(dǎo)誘導(dǎo)。
[0075] 實(shí)施例3、轉(zhuǎn)TaNAC47基因植株的獲得和抗逆性鑒定
[0076] -、利用Gateway技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，具體步驟如下：
[0077] 1、目標(biāo)基因的獲得：根據(jù)TaNAC47基因的開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)引物如下：
[0078] 上游引物 3 :5 ' -TAATGGTGATGGCGGCGGCG-3 '
[0079] 下游引物 4 :5 ' -TCAGAAGAAGAATGGGCTGA-3 '
[0080] 然后據(jù)Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體的需要，在上游引物3和下游引物4的5'端分 別加入attBl和attB2重組位點(diǎn)（下劃線標(biāo)注attBl和attB2重組位點(diǎn)），分別得到引物如 下：
[0081] 上游引物 5 :5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGTGATGGCGGCGGCG-3，
[0082] 下游引物 6 :5 ' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGAAGAAGAATGGGCTGA-3，
[0083] 提取中國(guó)春小麥的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，用上游引物5和下游引物6 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到attB PCR產(chǎn)物，為保證PCR過(guò)程的保真性，使用KOD-PIus高保真酶進(jìn) 行PCR反應(yīng)，配置PCR反應(yīng)體系如下： IOXReaction Buffer 2. 5 KL dNTP mix (2mM) 2.5 μL MgSO4 (25mM) I. 0 μ|
[0084] 上游引物 5 (10 μΜ) 0,75 μ I 下游引物 6 (10 μΜ) 0. 75 μ I cDNA 2, 0 μL KOO-Plus 0·5μ! DVISO 2.5 μL
[0085] CldH2D 補(bǔ)足至 2:5 μL
[0086] PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋合?95°C預(yù)變性 5min ;然后 95°C 30s，55°C 30s，68°C l_2min，共 35 個(gè)循環(huán)；68°C延伸5min。
[0087] 2、進(jìn)行BP重組反應(yīng)，得到BP反應(yīng)產(chǎn)物。配置如下反應(yīng)體系：
[0088] attB PCR 產(chǎn)物 100-15:0 ng 入門(mén)載體 PDONRltYZeo 3()-50 ng BP ClonaseTMII Enzyme Mix 0.3 μL 柬菌dd Η20 補(bǔ)足至2. :5 (4
[0089] BP 反應(yīng)程序：25°C，8_l2h。
[0090] 3、入門(mén)質(zhì)粒的獲得
[0091] 將2. 5 μ I BP反應(yīng)產(chǎn)物加入50 μ I T0P10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，冰浴30min，42°C 熱擊90s，然后迅速置于冰上2min。加入500 μ I LB培養(yǎng)液，37°C，210rpm/min復(fù)蘇50min， 復(fù)蘇液均勻涂布于加有博萊霉素（Zeocin)(濃度為40 μ g/ml)的固體LB選擇培養(yǎng)基表面， 37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。pD0NR?/Ze〇載體自身帶有致死基因，不能在培養(yǎng)基上生存。通過(guò)步 驟2的BP重組反應(yīng)目標(biāo)基因片段會(huì)取代致死基因，最終得到的克隆即為入門(mén)克隆（entry clone)，質(zhì)粒為入門(mén)質(zhì)粒，將入門(mén)質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該入門(mén)質(zhì)粒含有序列1的自5' 末端第232-1107位核苷酸所示的cDNA分子。
[0092] 4、進(jìn)行LR重組反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。配置如下反應(yīng)體系：
[0093] 入門(mén)質(zhì)粒 100-150 ng 目標(biāo)載體 pE:af IeyGate ΓΟΟ 30-50. ng LR ClonaseTMII Enzyme Mix (), 3 Ml dd H20 補(bǔ)足至 2. 5 μL
[0094] LR 反應(yīng)程序：25°C，8-12h。
[0095] 5、目標(biāo)質(zhì)粒的獲得
[0096] 轉(zhuǎn)化過(guò)程同步驟3,只是將Zeocin替換為卡那霉素（濃度為50 μ g/ml)。 PEarleyGate 100載體同樣帶有致死基因，通過(guò)LR重組反應(yīng)致死基因?qū)?huì)被目標(biāo)基因片段 取代，得到的克隆即為目標(biāo)克?。―estiantion clone)，質(zhì)粒為目標(biāo)質(zhì)粒，將該目標(biāo)質(zhì)粒命 名為 pEarley-TaNAC47，pEarley_TaNAC47 的測(cè)序結(jié)果表明 pEarley_TaNAC47 含有序列 1 的 自5'末端第232-1107位核苷酸所示的cDNA分子。pEarley-TaNAC47為T(mén)aNAC47基因表 達(dá)載體，pEarley-TaNAC47含有TaNAC47基因表達(dá)盒，TaNAC47基因表達(dá)盒中，啟動(dòng)TaNAC47 基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。
[0097] 二、轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥植株的獲得
[0098] 1、將 pEarley_TaNAC47 轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 GV3101: :pMP90，得到含有 pEarley-TaNAC47 的重組農(nóng)桿菌 GV3101/pEarley-TaNAC47。
[0099] 2、擬南芥侵染及轉(zhuǎn)基因植株篩選及鑒定
