利用含離子液體反應(yīng)體系制備手性醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在含離子液體體系中制備(R)-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，所述方法為：以棘孢木霉ZJPH0810培養(yǎng)獲得的濕菌絲體作為催化劑，以3,5-雙三氟甲基苯乙酮作為底物，在式（Ⅰ）所示氨基酸類離子液體與pH值為5.5～8.0的磷酸緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中，于25～45℃、100～300r/min條件下反應(yīng)6～50小時，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到(R)-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇產(chǎn)物；本發(fā)明提出的氨基酸類離子液體具有促進(jìn)輔酶再生的功能，毒性較低且綠色環(huán)保、可再生、可生物降解，將含該類離子液體反應(yīng)體系用于生物催化反應(yīng)，工藝環(huán)境友好、符合綠色發(fā)展策略，可克服傳統(tǒng)離子液體生物可降解性差且不可再生等缺點。
【專利說明】利用含離子液體反應(yīng)體系制備手性醇的方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種(R)_3，5-雙三氟甲基苯乙醇的生物催化制備方法，特別涉及一種利用含氨基酸類離子液體的反應(yīng)體系提高微生物細(xì)胞催化制備阿瑞吡坦藥物關(guān)鍵手性中間體(R)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇反應(yīng)效率的方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002](R)_3，5-雙三氟甲基苯乙醇是合成用于治療化療引起的惡心和嘔吐的NK-1受體拮抗劑-阿瑞吡坦藥物的關(guān)鍵手性中間體。與化學(xué)法相比，采用微生物細(xì)胞催化潛手性3，5-雙三氟甲基苯乙酮不對稱還原制備(R)_3，5-雙三氟甲基苯乙醇具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高等諸多優(yōu)點。本發(fā)明在發(fā)明人原有發(fā)明“棘孢木霉及在合成(R)_3，5-雙三氟甲基苯乙醇中的應(yīng)用”(CN101724568A)的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)了利用含氨基酸離子液體共溶劑體系中生物催化制備阿瑞吡坦中間體的新方法，以解決原發(fā)明專利(CN101724568A)中存在的底物濃度(80mM)和產(chǎn)率(53.4%)偏低等問題，通過構(gòu)建合適的生物催化反應(yīng)體系，以實現(xiàn)底物增溶，提高反應(yīng)效率。
[0003]離子液體作為綠色溶劑常用于生物催化、有機(jī)合成、化學(xué)分離等反應(yīng)過程中。與有機(jī)溶劑相比，離子液體具有不易揮發(fā)，物理化學(xué)穩(wěn)定性好和結(jié)構(gòu)可設(shè)計性等優(yōu)點。然而，傳統(tǒng)的咪唑類和嘧啶類離子液體存在諸如環(huán)境不友好、生物可降解性差且不可再生等缺點(Chem Soc Rev，2011，40:1383)。氨基酸類離子液體作為一種新型綠色溶劑引起了人們的廣泛關(guān)注。氨基酸是一種可再生資源，具有低毒、可再生、綠色環(huán)保等優(yōu)點，季銨鹽化學(xué)結(jié)構(gòu)與表面活性劑結(jié) 構(gòu)類似，不僅可改善細(xì)胞膜的通透性，而且還能降低底物對細(xì)胞的毒害作用。采用本發(fā)明提出的氨基酸類離子液體用于生物催化反應(yīng)，有利于底物增溶，可使生物還原反應(yīng)在保持較高產(chǎn)率和較短反應(yīng)時間的前提下進(jìn)一步提高反應(yīng)的底物濃度。同時，采用的新型離子液體更符合綠色化學(xué)發(fā)展方向。
[0004]生物催化3，5-雙三氟甲基苯乙酮制備(R)_3，5-雙三氟甲基苯乙醇的反應(yīng)式如下
所示:
[0005]
OH


Trichoderma asperellum
-z

離子液體體系
Cl.、(1-1
3, 5-雙三氣甲基苯乙Hd3’ ?=.?甲基苯乙S1。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于構(gòu)建一種含新型離子液體反應(yīng)體系，并將其應(yīng)用于生物不對稱還原3，5-雙三氟甲基苯乙酮制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的反應(yīng)過程，以解決現(xiàn)行方法中存在的底物難溶性和產(chǎn)率偏低等問題。