檢測外周血游離dna的試劑盒及寡核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測外周血游離DNA的試劑盒和寡核苷酸，具體涉及一組檢測外周血游離DNA的寡核苷酸，見序列表SEQ?ID?No.1至SEQ?ID?No.4所示的寡核苷酸序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡便。
【專利說明】檢測外周血游離DNA的試劑盒及寡核苷酸
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用外周血游離DNA進行腫瘤篩查、療效評估以及預(yù)后預(yù)測的試劑盒。屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]早期診斷、早期治療是提高腫瘤臨床治愈率和改善預(yù)后的關(guān)鍵，腫瘤標(biāo)志物的鑒定與應(yīng)用是決定早期發(fā)現(xiàn)以及療效評估的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)今使用的大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物都是代謝相關(guān)的糖蛋白，通常是通過免疫測定技術(shù)進行檢測的，臨床資料顯示，目前臨床應(yīng)用的蛋白類腫瘤標(biāo)志物一方面并非在所有腫瘤中均表現(xiàn)異常，在沒有這些標(biāo)志物異常的腫瘤患者中，對其治療的有效性將無法通過簡易的外周血檢測進行評價，只能通過影像學(xué)手段進行檢查(承受射線輻射)，難以進行實時的療效評估；另一方面常規(guī)的蛋白類腫瘤標(biāo)志物的通常敏感性較低，一些腫瘤中這些標(biāo)志物通常滯后于腫瘤的發(fā)生，需要進行多指標(biāo)組合檢測，增加的檢測的時間與費用；因而在癌癥早期的篩查時受到了極大限制，這樣就迫切需要尋找更為敏感的標(biāo)志物。
[0003]外周血游離DNA是由細(xì)胞死亡后釋放到血液中細(xì)胞外DNA的總稱，研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤患者游離DNA與正常人相比有很大差異，正常人外周血中游離DNA主要來自凋亡的細(xì)胞，由細(xì)胞核DNA和線粒體DNA組成，其含量極其微弱，通常每毫升僅為納克水平，而腫瘤患者血液循環(huán)中游離DNA水平卻顯著高于正常人，目前發(fā)現(xiàn)，外周血游離DNA含量增高是各類腫瘤生長過程中的一種普遍現(xiàn)象；同時在正常人中，正常細(xì)胞死亡的方式通常是凋亡，釋放到外周血中的DNA片段一般較短(200bp以下)，而在腫瘤患者中，腫瘤細(xì)胞常死亡主要是壞死，而壞死細(xì)胞所釋放到外周血中的DNA通常表現(xiàn)為不同的長度，這樣相對于正常人，腫瘤患者外周血游離DNA中長片段DNA的含量也將會增加；另外，在腫瘤細(xì)胞來源與正常細(xì)胞來源的DNA中，某些靶基因的表`觀遺傳學(xué)修飾(甲基化)有顯著的不同。尤其需要提及的是血漿游離DNA在體內(nèi)的代謝速度非?？欤胨テ趦H數(shù)分鐘，可實時反映患者的狀況。據(jù)此可通過外周血DNA的檢測對腫瘤療效以及預(yù)后進行評估。其在對高危險個體的篩檢(腫瘤早期診斷)、疾病分期也具有重要的意義，是一種方便、快捷、敏感、特異的檢測手段。同時基于循環(huán)DNA檢測無創(chuàng)傷性，避免了常規(guī)檢測需要采集癌組織標(biāo)本的困難，非常適合對療效的動態(tài)觀察與評估，總之，外周血游離DNA的檢測正以其不可替代的優(yōu)勢逐漸被人們所重視，并正在成為腫瘤應(yīng)用研究的焦點。
[0004]由于外周血游離DNA相對于組織樣本非常微量，這樣一方面需要選擇基因組中高拷貝的DNA序列，另一方面也需要選擇高靈敏度的檢測方法。Alu序列以及LINE-1序列是基因組中高拷貝的重復(fù)序列，目前的研究顯示，LINE-1僅在腫瘤細(xì)胞以及細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下激活，而在正常細(xì)胞中處于沉默狀態(tài)，這種變化主要是通常表觀遺傳學(xué)修飾實現(xiàn)的，即LINE-1的激活體現(xiàn)在其啟動子的去甲基化，而沉默則體現(xiàn)在其啟動子的超甲基化。所以通過對其啟動子區(qū)域的甲基化水平變化的檢測，可評估其激活與否。
[0005]本試劑盒通過設(shè)計LINE-1啟動子區(qū)域中包含CG島的靶序列(含有甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的作用位點)，在其兩側(cè)的高保守區(qū)域設(shè)計PCR引物，同時選取Alu序列作為內(nèi)參，選擇區(qū)域中不包含有上述甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的作用位點，設(shè)計PCR引物，兩種擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析進行證實。這樣理論上正常細(xì)胞來源的LINE-1啟動子序列由于高甲基化，甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶則不能切開，表現(xiàn)為酶切前后PCR擴增的Ct值沒有明顯的差異，而腫瘤細(xì)胞來源的LINE-1啟動子序列由于出現(xiàn)去甲基化，甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶則可以切開，表現(xiàn)為酶切前后PCR擴增的Ct值有明顯的增加。同時由于設(shè)計的LINE-1擴增片段(256bp)與Alu (112bp)擴增片段長度差別較大，其Ct值差值可以作為評估外周血游離DNA長度變化的重要指標(biāo)。另外Alu序列由于在基因組中的拷貝數(shù)很高，其濃度的變化也反映出了血漿游離DNA總濃度的變化。所以通過對以上三種指標(biāo)的檢測可敏感的反映出腫瘤的有關(guān)信息，對腫瘤早期預(yù)警的篩查、療效評估以及預(yù)后預(yù)測的應(yīng)用具有重大的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測外周血游離DNA的寡核苷酸。
