包含來自植物包膜病毒的基質蛋白的病毒樣顆粒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含來源于第一植物包膜病毒的基質蛋白和表面多肽的新型病毒樣顆粒(VLP)。所述表面多肽包含(a)來源于靶多肽的暴露于表面的部分、來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白(例如，糖蛋白)的(b)跨膜結構域和(c)胞質尾。所述靶多肽可以是抗原性的或治療性的。所述第一和第二植物包膜病毒可以相同。兩種植物包膜病毒中任一種都可以是植物彈狀病毒。還提供了制備和使用VLP的方法。
【專利說明】包含來自植物包膜病毒的基質蛋白的病毒樣顆粒及其用途
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2012年3月22日提交的美國臨時申請No.61/614, 141的利益，為了 所有目的將所述臨時申請的內容通過引用整體并入本文。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明總地來說涉及優(yōu)選在植物中產(chǎn)生的包膜病毒樣顆粒（virus-1 ike particle，VLP)以及用于產(chǎn)生和使用該VLP的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 病毒樣顆粒（VLP)是通過自組裝病毒蛋白形成的無病毒基因組存在的復合結構。 VLP平臺日益用于增強靶特異性免疫原性?？稍趲讉€表達系統(tǒng)，包括植物中產(chǎn)生VLP。在植 物中產(chǎn)生VLP提供了額外有利方面，包括安全性和時間效率。然而，在植物中形成VLP是 生理過程的部分并且導致不同尺寸和形狀的顆粒形成，這使得商業(yè)生產(chǎn)和平滑調控路徑極 具挑戰(zhàn)性。野生型流感病毒顆粒的尺寸取決于株系，并且在70與270nm之間變化（Nayak 等人，2009, Virus Resl43(2) :147-161)。植物產(chǎn)生的流感病毒顆粒（VLP)具有不同形狀 和寬廣的尺寸范圍。例如，已報導包膜多形性流感VLP尺寸為100至150nm。（Vezina等 人，2011，BioPharm International Supplements 24(5): s27_s30)。因此，仍然存在對適合 疫苗開發(fā)的更均一的VLP的需要。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明的公開的主題涉及具有來源于包膜病毒的基質蛋白和表面多肽的新型病 毒樣顆粒（VLP)及其用途。這些VLP是包膜的，并且尺寸大體均一。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了病毒樣顆粒（VLP)。VLP包含來源于第一植物包膜 病毒的基質蛋白和表面多肽。表面多肽包含來源于靶多肽的暴露于表面的部分、跨膜結構 域和胞質尾。胞質尾來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白（例如糖蛋白）。VLP可在植物 細胞、植物或植物的部分中產(chǎn)生。
[0009] 所述第一和第二植物包膜病毒可相同或不同，優(yōu)選相同。其中任一植物包膜病毒 可以是植物彈狀病毒或非彈狀病毒。優(yōu)選地，第一植物包膜病毒是植物彈狀病毒。植物彈 狀病毒可選自萵苣壞死黃化病毒（Lettuce Necrotic Yellows virus, LNYV)、北方谷物花 葉病毒（Northern Cereal Mosaic virus, NCMV)、苦苣菜病毒（Sonhus Virus, SonV)和花椰 菜壞死性黃化病毒（Broccoli necrotic yellows virus, BNYV)。優(yōu)選植物彈狀病毒是萵苣 壞死黃化病毒（LNYV)。