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]本發(fā)明提供一種利用含離子液體的反應(yīng)體系進(jìn)行生物催化制備(R)_[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，所述方法為:以棘孢木霉ZJPH0810發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌絲體(制備方法參見CN101724568A，具體參見實施例1)作為催化劑，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮作為底物，在式(I )所示氨基酸類離子液體與PH值為5.5~8.0的緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中，于25~45°C、100~300r/min條件下反應(yīng)6~50小時，反應(yīng)液用等體積的正己烷萃取，取萃取液分離純化得到(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇產(chǎn)物；所述反應(yīng)體系中濕菌絲體的加入量以菌絲體干重計為10~50g/L,優(yōu)選為20~40g/L,更優(yōu)選30g/L,所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為20~200mM，優(yōu)選為50~150mM，更優(yōu)選70~IOOmM,所述反應(yīng)體系中氨基酸類離子液體的質(zhì)量濃度為0.1~30%，優(yōu)選為I~20%，更優(yōu)選I~5% ；
[0009][NR1，R2，R3，R4] L
[0010](I )
[0011]式(I)中陽離子為取代季銨鹽，陰離子為天然氨基酸，其中取代季銨鹽的取代基Rl、R2、R3和R4各自獨立為Cl~C4的烷基，優(yōu)選直鏈烷基。
[0012]進(jìn)一步，優(yōu)選所述天然氨基酸為下列之一:丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、賴氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸( Glu)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)或甘氨酸(Gly)，更優(yōu)選所述天然氨基酸為下列之一:Met、Glu、Cys> Gly、Tyr或Arg。
[0013]進(jìn)一步，優(yōu)選所述氨基酸類離子液體為下列之一 jNmJ + tGlur (四甲基銨谷氨酸)、[N3j3j3j3] +[Glu] ^ (四丙基銨谷氨酸)、[N1j1j2j2] +[Tyr] ^ (二甲基二乙基銨酪氨酸)、[NmJ+ [Met]-(四甲基銨甲硫氨酸)、[\2；1；1] +[Arg]-(三甲基乙基銨精氨酸)或[N4，4，4，4] + [G1u]_ (四丁基銨谷氨酸)，其中取代季銨鹽中I為甲基，2為乙基，3為丙基，4為丁基，更優(yōu)選具有輔酶再生能力的[Nu^rtArgr或[N4,4,4,4] + [G1u]_。
[0014]進(jìn)一步,優(yōu)選所述反應(yīng)是在30 V、200r/min條件下反應(yīng)24小時。
[0015]進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中還添加有輔助底物，以促進(jìn)輔酶再生，所述輔助底物可為下列一種或兩種及以上任意比例的混合:①甲醇、②乙醇、③異丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麥芽糖，所述含氨基酸類離子液體的反應(yīng)體系中輔助底物的質(zhì)量濃度為0.1~20%，更優(yōu)選下列之一:①反應(yīng)體系中終濃度3~10%(v/v)無水乙醇；②反應(yīng)體系中終濃度3~10%(v/v)無水乙醇和反應(yīng)體系中終濃度3~10%(w/w)葡萄糖兩者的混合；③反應(yīng)體系中終濃度3~10%(v/v)無水乙醇、反應(yīng)體系中終濃度3~10%(v/v)異丙醇和反應(yīng)體系中終濃度3~10%(w/w)葡萄糖三者的混合，最優(yōu)選下列之一:①反應(yīng)體系中終濃度6%(v/v)無水乙醇；②反應(yīng)體系中終濃度6%(v/v)無水乙醇和反應(yīng)體系中終濃度6%(w/w)葡萄糖兩者的混合；③反應(yīng)體系中終濃度6%(v/v)無水乙醇、反應(yīng)體系中終濃度6%(v/v)異丙醇和反應(yīng)體系中終濃度6%(w/w)葡萄糖三者的混合。
[0016]更進(jìn)一步，優(yōu)選所述反應(yīng)體系中濕菌絲體的加入量以菌絲體干重計為20~40g/L，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為70~lOOmM，所述反應(yīng)體系中氨基酸類離子液體質(zhì)量濃度為I~5%，所述反應(yīng)體系中輔助底物為體積終濃度6%無水乙醇、體積終濃度6%無水乙醇和質(zhì)量終濃度6%葡萄糖兩者的混合或是體積終濃度6%無水乙醇、體積終濃度6%異丙醇和質(zhì)量終濃度6%葡萄糖三者的混合。
[0017]進(jìn)一步，所述緩沖液為pH值為7.0的磷酸緩沖液(優(yōu)選磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液)。
