植物活體基因?qū)胙b置制造方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了植物活體基因?qū)胙b置，適用性廣、操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高。其技術(shù)方案為：本實(shí)用新型依據(jù)植物細(xì)胞生物物理學(xué)及植物形態(tài)學(xué)理論，采用微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物工程技術(shù)結(jié)合設(shè)計(jì)的電脈沖導(dǎo)入裝置，該裝置包括電脈沖發(fā)生器和電脈沖導(dǎo)入組件組成。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本實(shí)用新型的應(yīng)用電脈沖技術(shù)將基因直接導(dǎo)入到植物活體中，操作簡單快速，同時本實(shí)用新型是一種物理方式導(dǎo)入，所以對植物的種類沒有限制，適用性廣。
【專利說明】植物活體基因?qū)胙b置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種基于電脈沖技術(shù)的植物活體基因?qū)胙b置，尤其涉及將DNA、RNA、siRNA和其他各種核酸物質(zhì)直接導(dǎo)入植物活體中的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]目前植物轉(zhuǎn)基因的方法主要分為三類，一、載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法及病毒介導(dǎo)法；二、直接導(dǎo)入法，包括基因槍、脂質(zhì)體法、電擊法、顯微注射法等；三、種質(zhì)系統(tǒng)法，包括花粉管通道法、浸泡轉(zhuǎn)染法、胚囊子房注射法等。
[0003]其中應(yīng)用最廣泛的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，該方法首先將外源基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，然后再通過農(nóng)桿菌侵染靶組織，從而將外源基因攜帶入植物細(xì)胞中。該方法的缺點(diǎn)是操作步驟繁瑣，轉(zhuǎn)染效率低，而且主要對雙子葉植物有效，對大多數(shù)單子葉植物無效。
[0004]病毒介導(dǎo)法因?yàn)椴捎貌《咀鳛檩d體，其安全性目前仍存在很大的爭議。
[0005]基因槍法能夠直接將基因?qū)胫参锛?xì)胞中，但其只能導(dǎo)入表層細(xì)胞，而且操作過程繁瑣，因此很難獲得轉(zhuǎn)基因植物，更多的用于瞬時表達(dá)的檢測；顯微注射法需要昂貴的設(shè)備，對操作人員的技術(shù)要求很高；而且以上方法基本都是對離體植物組織進(jìn)行操作。
[0006]種質(zhì)系統(tǒng)法是對活體植物進(jìn)行操作，但其受植物花期的限制，操作時間非常受限，而且需要在外界環(huán)境下進(jìn)行，工作量非常大，獲得轉(zhuǎn)基因的效率卻很低。
[0007]以上幾種植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)適用面窄、操作繁瑣。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0008]本實(shí)用新型的目的在于提供了一種植物活體基因?qū)胙b置，適用性廣、操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高。
[0009]本實(shí)用新型的技術(shù)方案為:本實(shí)用新型揭示了一種植物活體基因?qū)胙b置，包括電脈沖發(fā)生器和電脈沖導(dǎo)入組件，其中電脈沖發(fā)生器進(jìn)一步包括電源模塊、脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊、脈沖發(fā)生模塊、信息反饋模塊、存儲模塊、信息傳輸模塊以及微控制器，其中:
[0010]電源模塊用于提供電脈沖發(fā)生的能量；
[0011]脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊根據(jù)脈沖波的反饋信息調(diào)整下一個電脈沖的參數(shù)，以保持靶部位每次收到的脈沖能量恒定；
[0012]脈沖發(fā)生模塊發(fā)出兩組電脈沖，第一組電脈沖將植物細(xì)胞壁擊穿，第二組電脈沖改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆的孔道；
[0013]信息反饋模塊檢測電脈沖導(dǎo)入部位的阻抗并反饋至脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊；