[0100] 2. 1、擬南芥的培養(yǎng)與侵染：將擬南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0 亞 型）種子用滅菌水（含有體積百分含量為10%次氯酸鈉以及10%吐溫-20的水溶液）搖 動(dòng)消毒15min，在超凈工作臺(tái)中用滅菌水清洗上述消毒的種子至少5次。將清洗完的種子均 勻播種在MS培養(yǎng)基上。MS平板于4°C春化3天，然后置于22°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周。待 小苗長(zhǎng)出四片真葉后移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)，保濕2-3天。擬南芥的生長(zhǎng)對(duì)溫度比較敏感， 20-22°C為比較適宜的培養(yǎng)溫度。當(dāng)擬南芥植株生長(zhǎng)至大部分花蕾處于即將開(kāi)花狀態(tài)時(shí)，用 重組農(nóng)桿菌GV3101/pEarley-TaNAC47進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。將侵染過(guò)的擬南芥平放于托盤(pán)中， 黑暗保濕培養(yǎng)24h，然后放于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。擬南芥侵染1周后根據(jù)擬南芥的生長(zhǎng)狀 態(tài)可再次侵染以提高轉(zhuǎn)化效率，收集轉(zhuǎn)染植株的種子，得到T。代轉(zhuǎn)pEarley-TaNAC47擬南 芥種子。
[0101] 2. 2、陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的初步篩選：將2. 1的T。代轉(zhuǎn)pEarley-TaNAC47 擬南芥種子，于37°C烘箱中烘干(6-8天），然后4°C春化3天。將種子直接撒播在營(yíng)養(yǎng)缽中， 22°C保濕培養(yǎng)1周。待小苗長(zhǎng)出4片真葉后，通過(guò)噴灑除草劑（basta)進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47 基因擬南芥篩選，非陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥在噴灑3天后開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫并停止生長(zhǎng)，2 周后基本死亡。為了將非陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥苗徹底除凈，連續(xù)噴灑2-3次，每次間 隔2-3天，得到初篩陽(yáng)性T。代轉(zhuǎn)pEarley-TaNAC47擬南芥植株。
[0102] 2. 3、陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的鑒定：CTAB法提取2. 2的初篩陽(yáng)性T。代轉(zhuǎn) pEarley-TaNAC47擬南芥植株葉片的基因組DNA，以其為模板，以基因特異性正向引物7 : 5' -TGGATCATGCACGAGTA-3' 和基因特異性反向引物 8 :5' -GCACCTCCTCCTTTGG-3' 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，能得到300bp的目的條帶 的初篩陽(yáng)性T。代轉(zhuǎn)pEarley-TaNAC47擬南芥植株即為T(mén)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥。野 生型擬南芥進(jìn)行上述鑒定實(shí)驗(yàn)無(wú)目的條帶。
[0103] 用上述方法進(jìn)行鑒定T。陽(yáng)性轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的后代，直至獲得T 3代純合轉(zhuǎn) TaNAC47基因擬南芥的種子。
[0104] 三、轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的抗逆性鑒定
[0105] 1、抗凍性分析
[0106] 將擬南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0亞型）（下文簡(jiǎn)稱野生型擬南芥 (WT))和三個(gè)1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥株系（L9、L10、L11)的種子在22°C，12h光 照下進(jìn)行培養(yǎng)，得到3周幼苗，然后將各幼苗在-KTC處理3h進(jìn)行低溫處理，再置于22°C恢 復(fù)培養(yǎng)4天，觀察植株表型并統(tǒng)計(jì)植株死亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)每個(gè)株系10株。
[0107] 低溫處理前后的各幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖5所示，結(jié)果表明野生型植株的存活率為 41 %，1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥植株的存活率為87% ±0. 8%，說(shuō)明與野生型擬南芥 相比，1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的抗凍性明顯提高。
[0108] 2、抗鹽性分析
[0109] 將野生型擬南芥（WT)株系和三個(gè)1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥株系（L9、L10、 LI 1)的種子在22°C，12h光照下進(jìn)行垂直培養(yǎng)，得到5天幼苗，將根長(zhǎng)一致的各幼苗轉(zhuǎn)移到 含150mM NaCl和200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)進(jìn)行鹽脅迫處理，以在不含NaCl的 MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)得到的根長(zhǎng)一致的幼苗為對(duì)照，鹽脅迫處理5天后觀察植株表型并統(tǒng) 計(jì)植株根長(zhǎng)和植株白化率（鹽脅迫處理后有白化葉片的植株株數(shù)與鹽脅迫處理前植株株 數(shù)之比）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)每個(gè)株系8株。
[0110] 各幼苗的狀態(tài)如圖6所示。該圖表明150mM NaCl處理后，1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基 因擬南芥株系的根長(zhǎng)比野生型植株的長(zhǎng)，野生型擬南芥的根長(zhǎng)明顯受到抑制，1代純合轉(zhuǎn) TaNAC47基因擬南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的根長(zhǎng)分別是野生型擬南芥根長(zhǎng)的1. 4 倍、1. 4倍和1. 5倍；部分野生型擬南芥植株的葉子呈現(xiàn)白化現(xiàn)象，野生型擬南芥植株的白 化率為34% ±0. 6%，1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的所 有植株的葉子未出現(xiàn)白化現(xiàn)象，均保持綠色狀態(tài)。200mM NaCl處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是，T3代純 合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的根長(zhǎng)比野生型擬南芥植株的根長(zhǎng) 長(zhǎng)，1代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的根長(zhǎng)分別是野生型擬 南芥植株根長(zhǎng)的1. 26倍、1. 32倍和1. 29倍；全部野生型擬南芥植株葉子都呈現(xiàn)白化現(xiàn)象， 野生型擬南芥植株的白化率為96% ±0. 5%，而1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的葉子基 本都保持綠色狀態(tài)。