[0018]更進(jìn)一步，本發(fā)明所述的利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-3，5_雙三氟甲基苯乙醇的方法推薦按如下步驟進(jìn)行:以棘孢木霉ZJPH0810發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌絲體(制備參見CN101724568A，具體參見實施例1)作為催化劑，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮作為底物，添加輔助底物，在式(I )所示氨基酸類離子液體與pH值7.0的磷酸緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中，于30°C、150~200r/min條件下反應(yīng)24~48小時，獲得含有目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)液，將反應(yīng)液用等體積的正己烷萃取，取萃取液經(jīng)分離純化得到(R)_[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇產(chǎn)物；所述輔助底物為下列之一:①反應(yīng)體系中終濃度6%(v/v)無水乙醇；②反應(yīng)體系中，終濃度6%(v/v)無水乙醇和終濃度6%(w/w)葡萄糖兩者的混合；③反應(yīng)體系中，終濃度6%(v/v)無水乙醇、終濃度6%(v/v)異丙醇和終濃度6%(w/w)葡萄糖三者的混合；所述反應(yīng)體系中濕菌絲體的加入量以菌絲體干重計為30g/L，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為70~lOOmM，所述反應(yīng)體系中氨基酸離子液體質(zhì)量濃度為I~5%。[0019]生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積的正己烷萃取，取正己烷萃取相，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾濃縮5倍體積，然后加入柱體積I~5%的硅膠混勻后，轉(zhuǎn)移至含有硅膠的層析柱中，再添加柱體積I~5%的硅膠，然后以石油醚:乙酸乙酯=8: I (v/v)為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析分離，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，將含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，即得(R) _[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇純品。(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇1HNMR (600MHz, CDCl3): 7.85 (s, 2H)，7.79 (s, 1H)，5.06-5.03 (q, 1H, J=6.48Hz) ,1.55 (d, 3H, J=6.48Hz)。
[0020]萃取液中產(chǎn)物和未反應(yīng)底物的濃度采用氣相色譜法分析，用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為十二烷。取Iml萃取液加入2μ I十二烷進(jìn)行分析。氣相色譜操作條件為:進(jìn)樣器溫度2500C，檢測器溫度250°C，柱溫80°C保留2min，以4°C /min升溫至180°C，維持lOmin，載氣為氮氣，流量為1.51111/1^11，分流比為1:20，進(jìn)樣量為1111。根據(jù)氣相色譜檢測譜圖，用相對校正因子法計算出反應(yīng)液中產(chǎn)物的濃度和ee值。
[0021]產(chǎn)率計算方法為:
[0022]內(nèi)標(biāo)法:以十二烷為內(nèi)標(biāo)物，測得產(chǎn)物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定時在樣品中加入一定量的十二烷為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物濃度計算得出產(chǎn)物濃度。
[0023]標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法:準(zhǔn)確稱取一系列不同濃度的底物或產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，溶于正己烷，配制成一系列混合溶液，分別用氣相色譜檢測。將所得色譜圖積分得到峰面積，以底物或產(chǎn)物與正十二烷的峰面積比(S 底物/S十二燒或Si*=物/S十二燒)為橫坐標(biāo)，濃度比(C底物/C十二燒或C
二為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到3，5_雙三氟甲基苯乙酮與內(nèi)標(biāo)物的相對校正因子為1.31，3，5-雙三氟甲基苯乙醇與內(nèi)標(biāo)物的相對校正因子為1.69。
[0024]產(chǎn)率計算公式如下:
[0025]Y(%) Xl 00% 公式(I)
Co[0026]公式(I)中Cp為(R)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇濃度，C。為3，5-雙三氟甲基苯乙酮初始濃度。
[0027]產(chǎn)物的光學(xué)純度由對映體過量值(enantiomeric excess, ee)來表征。計算公式為:
【權(quán)利要求】