[0014]存儲模塊用于存儲基因?qū)胗涗洠?br> [0015]信息傳輸模塊用于本機(jī)與上位機(jī)的信息交互，實(shí)現(xiàn)上位機(jī)對本機(jī)的指導(dǎo)；
[0016]微控制器用于控制各個模塊的運(yùn)作；
[0017]電脈沖導(dǎo)入組件連接電脈沖發(fā)生器，用于將電脈沖發(fā)生器發(fā)出的電脈沖傳輸?shù)街参锏拇龑?dǎo)入部位中。[0018]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，脈沖發(fā)生模塊發(fā)出的第一組電脈沖是指數(shù)波或方波，第二組電脈沖是方波，每組內(nèi)的若干個脈沖波是恒能量電脈沖，每個脈沖能量為0.005J - 130J,電壓為5 - 500V,每組脈沖個數(shù)為I 一 20個，頻率為I 一60Hz。
[0019]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，電脈沖導(dǎo)入組件是針式電極、片狀電極、或片針結(jié)合電極。
[0020]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，針式電極由基座、連接器和電極組成，電極為數(shù)根導(dǎo)電電針，電針以平行排列等距的方式安裝在基座中，電針的數(shù)目為2 — 8根，直徑為0.1mm 一 0.45mm,電針的尾端通過導(dǎo)線與連接器連接，連接器通過導(dǎo)線或者直接與電脈沖發(fā)生器的輸出端連接。
[0021]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，片狀電極由基座、連接器和電極組成，電極為兩片導(dǎo)電片，該導(dǎo)電片的形狀包括平面、凸面、或凹面，該兩片導(dǎo)電片分別固定在鑷型基座的兩個夾子上，電極通過導(dǎo)線與連接器連接，連接器通過導(dǎo)線或直接與電脈沖發(fā)生器的輸出端相連。
[0022]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，片針結(jié)合電極由基座、連接器和電極組成，電極為數(shù)個電針和一塊導(dǎo)電片，電針的直徑為0.lmm-0.45mm，數(shù)量為1_8個；導(dǎo)電片的形狀包括平面、凸面、或凹面，電針和導(dǎo)電片分別固定在鑷型基座的兩個夾子上，電極通過導(dǎo)線與連接器連接，連接器通過導(dǎo)線或直接與電脈沖發(fā)生器輸出端相連。
[0023]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，電脈沖導(dǎo)入組件的電極由導(dǎo)電材料制成。
[0024]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，欲導(dǎo)入基因或其它預(yù)處理物質(zhì)涂抹在電極上。
[0025]根據(jù)本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的一實(shí)施例，裝置先將基因注射到植物的待導(dǎo)入部位再施加電脈沖，或者先進(jìn)行電脈沖再將基因注射到待導(dǎo)入部位，或者基因注射和電脈沖導(dǎo)入同時進(jìn)行。
[0026]本實(shí)用新型對比現(xiàn)有技術(shù)有如下的有益效果:本實(shí)用新型的方案是依據(jù)植物細(xì)胞生物物理學(xué)及植物形態(tài)學(xué)理論，采用微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物工程技術(shù)結(jié)合設(shè)計(jì)的電脈沖導(dǎo)入裝置。該裝置包括電脈沖發(fā)生器和電脈沖導(dǎo)入組件組成。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本實(shí)用新型的應(yīng)用電脈沖技術(shù)將基因直接導(dǎo)入到植物活體中，操作簡單快速，同時本實(shí)用新型是一種物理方式導(dǎo)入，所以對植物的種類沒有限制，適用性廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1示出了本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的實(shí)施例的原理圖。
[0028]圖2A、2B示出了本實(shí)用新型的電源模塊的原理圖。
[0029]圖3A、3B示出了本實(shí)用新型的裝置的電氣原理圖。
[0030]圖4示出了本實(shí)用新型的裝置的控制原理圖。
[0031]圖5A — 5C示出了本實(shí)用新型的裝置的使用流程圖。