[0111] 3、抗旱性分析
[0112] 將野生型擬南芥（WT)和三個(gè)1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥株系（L9、L10、L11) 的種子在22°C，12h光照下進(jìn)行培養(yǎng)，得到3周幼苗，將該3周幼苗進(jìn)行干旱處理而后復(fù)水。 具體為3周幼苗干旱處理前澆足營(yíng)養(yǎng)液，之后一直不澆任何液體（包括營(yíng)養(yǎng)液和水），35天 后，再澆營(yíng)養(yǎng)液，5天后觀察植株表型并統(tǒng)計(jì)植株存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)每個(gè)株 系10株。干旱處理前后以及復(fù)水后的各幼苗的狀態(tài)如圖7所示。圖7表明，復(fù)水后野生型 擬南芥的幼苗在干旱處理后全部死亡，而1代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥有一定比例的存 活，1代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的存活率分別為9. 5% ±0. 4%、39% ±0. 8%、50% ±0. 4%。進(jìn)一步表明1~3代純合轉(zhuǎn)TaNAC47基因擬南芥的抗 旱性明顯提高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)； b) 將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。2. 與權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B5)中的任一種： B1)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子； B2)包含B1)所述核酸分子的表達(dá)盒； B3)包含B1)所述核酸分子的重組載體、或包含B2)所述表達(dá)盒的重組載體； B4)包含B1)所述核酸分子的重組微生物、或包含B2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或包 含B3)所述重組載體的重組微生物； B5)包含B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或包含B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物 細(xì)胞系、或包含B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子為如下1)或 2)或3)或4)所示的基因： 1) 其編碼序列是序列表中序列1的第232-1107位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2) 核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子或cDNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述 蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子； 4) 與1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1 所述蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子。 4. C或D的應(yīng)用： C、 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用或在制備調(diào)控植物抗逆性產(chǎn)品 中的應(yīng)用； D、 權(quán)利要求2或3所述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用或在制備調(diào)控植物抗 逆性產(chǎn)品中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗逆性為抗凍性、抗鹽性和抗旱性中 的三種、兩種或一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為十字花科植物。7. 培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編 碼基因得到抗逆性高于所述受體植物的抗逆性轉(zhuǎn)基因植物的步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述受體植物為十字花科植物。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因 為如下1)或2)或3)或4)所示的基因： 1) 其編碼序列是序列表中序列1的第232-1107位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2) 核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子或cDNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述 蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子； 4) 與1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1 所述蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子。10.根據(jù)權(quán)利要求7或8或9所述的方法，其特征在于：所述抗逆性為抗凍性、抗鹽性 和抗旱性中的三種、兩種或一種。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK105859858SQ201510031847
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日
【發(fā)明人】孔秀英, 張麗娜, 夏川, 張立超, 趙光耀, 賈繼增
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所