[0010] 表面多肽的暴露于表達的部分可以是抗原性多肽，例如疫苗組分，或可以是治療 齊IJ。治療劑可以是治療性多肽。
[0011] 靶多肽可來源于病原體。病原體可選自病毒、細菌、寄生蟲和真菌。病毒可以是動 物病毒。動物病毒可選自流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV)、人免疫缺陷病毒（HIV)、乙型肝 炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人乳頭瘤病毒（HPV)、埃博拉病毒、黃熱病毒、輪狀病毒 和水皰性口炎病毒（VSV)。
[0012] 靶多肽可以是天然表面多肽。天然表面多肽可以是流感病毒的血凝素。
[0013] 靶多肽可以是人工表面多肽。人工表面多肽可以是來自炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis)的保護性抗原83 (PA83)、來自惡性瘧原蟲的Pfs25或其它可溶性蛋白或肽。
[0014] 流感病毒可選自甲型流感病毒和乙型流感病毒。流感病毒可選自甲型流感病毒印 度尼西亞05/05株、甲型流感病毒加利福尼亞/04/2009 (H1N1)株、甲型流感病毒/維多利 亞/3/75 (H3N2)株和乙型流感病毒香港/330/2001。
[0015] 靶多肽可以是治療劑。治療劑可以是治療性多肽。
[0016] 跨膜結構域對于所述表面多肽的暴露于表面的部分可以是天然的或外來的?？缒?結構域可來源于細胞或病毒跨膜蛋白。病毒跨膜結構域可來源于胞質尾所源自的跨膜蛋 白。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了在植物細胞、植物或植物的部分中產(chǎn)生病毒樣 顆粒（VLP)的方法。該方法包括將一個或多個核酸分子引入植物細胞、植物或植物的部分。 所述一個或多個核酸分子包含編碼來源于第一植物包膜病毒的基質蛋白的第一核苷酸序 列和編碼表面多肽的第二核苷酸序列。表面多肽包含來源于祀多肽的暴露于表面的部分、 跨膜結構域和胞質尾。胞質尾來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白（例如，糖蛋白）。第一 和第二植物包膜病毒可以相同或不同，優(yōu)選相同。兩種病毒中任一種都可以是植物彈狀病 毒或非彈狀病毒。優(yōu)選，第一植物包膜病毒是植物彈狀病毒。該方法還包括在允許共表達 基質蛋白和表面多肽的條件下維持植物細胞、植物或植物的部分，以便產(chǎn)生VLP。VLP在尺 寸上可以是大體上均一的。該方法還可包括從植物細胞、植物或植物的部分純化VLP。
[0018] 可通過滲入、微粒轟擊或接種將所述一種或多種核酸分子引入植物細胞、植物或 植物的部分?？蓪⒁环N或多種核酸分子瞬時或穩(wěn)定地引入植物或其部分。
[0019] 提供各種免疫原性組合物。在一些實施方案中，免疫原性組合物包含有效量的本 發(fā)明的VLP，所述VLP在尺寸上是大體上均一的。在其它實施方案中，免疫原性組合物包含 有效量的通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的VLP，所述VLP在尺寸上是大體上均一的。免疫原性組合 物還可包含佐劑和/或賦形劑。
[0020] 提供了在受試者中誘發(fā)針對祀多肽的免疫反應的方法。所述方法包括給受試者施 用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物，其中VLP在尺寸上是大體上均一的。
[0021] 還提供了在受試者中誘發(fā)針對病原體的保護性免疫反應的方法。該方法包括給受 試者施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物，其中VLP在尺寸上是大體上均一的。所述靶 多肽來源于病原體。病原體可以是流感病毒。靶多肽可來源于血凝素。