[0032]圖6A — 6F示出了本實(shí)用新型的裝置的電脈沖導(dǎo)入組件結(jié)構(gòu)的圖。
[0033]圖7示出了本實(shí)用新型明的電脈沖發(fā)生器和電脈沖導(dǎo)入組件的連接圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本實(shí)用新型作進(jìn)一步的描述。
[0035]圖1示出了本實(shí)用新型的植物活體基因?qū)胙b置的實(shí)施例的原理。請參見圖1，本實(shí)施例的裝置包括電脈沖發(fā)生器10和電脈沖導(dǎo)入組件12。其中電脈沖發(fā)生器10進(jìn)一步包括電源模塊100、脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊101、脈沖發(fā)生模塊102、信息反饋模塊103、存儲模塊104、信息傳輸模塊105以及微控制器106。
[0036]這些模塊之間的連接關(guān)系如圖1所示，電源模塊100的輸出端連接微控制器106，脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊101的輸入端連接微控制器106，其輸出端連接脈沖發(fā)生模塊102。信息傳輸模塊105、存儲模塊104和信息反饋模塊103分別和微控制器106建立雙向的數(shù)據(jù)連接。脈沖發(fā)生模塊102的輸出端連接電脈沖導(dǎo)入組件12，電脈沖導(dǎo)入組件12的輸出端連接信息反饋模塊103。
[0037]脈沖發(fā)生模塊102發(fā)出兩組電脈沖，第一組電脈沖將植物細(xì)胞壁擊穿，第二組電脈沖改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁產(chǎn)生可逆的孔道。第一組電脈沖是指數(shù)波或方波，第二組電脈沖是方波，每組內(nèi)的若干個脈沖波是恒能量電脈沖，每個脈沖能量為0.005J - 130J,電壓為5 - 500V，每組脈沖個數(shù)為I 一 20個，頻率為I 一 60Hz。較佳的能量是52mJ、156mJ、466mJ,電壓為36V，脈沖個數(shù)為6個，頻率為IHz ;或者較佳的能量是576mJ，電壓為60V，脈沖個數(shù)為6個，頻率為IHz。
[0038]信息反饋模塊103檢測導(dǎo)入部位的電流并經(jīng)由微控制器106反饋至脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊101。脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊101根據(jù)脈沖波的反饋信息調(diào)整下一個電脈沖的參數(shù)，以保持靶部位每次收到的脈沖能量恒定。
[0039]存儲模塊104用于存儲基因?qū)胗涗洝?br> [0040]電源模塊100用于提供電脈沖發(fā)生的能量。電源模塊100提供合適的脈沖電壓和波形等導(dǎo)入?yún)?shù)。圖2A、2B示出了電源模塊的原理，圖2A示出了直流電源的一種實(shí)施方式，電池組經(jīng)由電壓處理模塊分為5 - 500V和(DC5V，DC3.3V)兩路，其中5 — 500V這一路用于驅(qū)動電脈沖信號，而(DC5V，DC3.3V)這一路用于系統(tǒng)控制。圖2B示出了交流電源的一種實(shí)施方式，220V交流電通過電壓隔離、電源濾波之后，第一路經(jīng)過電壓處理之后形成5 —500V的驅(qū)動電壓，第二路經(jīng)過變壓處理和電壓處理之后形成5V和3.3V的系統(tǒng)控制電壓。進(jìn)一步請參見圖3A，對應(yīng)于圖2A，5 - 500V的驅(qū)動電壓作用于負(fù)載，負(fù)載的信息再經(jīng)由反饋檢測反饋至系統(tǒng)控制部分。請參見圖3B，對應(yīng)于圖2B，驅(qū)動電壓作用于負(fù)載，負(fù)載處的信息再經(jīng)由反饋檢測反饋至系統(tǒng)控制部分。
[0041]微控制器106用于控制各個模塊的運(yùn)作。微控制器的對各個模塊的運(yùn)作控制如圖4所示，系統(tǒng)電壓控制模塊(5V，3.3V)提供系統(tǒng)電壓給微控制器。微控制器控制顯示器、鍵盤、時鐘、數(shù)據(jù)存儲管理。微控制器通過電壓控制模塊控制脈沖驅(qū)動的合適電壓(5 -500V),由脈沖驅(qū)動模塊作用于負(fù)載。反饋檢測模塊在負(fù)載上實(shí)施電阻檢測，并將反饋信息回傳至微控制器。
[0042]電脈沖導(dǎo)入組件12連接電脈沖發(fā)生器10，用于將電脈沖發(fā)生器10發(fā)出的電脈沖傳輸?shù)街参锏拇龑?dǎo)入部位中。
