膽固醇脫氫酶的基因優(yōu)化及其高效表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種膽固醇脫氫酶的基因優(yōu)化及其高效表達(dá)，屬于利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提出了優(yōu)化的、適合大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的膽固醇7,8-脫氫酶的DNA序列，以及有關(guān)工程菌的構(gòu)建和膽固醇7,8-脫氫酶表達(dá)優(yōu)化工藝的研究。本發(fā)明將優(yōu)化后的基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌及畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，相比于優(yōu)化前，該優(yōu)化基因在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)量有顯著提高。
【專利說明】膽固醇脫氫酶的基因優(yōu)化及其高效表達(dá)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及基于大腸桿菌密碼子偏愛設(shè)計(jì)優(yōu)化的重組膽固醇7，8-脫氫酶的DNA序列，以及大腸桿菌分泌表達(dá)膽固醇7，8-脫氫酶的方法；以及基于畢赤酵母密碼子偏愛設(shè)計(jì)優(yōu)化的重組膽固醇7，8-脫氫酶的DNA序列，以及畢赤酵母分泌表達(dá)膽固醇7，8-脫氫酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素D3是人與動(dòng)物生長、發(fā)育、繁殖、維持生命和保持健康必不可少的一種脂溶性維生素。它的主要作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)腸內(nèi)鈣磷吸收和骨質(zhì)鈣化，維持血鈣和血磷的平衡。人和動(dòng)物能從兩個(gè)途徑獲取維生素D3, —種途徑是通過飲食從一些動(dòng)植物組織直接獲取，另一種途徑是通過UV-B波段光照射，將廣泛存在于脊椎動(dòng)物皮膚里的內(nèi)源物一7-脫氫膽固醇(ProD3),轉(zhuǎn)化成維生素D3前體(PreD3),然后再異構(gòu)成維生素D3。
[0003]長期以來只有少數(shù)發(fā)達(dá)國家能夠生產(chǎn)維生素D3，其生產(chǎn)技術(shù)被國際上三大公司(瑞士 Roche公司，德國Basf公司和荷蘭Duphar公司)所壟斷，并對(duì)我國進(jìn)行嚴(yán)密封鎖。中國科學(xué)院原感光化學(xué)研究所(現(xiàn)理化所組成部分)維生素D3項(xiàng)目組在多年從事光化學(xué)研究的基礎(chǔ)上，于九十年代初提出一條新的化學(xué)合成路線，并取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但化學(xué)反應(yīng)步驟多，涉及許多有機(jī)試劑的使用，條件不易控制，且副產(chǎn)物多，轉(zhuǎn)化效率低。利用生物技術(shù)合成維生素D3是一個(gè)較好的選擇，目前不管何種技術(shù)，制造維生素D3的難點(diǎn)重點(diǎn)都在于怎樣合成7-脫氫膽固醇。
[0004]目前，已有以角鯊烯、醋酸鹽等為底物合成7-脫氫膽固醇的方法，但由于原材料昂貴、反應(yīng)步驟繁瑣等原因，都無法形成工業(yè)化生產(chǎn)。黃時(shí)海等也曾通過分子克隆技術(shù)，以膽固醇為底物生物轉(zhuǎn)化合成7-脫氫膽固醇，但卻忽略了異源的膽固醇脫氫酶基因與大腸桿菌宿主細(xì)胞的密碼子的差異性，而這可能是進(jìn)一步提高膽固醇脫氫酶產(chǎn)量的一個(gè)限制性因素。密碼子優(yōu)化是一種對(duì)異源基因的密碼子進(jìn)行調(diào)節(jié)已達(dá)到適應(yīng)宿主細(xì)胞的密碼子的方法。其實(shí)際上是通過對(duì)同義密碼子的改變進(jìn)而改變基因的核酸序列，卻不改變其氨基酸序列。越來越多的證據(jù)表明，同義密碼子的改變可以通過改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及改善與宿主細(xì)胞tRNA水平的匹配度，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0005]綜上所述，目前7-脫氫膽固醇的生產(chǎn)存在以下不足:1、部分生產(chǎn)工藝反應(yīng)條件苛亥|J，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備及生產(chǎn)條件要求較高，增加生產(chǎn)成本；2、部分方法蛋白表達(dá)量較低，不適合
工業(yè)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)上述存在的問題與不足，提供一種經(jīng)密碼子優(yōu)化后的編碼膽固醇7，8-脫氫酶的D NA序列。本發(fā)明經(jīng)系統(tǒng)密碼子優(yōu)化，并沒有改變mRNA起始端的穩(wěn)定性，優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶基因降低了轉(zhuǎn)錄能量屏障，提高了轉(zhuǎn)錄效率，有效提高了其在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)量。[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種編碼膽固醇7，8-脫氫酶的基因序列(SEQIDN0.2)，其特征在于，該序列編碼了 SEQIDN0.1所示的膽固醇7，8-脫氫酶。
[0008]本發(fā)明另一方面提供了一種編碼膽固醇7，8-脫氫酶的基因序列(SEQIDN0.3)，其特征在于，該序列編碼了 SEQIDN0.1所示的膽固醇7，8-脫氫酶。
[0009]本發(fā)明提供了一種原核表達(dá)載體pET32a(+)-daf_36，它含有所述的DNA編碼序列SEQIDN0.2。
[0010]本發(fā)明提供了兩種真核表達(dá)載體PPIC3.5K-daf-36和pPIC9K_daf-36，它含有所述的DNA編碼序列SEQIDN0.3。
[0011]本發(fā)明提供了一種大腸桿菌工程細(xì)胞BL21(DE3)，它含有所述的原核表達(dá)載體pET32a(+)_daf_36。