[0022] 還提供了包含一種或多種核酸分子的重組植物細胞。所述一種或多種核酸分子包 含編碼來源于第一植物包膜病毒的基質蛋白的第一核苷酸序列和編碼表面多肽的第二核 苷酸序列。所述表面多肽包含（a)來源于靶多肽的暴露于表面的部分，（b)跨膜結構域，和 (c)來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白（例如糖蛋白）的胞質尾。第一和第二植物包膜 病毒可以相同或不同，優(yōu)選相同。兩種病毒中任一種都可以是植物彈狀病毒或非彈狀病毒。 優(yōu)選，第一植物包膜病毒是植物彈狀病毒。還提供了包含本發(fā)明的植物細胞的植物或其部 分。
[0023] 附圖概述
[0024] 圖1顯示植物彈狀病毒的㈧電子顯微鏡圖像和⑶組織。
[0025] 圖2是舉例說明用于兩種靶蛋白即靶1和靶2 (各自有效地連接于調控區(qū)）的共表 達的miniBYV載體的T-DNA區(qū)域的基因組組織的圖示。L-Pro,木瓜蛋白酶樣前導蛋白酶； Met、Hel和Pol，分別為甲基轉移酶、RNA解旋酶、復制酶的RNA依賴性RNA聚合酶結構域； 2Enx35S，來自花椰菜花葉病毒的具有雙重增強子的35S啟動子；N0S-胭脂堿合酶終止子； LB和RB，分別為T-DNA的左和右邊界。
[0026] 圖3是舉例說明分別用于萵苣壞死黃化病毒（LNYV) (MmYV)或北方谷物花葉 病毒（NCMV) (Mncmv)的HAi-TM蛋白和基質蛋白的共表達的miniBYV-HAi-TM/MOTV或 miniBYV-HAi-TM/MNQ(V載體的T-DNA區(qū)域的基因組組織的圖示。L-Pro,木瓜蛋白酶樣前導 蛋白酶；Met、Hel和Pol，分別為甲基轉移酶、RNA解旋酶、復制酶的RNA依賴性RNA聚合酶 結構域；2Enx35S，來自花椰菜花葉病毒的具有雙重增強子的35S啟動子N0S-胭脂堿合酶終 止子；LB和RB，分別為T-DNA的左和右邊界。
[0027] 圖4是舉例說明用于HAi-TM(G)_蛋白和Mmv蛋白的共表達的 miniBYV-HAi-TM (G) /Mmv載體的T-DNA區(qū)域的基因組組織的圖示。L-Pro，木瓜蛋白酶樣前 導蛋白酶；Met、Hel和Pol，分別為甲基轉移酶、RNA解旋酶、復制酶的RNA依賴性RNA聚合 酶結構域；2Enx35S，來自花椰菜花葉病毒的具有雙重增強子的35S啟動子；N0S-胭脂堿合 酶終止子；LB和RB，分別地T-DNA的左和右邊界。
[0028] 圖5描述了滲入后通過抗-HAi 5G6第一單克隆抗體檢測的HAi-TM表達的時間進 程分析的代表性western印跡。以60、30或15ng的量存在的參照HAi用作定量的標準。泳 道1和2,手工滲入的本薩明那煙草（N. benthamiana) ;3和4,真空滲入的本薩明那煙草。
[0029] 圖6顯示⑷HAi-TM VLP在10% -40%的蔗糖梯度上的分布和⑶通過掃描電子 顯微鏡檢查（TEM)負染色檢測的來自（A)的級分10的HAi-TMVLP的形態(tài)學。
[0030] 圖7顯示（A)HAi-TM/MlVLP在10-40%蔗糖梯度上的分布；和⑶通過TEM負染 色檢測的來自（A)的級分10的HAi-TM/MIVLP的形態(tài)學。
[0031] 圖8顯示（A)甲型流感病毒/印度尼西亞/05/2005基質（Ml)蛋白在葉樣品中 的表達（泳道1-3,來自產(chǎn)生HAi-TM/MIVLP的滲入植物的不同重復）；和⑶來自HAi-TM/ M1VLP的Ml蛋白在如圖7A上顯示的10-40 %的蔗糖梯度級分中不存在。Std，Ml蛋白標準。
[0032] 圖9顯示（A)HAi-TM/MmvVLP在10-40%蔗糖梯度上的分布和⑶利用抗-HAi 5G6小鼠單克隆抗體對HAi-TM/Mmv VLP的免疫金標記。