[0043]本實(shí)用新型的裝置的工作原理為:通過升壓電路及降壓電路等技術(shù)設(shè)計(jì)產(chǎn)生合適的脈沖電壓、波形等導(dǎo)入?yún)?shù)，通過一定能量的電脈沖沖擊，達(dá)到瞬間打開細(xì)胞壁及細(xì)胞膜通道的作用，使基因等物質(zhì)快速進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，并進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，增加外源基因與細(xì)胞核內(nèi)染色體的同源重組，從而提高基因轉(zhuǎn)染的效率。通過設(shè)定的通路完成能量、脈寬、頻率等參數(shù)的選擇。通過反饋電路收集反饋信息，對發(fā)出的脈沖參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。通過記憶功能，實(shí)現(xiàn)基因?qū)胗涗浀谋４?，通過信息傳輸模塊實(shí)現(xiàn)本機(jī)與上位機(jī)的信息交換以及對使用者的在線指導(dǎo)。
[0044]本實(shí)用新型的裝置的作用原理為:本實(shí)用新型特定的參數(shù)可以將外源基因通過電場作用，導(dǎo)入植物活體組織的細(xì)胞中。設(shè)計(jì)施加的能量值對導(dǎo)入產(chǎn)生影響。能量過低或過高都會影響外源基因的導(dǎo)入。能量過低時，無法造成細(xì)胞壁及細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)的改變，因而外源基因不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。能量過高時，局部組織積聚過多熱量，造成細(xì)胞的死亡或組織失去功能。此時，即使外源基因?qū)爰?xì)胞，也無法進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)染。本實(shí)用新型的參數(shù)可以有效提高外源基因進(jìn)入植物活體細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率。
[0045]本實(shí)用新型的裝置的運(yùn)行順序(即基因?qū)敕绞?如圖5A - 5C所示有三種，可以如圖5A所示的先將基因注射到植物的待導(dǎo)入部位再施加電脈沖，或者如圖5B所示的先進(jìn)行電脈沖再將基因注射到植物的待導(dǎo)入部位，或者如圖5C所示的基因注射和電脈沖導(dǎo)入同時進(jìn)行。
[0046]電脈沖導(dǎo)入組件12是各種形狀的電極，根據(jù)待導(dǎo)入植物活體部位的不同選擇不同的形狀的電極，以使電極能與植物組織緊密接觸，同時能夠?qū)㈦娒}沖信號傳輸?shù)胶线m的部位。待導(dǎo)入部位是葉片，可以選擇片狀電極；待導(dǎo)入部位是莖、根，可以選擇針式電極、片狀電極或片針結(jié)合電極；待導(dǎo)入部位是子葉節(jié)，可以選擇一面平、一面凸起的電極；待導(dǎo)入部位是花，可以選擇針式電極、片狀電極或片針結(jié)合電極。
[0047]如圖6A所示，針式電極由基座2a、連接器2b和電極2c組成，電極為數(shù)根導(dǎo)電電針，電針以平行排列等距的方式安裝在基座中，電針的數(shù)目為2 — 8根，直徑為0.1mm-
0.45mm,電針的尾端通過導(dǎo)線與連接器2b連接，連接器2b通過導(dǎo)線或者直接與電脈沖發(fā)生器的輸出端連接。
[0048]如圖6B所示，片狀電極由基座3a、連接器3b和電極3c組成，電極3c為兩片導(dǎo)電片，該導(dǎo)電片為平面、凸面、凹面或其它形狀，分別固定在鑷型基座3a的兩個夾子上，電極3c通過導(dǎo)線與連接器3b連接，連接器3b通過導(dǎo)線或直接與電脈沖發(fā)生器相連。
[0049]如圖6F所示，片針結(jié)合電極由基座4a、連接器4b和電極4c組成，電極4c為數(shù)個電針和一塊導(dǎo)電片，電針的直徑為0.lmm-0.45mm，數(shù)量為1-8個；導(dǎo)電片為平面、凸面、凹面或其它形狀。電針和導(dǎo)電片分別固定在鑷型基座4a的兩個夾子上，電極4c通過導(dǎo)線與連接器4b連接，連接器4b通過導(dǎo)線或直接與電脈沖發(fā)生器相連。
[0050]圖6A示出了針式電極的結(jié)構(gòu)，圖6B、6C、6D、6E和6F分別示出了各種片狀電極及片針結(jié)合電極的結(jié)構(gòu)。圖7示出了電脈沖導(dǎo)入組件和電脈沖發(fā)生器的連接，電脈沖導(dǎo)入組件的連接器72和電脈沖發(fā)生器70的輸出端71相連，可以通過導(dǎo)線連接，也可以直接連接。