[0012]本發(fā)明提供了兩種畢赤酵母工程細(xì)胞GS115，它含有所述的真核表達(dá)載體pPIC3.5K-daf-36 和 pPIC9K_daf-36。
[0013]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0014]本發(fā)明提供了一種密碼子經(jīng)過改造且mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高的重組膽固醇7，8-脫氫酶的優(yōu)化基因，其核苷酸序列為SEQIDN0.2及SEQIDN0.3所示，其特征在于自線蟲(Caenorhabditis elegans)中獲得具有膽固醇7，8_脫氫酶功能的daf_36基因全序列的基礎(chǔ)上，分別改變了 343個(gè)堿基及317個(gè)堿基，優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶基因，降低了轉(zhuǎn)錄能量屏障，提高了轉(zhuǎn)錄效率。由以下方法獲得:`
[0015]米用系統(tǒng)密碼子優(yōu)化的方法，對(duì)來源于線蟲(Caenorhabditis elegans)的daf-36基因的密碼子，分別根據(jù)E.coli密碼子的使用頻率及P.pastoris密碼子的使用頻率進(jìn)行優(yōu)化。密碼子的優(yōu)化貫穿整條基因序列。
[0016]本發(fā)明所述的編碼膽固醇7，8-脫氫酶的優(yōu)化基因，具有SEQIDN0.2及SEQIDN0.3所示的核苷酸序列，有以下特征:
[0017]本發(fā)明自線蟲(Caenorhabditis elegans)中獲得具有膽固醇7，8_脫氫酶功能的daf-36基因全序列，將該基因在不改變其蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量的調(diào)整，不穩(wěn)定序列的刪除，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)等影響因素，分別按照大腸桿菌及巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子對(duì)該序列進(jìn)行改造，其中分別改變了 343個(gè)堿基及317個(gè)喊基。
[0018]本發(fā)明要求保護(hù)的膽固醇7，8-脫氫酶的重組表達(dá)載體，可用如下方法生產(chǎn)。該方法包括:
[0019]1.分別提取 pUC57-daf-36、pET32a(+)、pPIC3.5K 和 pPIC9K 質(zhì)粒；
[0020]2.分別用EcoR I和Hind III對(duì)質(zhì)粒pUC57_daf-36和pET32a (+)進(jìn)行雙酶切處理，用EcoR I和Not I對(duì)質(zhì)粒pUC57-daf-36、pPIC3.5K和pPIC9K進(jìn)行雙酶切處理；
[0021]3.將daf-36基因片段、表達(dá)載體pET32a(+)、pPIC3.5K和pPIC9K酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收后，將目的基因與載體片段分別連接，由此構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a(+)-daf-36、pPIC3.5K-daf-36 和 pPIC9K_daf-36。
[0022]注:以上提到的大腸桿菌培養(yǎng)基配方如下:
[0023]LB:0.5%Yeast Extract,l%Peptone,l%NaCl, pH 7.2。
[0024]畢赤酵母培養(yǎng)基配方如下:[0025]YPD:l%Yeast Extract,2%Peptone,2%Dextrose(glucose)
[0026]本發(fā)明要求保護(hù)的含有該膽固醇7，8-脫氫酶重組表達(dá)載體的重組宿主菌，可用如下方法生產(chǎn):
[0027](I)將重組質(zhì)粒pET32a(+)-daf_36轉(zhuǎn)入E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了大腸桿菌重組表達(dá)菌株 E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-daf-36。
[0028]膽固醇7，8-脫氫酶表達(dá)情況的檢測方法可以采用SDS-PAGE的方法分析，用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE來分析蛋白表達(dá)。
[0029](2)將重組質(zhì)粒 pPIC3.5K-daf-36 和 pPIC9K-daf_36 分別轉(zhuǎn)入 P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)菌株P(guān).pastor i s GS115/pPIC3.5K_daf-36及P.pastoris GS115/pPIC9K_daf-36。
[0030]膽固醇7，8-脫氫酶表達(dá)情況的檢測方法可以采用SDS-PAGE的方法分析，用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE來分析上清及細(xì)胞沉淀的蛋白表達(dá)。
[0031]本發(fā)明提供了一種密碼子經(jīng)過改造且mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高的重組膽固醇7, 8-脫氫酶的優(yōu)化基因，其核苷酸序列為SEQIDN0.2及SEQIDN0.3所示。密碼子的優(yōu)化沒有改變mRNA起始端的穩(wěn)定性，優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶基因降低了轉(zhuǎn)錄能量屏障，提高了轉(zhuǎn)錄效率，有效提高了其在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)量。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1中圖1a膽固醇7，8-脫氫酶(daf-36)原基因密碼子使用頻率，圖1b按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶基因(daf-36-pl)的密碼子使用頻率。
[0033]圖2中圖2a膽固醇7，8-脫氫酶(daf-36)原基因密碼子使用頻率，圖2b按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶基因(daf-36-p2)的密碼子使用頻率。