[0033] 圖10顯示㈧ΗΑ?-ΤΜ(6)/ΜΜγννυ在10% -40%蔗糖梯度上的分布和⑶利用 抗-HAi 5G6小鼠單克隆抗體對來自（Α)的級分7的ΗΑ?-ΤΜ(6)-Μωγννυ的免疫金標記。
[0034] 圖11顯示具有PRla煙草信號肽（加以下劃線的）、HAi胞外結構域、HAi跨膜結構 域（粗體）和HAi胞質尾（斜體字標示的）的H5N1禽流感病毒（A/印度尼西亞/05/2005) 的血凝素（HAi-TM) (SEQ ID NO: 1)，和⑶具有PRla煙草信號肽（加以下劃線的）、HAi胞 外結構域、LNYV糖蛋白的跨膜結構域（粗體）和LNYV糖蛋白的胞質尾（斜體字標示的）的 H5N1禽流感病毒（A/印度尼西亞/05/2005)的血凝素的氨基酸序列。
[0035] 圖12顯示（A)LNYV(Mmyv)的基質蛋白（SEQ ID N0:3)和⑶H5N1禽流感病毒（A/ 印度尼西亞/05/2005)的基質蛋白（Ml蛋白）（SEQ ID N0:4)的氨基酸序列。
[0036] 發(fā)明詳述
[0037] 本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：可在植物中產(chǎn)生包含來源于植物包膜病毒的基質蛋白和表 面多肽的新型病毒樣顆粒（VLP)。這些VLP是被包膜的，并且在尺寸上是大體上一致的，可 用于設計和產(chǎn)生有效的人疫苗。
[0038] 本文中使用的術語"蛋白質"是指包含氨基酸殘基的生物分子。蛋白質可包含一 個或多個多肽。每一個多肽可以是蛋白質的亞單位。蛋白質可以以天然或修飾形式存在， 并且當其多肽正確折疊或裝配時可顯示生物功能。
[0039] 本文中使用的術語"多肽"是指氨基酸殘基的聚合物，在聚合物的最小長度方面沒 有限制。優(yōu)選地，多肽具有至少4個氨基酸。多肽可以是全長蛋白質或其片段或變體。
[0040] 如本文中所用，術語蛋白質的"片段"是指具有與該蛋白質的氨基酸序列的部分 (但非全部）相同的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，片段是保留與該蛋白質相同的功能的蛋白 質功能性片段。
[0041] 本文中使用的術語蛋白質的"變體"是指除有至少一個被修飾（例如，分別地缺 失、插入或置換）的氨基酸外具有與蛋白質的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。氨基 酸置換可以是保守氨基酸置換（優(yōu)選在蛋白質的非必需氨基酸殘基上）?！ūＪ匕被嶂?換"是其中利用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的氨基酸置換。具有相似側鏈 的氨基酸殘基的家族在本領域是已知的。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸（例如，賴 氨酸、精氨酸、組氨酸）、具有酸性側鏈的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不帶電荷 的極性側鏈的氨基酸（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨 酸）、具有非極性側鏈的氨基酸（例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有分枝側鏈的氨基酸（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和 具有芳香側鏈的氨基酸（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。蛋白質的變 體可具有與該蛋白質的氨基酸序列具有至少約80 %、90 %、95 %或99 %，優(yōu)選至少約90 %， 更優(yōu)選至少約95%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，變體是保持與所述蛋白質相同的功能的 蛋白質功能性變體。