[0051]上述實(shí)施例是提供給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來實(shí)現(xiàn)和使用本實(shí)用新型的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在不脫離本實(shí)用新型的發(fā)明思想的情況下，對上述實(shí)施例做出種種修改或變化，因而本實(shí)用新型的保護(hù)范圍并不被上述實(shí)施例所限，而應(yīng)該是符合權(quán)利要求書所提到的創(chuàng)新性特征的最大范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種植物活體基因?qū)胙b置，包括電脈沖發(fā)生器和電脈沖導(dǎo)入組件，其特征在于，電脈沖發(fā)生器進(jìn)一步包括電源模塊、脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊、脈沖發(fā)生模塊、信息反饋模塊、存儲模塊、信息傳輸模塊以及微控制器，其中: 電源模塊用于提供電脈沖發(fā)生的能量； 脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊根據(jù)脈沖波的反饋信息調(diào)整下一個電脈沖的參數(shù)，以保持靶部位每次收到的脈沖能量恒定； 脈沖發(fā)生模塊發(fā)出兩組電脈沖，第一組電脈沖將植物細(xì)胞壁擊穿，第二組電脈沖改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆的孔道； 信息反饋模塊檢測電脈沖導(dǎo)入部位的阻抗并反饋至脈沖參數(shù)選擇和實(shí)施模塊； 存儲模塊用于存儲基因?qū)胗涗洠? 信息傳輸模塊用于本機(jī)與上位機(jī)的信息交互，實(shí)現(xiàn)上位機(jī)對本機(jī)的指導(dǎo)； 微控制器用于控制各個模塊的運(yùn)作； 電脈沖導(dǎo)入組件連接電脈沖發(fā)生器，用于將電脈沖發(fā)生器發(fā)出的電脈沖傳輸?shù)街参锏拇龑?dǎo)入部位中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，脈沖發(fā)生模塊發(fā)出的第一組電脈沖是指數(shù)波或方波，第二組電脈沖是方波，每組內(nèi)的若干個脈沖波是恒能量電脈沖，每個脈沖能量為0.005J - 130J,電壓為5 - 500V,每組脈沖個數(shù)為I 一 20個，頻率為 I — 60Hz。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，電脈沖導(dǎo)入組件是針式電極、片狀電極、或片針結(jié)合電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，針式電極由基座、連接器和電極組成，電極為數(shù)根導(dǎo)電電針，電針以平行排列等距的方式安裝在基座中，電針的數(shù)目為2 — 8根，直徑為0.1mm 一 0.45mm,電針的尾端通過導(dǎo)線與連接器連接，連接器通過導(dǎo)線或者直接與電脈沖發(fā)生器的輸出端連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，片狀電極由基座、連接器和電極組成，電極為兩片導(dǎo)電片，該導(dǎo)電片的形狀包括平面、凸面、或凹面，該兩片導(dǎo)電片分別固定在鑷型基座的兩個夾子上，電極通過導(dǎo)線與連接器連接，連接器通過導(dǎo)線或直接與電脈沖發(fā)生器的輸出端相連。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，片針結(jié)合電極由基座、連接器和電極組成，電極為數(shù)個電針和一塊導(dǎo)電片，電針的直徑為0.lmm-0.45mm，數(shù)量為1-8個；導(dǎo)電片的形狀包括平面、凸面、或凹面，電針和導(dǎo)電片分別固定在鑷型基座的兩個夾子上，電極通過導(dǎo)線與連接器連接，連接器通過導(dǎo)線或直接與電脈沖發(fā)生器輸出端相連。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，電脈沖導(dǎo)入組件的電極由導(dǎo)電材料制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，欲導(dǎo)入基因或其它預(yù)處理物質(zhì)涂抹在電極上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1一 7中任一項(xiàng)所述的植物活體基因?qū)胙b置，其特征在于，裝置先將基因注射到植物的待導(dǎo)入部位再施加電脈沖，或者先進(jìn)行電脈沖再將基因注射到待導(dǎo)入部位，或者基因注射和電脈沖導(dǎo)入同時進(jìn)行。
【文檔編號】C12M1/42GK203498390SQ201320598650
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】陳車生, 陳麗曄 申請人:上海塔瑞莎生物技術(shù)有限公司