[0034]圖3中圖3a膽固醇7，8_脫氫酶(daf_36)原基因密碼子優(yōu)化前于大腸桿菌中的表達(dá)，圖3b膽固醇7，8-脫氫酶(daf-36)原基因密碼子優(yōu)化前于畢赤酵母中的表達(dá)。
[0035]圖4為大腸桿菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-daf-36誘導(dǎo)表達(dá)膽固醇7, 8-脫氫酶蛋白(12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測)，膽固醇7，8-脫氫酶DAF-36分子量約為49.66kDa，與結(jié)果相符。
[0036]圖5 為畢赤酵母菌株P(guān).pastoris GS115/pPIC3.5K_daf-36 及P.pastoris GS115/pPIC9K-daf-36誘導(dǎo)表達(dá)膽固醇7，8-脫氫酶蛋白(12%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測)，膽固醇7，8-脫氫酶DAF-36分子量約為49.66kDa，與結(jié)果相符。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038]實(shí)施例1:膽固醇7，8-脫氫酶基因的優(yōu)化以及重組大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建、篩選及誘導(dǎo)表達(dá)，制備的步驟是:
[0039]1.1膽固醇7，8-脫氫酶基因daf-36的優(yōu)化設(shè)計(jì)
[0040](I)本發(fā)明從線蟲(Caenorhabditis elegans)中克隆獲得的膽固醇7，8_脫氫酶原始基因(daf-36)序列(SEQIDN0.1)，其原基因全長1287bp，共編碼428個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子；
[0041](2)通過 http://people, mb1.ucla.edu/sumchan/caltor.html 分析，在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛密碼子；
[0042](3)綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調(diào)整、不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等影響因素，按照大腸桿菌的偏愛密碼子，采用系統(tǒng)密碼子優(yōu)化的方法，對(duì)膽固醇7, 8-脫氫酶基因(daf-36)序列氨基酸密碼子進(jìn)行改造；
[0043](4)將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶全基因((1&卜36-?1)由人工合成(SEQIDN0.2)，合成后并連接在載體pUC57上。
[0044]1.2膽固醇7，8-脫氫酶重組大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建和篩選
[0045]1.2.1膽固醇7，8-脫氫酶基因重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
[0046]分別提取pUC57-daf_36、pUC57_daf-36-pl 和 pET32a(+)質(zhì)粒，并分別用 EcoR I和Hind III對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，并分別將daf-36及daf-36-pl基因片段和表達(dá)載體pET32a(+)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收及連接，通過菌液PCR、酶切和測序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行鑒定，由此構(gòu)建了大腸桿菌重組表達(dá)載體pET32a(+) -daf-36及pET32a(+) -daf-36-pl。
[0047]1.2.2膽固醇7，8-脫氫酶重組大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建
[0048]分別將大腸桿菌重組表達(dá)載體pET32a (+) -daf-36及pET32a (+) -daf-36-p I轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌株中，通過菌液PCR鑒定，構(gòu)建了大腸桿菌重組表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-daf-36 及 E.coli BL21 (DE3)/pET32a(+)-daf-36-pl。
[0049]1.3膽固醇7，8-脫氫酶DAF-36在大腸桿菌中的誘導(dǎo)及優(yōu)化表達(dá)
[0050]于37°C條件下，添加0.5mM IPTG誘導(dǎo)4h后，用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE來分析蛋白表達(dá)。(圖3 (a)，圖4)
[0051]實(shí)施例2:膽固醇7，8-脫氫酶基因的優(yōu)化以及重組畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建和篩選，制備的步驟是:
[0052]2.1膽固醇7，8-脫氫酶基因daf-36的優(yōu)化設(shè)計(jì)
[0053](I)本發(fā)明從線蟲(Caenorhabditis elegans)中克隆獲得的膽固醇7，8_脫氫酶原始基因(daf-36)序列，其原基因全長1287bp，共編碼428個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子；
[0054](2)通過http://www.jcat.de/分析,在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下,選用畢赤酵母偏愛密碼子；
[0055](3)綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調(diào)整、不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等影響因素，按照畢赤酵母的偏愛密碼子，采用系統(tǒng)密碼子優(yōu)化的方法，對(duì)膽固醇