[0042] 本文中使用的術語"來源于"是指起源或來源，可包括天然存在的、重組的、未純化 的或純化的分子。本發(fā)明的分子可來源于病毒或非病毒分子。來源于原始蛋白質或多肽的 蛋白質或多肽可部分或完全地包含原始蛋白質或多肽，并且可以是原始蛋白質或多肽的片 段或變體。
[0043] 本文中使用的術語"天然的"是指天然存在的分子（例如，蛋白質或多肽）。本文中 使用的術語"人工的"是指非天然存在的，但人工地例如重組或化學地合成的分子（例如， 蛋白質或多肽）。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了病毒樣顆粒（VLP)。VLP包含基質蛋白和表面多 肽。基質蛋白來源于第一植物包膜病毒，優(yōu)選植物彈狀病毒，更優(yōu)選萵苣壞死黃化病毒。表 面多肽包含來源于靶多肽的暴露于表面的部分、跨膜結構域和胞質尾。胞質尾來源于第二 植物包膜病毒的跨膜蛋白（例如，糖蛋白）。例如，胞質尾可來源于彈狀病毒糖蛋白?？缒?結構域和胞質尾可來源于相同或不同的植物包膜病毒，優(yōu)選來自相同植物包膜病毒。在一 個實施方案中，跨膜結構域來源于靶蛋白，而胞質尾來源于彈狀病毒糖蛋白。在另一個實施 方案中，跨膜結構域和胞質尾來源于相同植物彈狀病毒糖蛋白?；|蛋白、跨膜結構域和胞 質尾可來源于相同植物包膜病毒。
[0045] 可在植物細胞或其它細胞中產(chǎn)生VLP。植物細胞可以是植物、植物部分（例如， 葉、莖、根、花組織、種子或柄）或細胞培養(yǎng)基中的細胞。植物可以是整個正在生長的植 物。優(yōu)選，植物細胞存在于植物葉中。細胞培養(yǎng)基可以是適合用于生長（優(yōu)選以懸浮方 式）植物細胞的任何培養(yǎng)基。植物細胞優(yōu)選適合用于VLP的表達。例如，植物細胞可存 在于本薩明那煙草葉中。其它適當?shù)闹参锇死蛱m煙（Nicotiana clevelandii)、甜 菜（Beta vulgaris)、菠菜（Spinacia oleracea)、蕓苔屬的某些種（Brassica spp)、萵 苣、豌豆（Pisum sativum)、煙草、長葉車前（Plantago lanceolata)、番杏（Tetragonia tetragonioides)、Montia perfoliata、繁縷(Stellaria media)、漢藜苜猜(Medicago truncatula)和球花藜（Chenopodium foliosum) 〇
[0046] VLP可包含膜。VLP的表面多肽可被整合入膜。膜可來源于其中裝配、制造或產(chǎn)生 VLP的細胞。
[0047] 基質蛋白可來源于任何植物包膜病毒的天然基質蛋白?；|蛋白可具有與對應天 然基質蛋白的氨基酸序列具有至少約80 %、85 %、90 %、95 %或99 %，優(yōu)選至少約90 %，更 優(yōu)選至少約95%，更優(yōu)選至少約99%，最優(yōu)選約100 %的同一'丨生的氨基酸序列。
[0048] 來源于祀多肽的暴露于表面的部分是VLP表面上的表面多肽的部分。表面多肽可 以是抗原性多肽，例如疫苗組分，或可以是治療劑。治療劑可以是治療性多肽。VLP中的或 從VLP純化的表面多肽可用于各種目的。例如，表面多肽可以是抗原性的，并且在被引入受 試者時可用于誘導受試者的免疫反應。當給受試者施用時，其還可用作治療受試者的疾病 或障礙的治療劑。當用于測試來自懷疑具有疾病或障礙的受試者的樣品時，其還可用作受 試者的疾病或障礙的診斷的診斷劑。