1.一種利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述方法為:以棘孢木霉ZJPH0810發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌絲體作為催化劑，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮作為底物，在式(I )所示氨基酸類離子液體與pH值為5.5~8.0的緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中，于25~45°C、100~300r/min條件下反應(yīng)6~50小時，反應(yīng)液用等體積的正己烷萃取，取萃取液分離純化得到(R)_[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇；所述反應(yīng)體系中濕菌絲體的加入量以菌絲體干重計為10~50g/L，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為20~200mM，所述反應(yīng)體系中氨基酸類離子液體質(zhì)量濃度為0.1~30% ； 式(I )中陽離子為取代季銨鹽，陰離子為天然氨基酸，其中取代季銨鹽的取代基R1、R2、R3和R4各自獨立為Cl~C4的烷基。
2.如權(quán)利要求1所述利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述天然氨基酸為下列之一:丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、組氨酸或甘氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述利用含離子液體的反應(yīng)體系中制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述氨基酸類離子液體為下列之一 jNmJ + tGlur、[N3,3，3，3]+ [Glu]' [UlTyr]' [N1；1；1；1] + [Met] [N1；2；1；1] + [Arg] ^ 或[N4；4；4；4] + [Glu] ^,其中取代季銨鹽中I為甲基，2為乙基，3為丙基，4為丁基。
4.如權(quán)利要求1所述利用含離子液體的反應(yīng)體系中制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反應(yīng)是在30°C、200r/min條件下反應(yīng)24小時。
5.如權(quán)利要求1所述利用含離子液`體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中濕菌絲體的加入量以菌絲體干重計為20~40g/L，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為50~150mM，所述反應(yīng)體系中氨基酸類離子液體質(zhì)量濃度為I~20%。
6.如權(quán)利要求1所述利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中還添加有輔助底物，所述輔助底物為下列一種或兩種及以上任意比例的混合:①甲醇、②乙醇、③異丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麥芽糖，所述反應(yīng)體系中輔助底物質(zhì)量濃度為0.1~20%。
7.如權(quán)利要求6所述利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述輔助底物為下列之一:①反應(yīng)體系中體積終濃度3~10%無水乙醇；②反應(yīng)體系中體積終濃度3~10%無水乙醇和反應(yīng)體系中質(zhì)量終濃度3~10%葡萄糖兩者的混合；③反應(yīng)體系中體積終濃度3~10%無水乙醇、反應(yīng)體系中體積終濃度3~10%異丙醇和反應(yīng)體系中質(zhì)量終濃度3~10%葡萄糖三者的混合。
8.如權(quán)利要求6所述利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中濕菌絲體的加入量以菌絲體干重計為20~40g/L，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為70~lOOmM，所述反應(yīng)體系中氨基酸類離子液體質(zhì)量濃度為I~5%，所述反應(yīng)體系中輔助底物為體積終濃度6%無水乙醇、體積終濃度6%無水乙醇和質(zhì)量終濃度6%葡萄糖兩者的混合或是體積終濃度6%無水乙醇、體積終濃度6%異丙醇和質(zhì)量終濃度6%葡萄糖三者的混合。
9.如權(quán)利要求1所述利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述緩沖液為PH值為7.0的磷酸緩沖液。
10.如權(quán)利要求1所述利用含離子液體的反應(yīng)體系制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于萃取液分離純化的方法為:取萃取液減壓濃縮5倍體積，然后以體積比8:1的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑進(jìn)行硅膠 柱層析，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，將洗脫液干燥，即得(R) _3，5-雙三氟甲基苯乙醇。
【文檔編號】C12R1/885GK103695480SQ201310754767
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】王普, 李軍, 黃金, 孫佳, 孫婧 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)