7,8-脫氫酶基因(daf-36)序列氨基酸密碼子進(jìn)行改造；
[0056](4)將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的膽固醇7，8-脫氫酶全基因(daf-36_p2)由人工合成，合成后并連接在載體PUC57上。
[0057]2.2膽固醇7，8-脫氫酶重組畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建和篩選
[0058]2.2.1膽固醇7，8-脫氫酶基因重組畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
[0059]分別提取pUC57-daf-36、pUC57_daf-36-p2 和 pPIC3.5K 及 pPIC9K 質(zhì)粒，并分別用EcoR I和Not I對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，并分別將daf-36及daf-36-p2基因片段與表達(dá)載體PPIC3.5K及pPIC9K酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行回收及連接，通過菌液PCR、酶切和測序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行鑒定，由此構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)載體PPIC3.5K-daf-36、pPIC9K-daf-36、pPIC3.5K-daf-36-p2 及 pPIC9K_daf-36-p2。
[0060]2.2.2膽固醇7，8-脫氫酶重組畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建
[0061]分別將畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC3.5K-daf_36、pPIC9K_daf-36、pPIC3.5K-daf-36-p2 及 pPIC9K_daf-36-p2 經(jīng) Bgl II 進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)化 P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞，通過基因組PCR鑒定，構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)菌株P(guān).pastorisGS115/pPIC3.5K-daf-36、P.pastoris GSl15/pPIC9K_daf-36、P.pastoris GS115/pPIC3.5K-daf-36-p2 及 P.pastoris GS115/pPIC9K_daf-36-p2。
[0062]2.3膽固醇7，8-脫氫酶DAF-36在畢赤酵母中的誘導(dǎo)及優(yōu)化表達(dá)
[0063]①挑取單克隆，接種至IOOmL BMGY 中，30°C，250r/min，搖至 0D_=2-6 ；[0064]②室溫1500_3000g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用1/5-1/10原培養(yǎng)基體積的BMMY重懸細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；
[0065]③在250mL搖瓶中加入上述培養(yǎng)物，加蓋兩層滅菌紗布，放入搖床繼續(xù)生長；
[0066]④每24h，加甲醇至終濃度為0.5%以繼續(xù)誘導(dǎo)；
[0067]⑤在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取ImL培養(yǎng)基至1.5mL離心管，分別收集上清及沉淀，存于-80 0C ；
[0068]時(shí)間點(diǎn):12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h。
[0069]⑥用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE來分析上清及細(xì)胞沉淀的蛋白表達(dá)。(圖3 (b)，圖5)
【權(quán)利要求】
1.一種編碼膽固醇7，8-脫氫酶的基因序列，其特征在于:所述序列為SEQIDN0.2，該序列編碼了 SEQIDN0.1所示的膽固醇7，8-脫氫酶。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的膽固醇7，8-脫氫酶優(yōu)化基因的重組原核表達(dá)載體，其特征在于:所述重組原核表達(dá)載體是重組大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組原核表達(dá)載體，其特征在于:所述載體為pUC57-daf-36、pUC57-daf-36-pl和 pET32a(+)。
4.一種含有權(quán)利要求2所述重組表達(dá)載體的基因工程菌，其特征在于:所述的基因工程的宿主菌為大腸桿菌。
5.一種編碼膽固醇7，8-脫氫酶的基因序列，其特征在于:所述序列為SEQIDN0.3，該序列編碼了 SEQIDN0.1所示的膽固醇7，8-脫氫酶。
6.一種含有權(quán)利要求5所述的膽固醇7，8-脫氫酶優(yōu)化基因的重組真核表達(dá)載體，其特征在于:所述重組真核表達(dá)載體是重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組真核表達(dá)載體，其特征在于:所述載體為pUC57-daf-36、pUC57-daf-36-p2 和 pPIC3.5K 及 pPIC9K 質(zhì)粒。
8.一種含有權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體的基因工程菌，其特征在于:所述的宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。`
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103882037SQ201310733457
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】王敏, 申雁冰, 湯睿, 牛丹丹, 格日勒, 鄭宇
申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)