[0049] 表面多肽可來源于抗原性靶多肽，當被引入受試者時能夠誘導受試者的免疫反 應，并且可用于形成或成為疫苗候選者。其可包含一個或多個能夠刺激受試者的免疫系統(tǒng) 產(chǎn)生體液和/或細胞抗原特異性免疫反應的表位（線性的和/或構象的）。體液免疫反應 是指通過由B淋巴細胞或B細胞產(chǎn)生的抗體介導的免疫反應，而細胞免疫反應是指通過T 淋巴細胞或T細胞和/或其它白細胞介導的免疫反應。一般而言，B細胞表位包含至少約 5個氨基酸，但可以為3-4個氨基酸，而T細胞表位包括至少約7-9個氨基酸，輔助T細胞 表位包括至少12-20個氨基酸。靶多肽可部分或整個地來源于病原性生物或病原體的天然 蛋白（例如，表面蛋白或毒素亞單位）。靶多肽可包含與對應天然致病蛋白的氨基酸序列 具有至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，80%、85%、90%、95%或99%，優(yōu)選 至少約90 %，更優(yōu)選至少約95 %，進一步優(yōu)選至少約99 %，最優(yōu)選約100 %的同一'丨生的氨基 酸序列。病原體可以是細胞內或細胞外病原體。示例性病原體包括病毒、細菌、寄生蟲和真 菌。病毒可以是動物或植物病毒，優(yōu)選動物病毒。動物病毒可選自流感病毒、呼吸道合胞病 毒（RSV)、人免疫缺陷病毒（HIV)、乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人乳頭瘤病毒 (HPV)、埃博拉病毒、黃熱病毒、輪狀病毒和水皰性口炎病毒（VSV)。優(yōu)選地，靶多肽來源于流 感病毒。
[0050] 靶多肽可以是天然表面多肽或人工表面多肽。天然表面多肽可以是流感病毒的血 凝素。人工表面多肽可以是保護性抗原83(PA83)、Pfs25或其它可溶性蛋白或肽。PA83來 自炭疽菌（Bacilus anthracis)。Pfs25來自惡性痕原蟲。
[0051] 流感病毒可選自甲型流感病毒和乙型流感病毒。流感病毒可選自甲型流感病毒印 度尼西亞05/05株、甲型流感病毒加利福尼亞/04/2009 (H1N1)株、甲型流感病毒/維多利 亞/3/75 (H3N2)株和乙型流感病毒香港/330/2001。
[0052] 表面多肽的跨膜結構域可以是天然蛋白或人工蛋白?？缒そY構域對于表面多肽或 靶多肽的暴露于表面的部分可以是天然的或外來的。跨膜結構域可來源于跨膜蛋白，優(yōu)選 與基質蛋白和胞質尾所源自的跨膜蛋白相同的跨膜蛋白?？缒そY構域可來源于細胞或病毒 跨膜蛋白，或表面蛋白?？缒そY構域可來源于或可以不來源于靶多肽。病毒跨膜蛋白可以 是來自植物病毒的跨膜蛋白。植物病毒可以是植物包膜病毒，優(yōu)選基質蛋白和胞質尾所源 自的植物包膜病毒。跨膜結構域可來源于病毒的糖蛋白，優(yōu)選植物包膜病毒的糖蛋白，更優(yōu) 選基質蛋白和胞質尾所源自的植物包膜病毒的糖蛋白。
[0053] 植物包膜病毒具有脂質包膜。脂質包膜通常來源于病毒顆粒芽出的宿主細胞的 膜。植物包膜病毒可以是植物彈狀病毒或非彈狀病毒。植物彈狀病毒的實例包括萵苣壞死 黃化病毒（LNYV)、北方谷物花葉病毒（NCMV)、苦苣菜病毒（SonV)、花椰菜壞死性黃化病毒 (BNYV)和被國際病毒分類委員會（ICTV)承認的其它植物彈狀病毒。優(yōu)選地，植物包膜病毒 為萵苣壞死黃化病毒（LNYV)。
[0054] LNYV和NCMV彈狀病毒的特征在于單順反子負義RNA，屬于彈狀病毒科質型彈狀病 毒屬。植物彈狀病毒的特征在于桿菌狀形式結構（圖1A)，在長度上為約130-350,在寬度 上為約 40-100nm (Jackson 等人，2005, Ann. Rev. Phytopathol. 43:623-660)。該病毒對于桿 狀顆粒的裝配至關重要的兩種蛋白是基質蛋白（Μ蛋白）和糖蛋白（G蛋白）。Μ蛋白在病 毒體的包膜內形成層，并且與G蛋白的胞質尾相互作用（圖1Β)。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供用于在植物細胞、植物或植物的部分中產(chǎn)生本發(fā) 明的VLP的方法。