[0007]本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的檢測外周血游離DNA的試劑盒。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]本發(fā)明提供了一組檢測外周血游離DNA的寡核苷酸，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.4所示堿基序列的寡核苷酸組成；
[0010]其中，序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分別為擴增LINE-1基因的上游引物和下游引物，序列SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4分別為擴增Alu基因的上游引物和下游引物，具體序列如下:
[0011]LINE-1 上游引物(L1-256-U):5，-GAGAGGAGCCAAGATGGC-3，(SEQ ID N0.1)
[0012]LINE-1 下游引物(L1-256-D):5，-TCYGTCACCCCTTTCTTTGA-3，(SEQ ID N0.2)
[0013]Alu 上游引物(ALU-112-U):5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’ (SEQ ID N0.3)
[0014]Alu 下游引物(ALU-112-D):5，-TTTAGTAGAGACGGGGTTTCAC-3，(SEQ ID N0.4)
[0015]上述引物序列中Y代表C或T。
[0016]本發(fā)明還提供一種檢測外周血游離DNA的試劑盒，包括以下試劑:
[0017]I)酶切反應(yīng)液，其包括=HpaII酶，10Xbuffer ；
[0018]2) qPCR反應(yīng)液，其包括:擴增LINE-1基因的上游引物和下游引物，擴增Alu基因的上游引物和下游引物，和含有SYBR Green的PCR反應(yīng)液；
[0019]其中，擴增LINE-1基因的上游引物和下游引物分別是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，擴增Alu基因的上游引物和下游引物分別是SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列；
[0020]進一步地，含有SYBR Green的PCR反應(yīng)液通常使用商品化試劑，例如，
2X SuperReal PreMix Plus (購自天根生化科技有限公司)，或 DRR041A SYBR Premix ExTaq TM (購自 TaKaRa Bio Inc)；
[0021 ] 3)用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA標(biāo)準(zhǔn)品；[0022]4)陰性對照DNA樣品:酶切前后熒光定量PCR的ΛΛ Ct的變化小于臨界值；
[0023]5)陽性對照DNA樣品:酶切前后熒光定量PCR的ΛΛ Ct的變化大于臨界值；
[0024]6) ddH20。
[0025]本發(fā)明還提供了一種檢測外周血游離DNA的試劑盒的使用方法:
[0026]I)抽提外周血游離DNA ；
[0027]2)使用HpaII酶對外周血游離DNA進行酶切，同時將未酶切的外周血游離DNA作為對照組；酶切體系見表1:
[0028]表1酶切體系
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一組檢測外周血游離DNA的寡核苷酸，其特征在于，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.4所示堿基序列的寡核苷酸組成；其中SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分別為擴增LINE-1基因的上、下游引物，SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4分別為擴增Alu基因的上、下游引物。
2.一種檢測外周血游離DNA的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成: O酶切反應(yīng)液，其包括=HpaII酶，IOXbuffer ； 2)qPCR反應(yīng)液，其包括:擴增LINE-1基因的上游引物和下游引物，擴增Alu基因的上游引物和下游引物，和含有SYBR Green的PCR反應(yīng)液； 其中，擴增LINE-1基因的上游引物和下游引物分別是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，擴增Alu基因的上游引物和下游引物分別是SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列； 3)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA標(biāo)準(zhǔn)品； 4)陰性對照DNA樣品； 5)陽性對照DNA樣品；
6)ddH20。
3.一種檢測外周血游離DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)抽提外周血游離DNA·； 2)使用HpaII酶對外周血游離DNA進行酶切； 3)進行實時熒光PCR定量擴增，其中，使用的引物為序列表SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的擴增LINE-1基因上、下游引物，和序列表SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的擴增Alu基因的上、下游引物； 4)結(jié)果判定，按照如下公式計算 (a)血漿游離DNA中Alu的絕對濃度:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定血漿游離DNA中Alu的絕對濃度；
(b)Δ Ct= I (Ct-Llprecut - Ct-Aluprecut) I ； (c)Δ Δ Ct= I (Ct-Llprecut - Ct-Aluprecut)—(Ct-Llpostcut -Ct-Alupostcut) I ； 其中，血漿游離DNA中Alu的絕對濃度小于2.5ng/ml為陰性；Λ Ct值大于3.2為陰性；ΛΛ Ct值小于0.8為陰性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710452SQ201310741282
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】朱運峰, 張愛群 申請人:朱運峰