該方法包括將一種或多種核酸分子引入植物細胞、植物或植物的部分。所 述一種或多種核酸分子包含編碼基質蛋白的第一核苷酸序列和編碼表面多肽的第二核苷 酸序列。基質蛋白來源于第一植物包膜病毒。表面多肽包含來源于祀多肽的暴露于表面的 部分、跨膜結構域和胞質尾。胞質尾來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白（例如，糖蛋白）。 例如，胞質尾可來源于植物彈狀病毒糖蛋白?？缒そY構域可來源于或可以不來源于靶多肽。 第一和第二植物包膜病毒可以是相同的或不同的，優(yōu)選相同的。兩種病毒中任一種都可以 是植物彈狀病毒或非彈狀病毒。優(yōu)選地，第一包膜植物病毒是植物彈狀病毒。該方法還包 括在允許基質蛋白和表面多肽共表達的條件下維持植物細胞、植物或植物的部分，以便產(chǎn) 生 VLP。
[0056] 通過根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的VLP可具有任何尺寸。例如，VLP可具有在約 5-350nm，包括約40-60nm的范圍內的直徑。優(yōu)選地，VLP在尺寸上大體上均一。本文中使 用的術語"尺寸上大體上均一"意指至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %，優(yōu)選 至少約80 %，更優(yōu)選至少約90 %，最優(yōu)選至少約95 %的VLP的直徑與全部VLP的平均直徑 相差小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%，優(yōu)選小于約30%， 更優(yōu)選小于約20%，最優(yōu)選小于約10%以內。VLP的直徑可以是VLP的直徑的一個或多個 測量的平均值或均值。VLP的直徑可通過本領域已知的常規(guī)技術，例如通過使用電子顯微鏡 的觀察、蔗糖梯度分級分離、尺寸排阻層析和動態(tài)光散射來測定。VLP的直徑值可使用各種 軟件例如ImageJ軟件（NIH，Bethe Sda，MD)和其它商購可得的軟件來分析。
[0057] 所述一種或多種核酸分子還可包含有效地連接于第一或第二核苷酸序列的調控 區(qū)。調控區(qū)可在植物細胞中被激活以表達由第一或第二核苷酸序列編碼的蛋白質。調控區(qū) 可包括啟動子，例如植物病毒啟動子。優(yōu)選地，第一和第二核苷酸序列存在于相同核酸分子 中，但連接于分開的調控區(qū)。所述一種或多種核酸分子還可包含編碼另外的表面多肽的第 三核苷酸序列。
[0058] 對于每一個核酸分子，提供了包含該核酸分子的核苷酸序列的載體。載體可在任 一末端上包含位于細菌轉移DNA中的邊界序列以允許將核酸遞送入植物細胞。具體地，載 體可包含一個或多個來源于二元載體的Ti質粒的核酸序列，還可包含植物病毒序列。這樣 的載體，包括Ti質粒和病毒載體的元件，也稱為投放載體（launch vector)。該載體還可用 于共表達目標蛋白質或多肽（例如，基質蛋白和/或表面多肽）與蛋白質例如沉默抑制蛋 白或翻譯后修飾酶例如PNGaseF，以通過例如促進蛋白質的成熟或積累來修飾，影響目標蛋 白的表達和/或增加其產(chǎn)量。
[0059] 可使用本領域已知的技術將每一個核酸分子引入植物細胞、植物或植物的部分 (例如，葉、莖、根、花組織、種子或柄）。例如，所述核酸分子可通過滲入、微粒轟擊或接種來 進行遞送。核酸分子可用作被例如化學劑、光或熱休克激活的可誘導系統(tǒng)的部分。優(yōu)選地， 通過滲入將核酸分子引入植物細胞。可瞬時地或穩(wěn)定地引入核酸分子。
[0060] 提供了包含一種或多種核酸分子的重組植物細胞。所述一種或多種核酸分子包含 編碼基質蛋白的第一核苷酸序列和編碼表面多肽的第二核苷酸序列。優(yōu)選地，所述第一和 第二核苷酸序列存在于一個核酸分子中?；|蛋白來源于第一植物包膜病毒。表面多肽包 含來源于靶多肽的暴露于表面的部分、跨膜結構域和胞質尾。胞質尾來源于第二植物包膜 病毒的跨膜蛋白（例如，糖蛋白）。第一和第二植物包膜病毒可以相同或不同，優(yōu)選相同。 兩種病毒中任一種都可以是植物彈狀病毒或非彈狀病毒。優(yōu)選地，第一植物包膜病毒是植 物彈狀病毒?？缒そY構域可以來源于或可以不來源于靶多肽。胞質尾可來源于植物包膜病 毒的糖蛋白。例如，胞質尾可來源于彈狀病毒糖蛋白。所述第一或第二核苷酸序列可分別 有效地連接于能夠在植物細胞中被激活的啟動子，以共表達基質蛋白或表面多肽。還提供 了包含本發(fā)明的植物細胞的植物或其部分。
[0061] 為了產(chǎn)生本發(fā)明的VLP，可在允許基質蛋白和表面多肽共表達的條件下維持植物 細胞或植物或其部分，從而導致VLP的產(chǎn)生。這樣的條件包括適當?shù)臏囟?、濕度、壓力、? 暗周期和照明。優(yōu)選地，基質蛋白和表面多肽在相同植物細胞中共表達。
[0062] 生產(chǎn)方法還可包括純化VLP?？墒褂帽绢I域已知的常規(guī)純化技術。例如，使用能夠 結合表面多肽的抗體或受體從植物細胞純化VLP。純化過程可包括使用提取緩沖液從植物 細胞提取VLP。在低速離心后，可通過過濾澄清上清液，將其用于層析。純化的VLP可具有至 少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 99%，優(yōu)選至少約 50%， 更優(yōu)選至少約75 %，最優(yōu)選至少約95 %的純度?？墒褂么种浦参锾崛∥镏械腣LP。
[0063] 提供了免疫原性組合物。組合物包含有效量的本發(fā)明的VLP。優(yōu)選地，VLP在尺寸 上是大體上均一的。有效量的VLP是足以使組合物具有免疫原性（即，當被引入受試者時 能夠誘發(fā)免疫反應）的VLP的量。組合物還可包含佐劑和/或賦形劑。免疫原性組合物可 用于誘導受試者的免疫反應。提供了幾個誘導免疫反應的方法。
[0064] 提供了誘導受試者針對靶多肽的免疫反應的方法。該方法包括給受試者施用有效 量的本發(fā)明的免疫原性組合物。優(yōu)選地，VLP在尺寸上是大體上均一的?？梢砸赃m當數(shù)目 的劑量施用免疫原性組合物。
[0065] 還提供了在受試者中誘導針對病原體的保護性免疫反應的方法。該方法包括給受 試者施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物。優(yōu)選地，VLP在尺寸上是大體上均一的。靶 多肽來源于病原體。例如，靶多肽可以是血凝素，病原體是流感病毒。
[0066] 受試者可以是動物，包括哺乳動物，例如人、小鼠、牛、馬、雞、狗、貓和兔。動物可以 是農(nóng)業(yè)動物（例如，馬、牛和雞）或寵物（例如，狗和貓）。受試者優(yōu)選為人或小鼠，更優(yōu)選 人。受試者可以是男性或女性。受試者還可以是新生兒、兒童或成年人。受試者可以已患 有疾病或醫(yī)學病況或對所述疾病或病況易感，所述疾病或病況由病原體引起或與之相關。 [0067] 可配制免疫原性組合物用于口服、舌下、鼻內、眼內、直腸、經(jīng)皮膚、粘膜、局部或胃 腸外施用。胃腸外施用可包括真皮內、皮下（S. c.、s. q.、sub_Q、Hypo)、鼻內、肌內（i.m.)、 靜脈內（i.v·)、腹膜內（i.P·)、動脈內、脊髓內、心內、關節(jié)內（關節(jié)）、滑膜內（關節(jié)液區(qū) 域）、顱內、脊柱內和鞘內（腦脊髓液）施用。適合用于組合物胃腸外注射或輸注的任何裝 置可用于這樣的施用。
[0068] 術語"有效量"是指足以實現(xiàn)所述目的的量，其可隨所述目的和其它因素變化而變 化。例如，免疫原性組合物中的VLP的有效量或包含VLP的免疫原性組合物的有效量可隨 受試者的體格特征、VLP需求的性質和嚴重度、相關或不相關醫(yī)學病況的存在、VLP的性質 和給受試者施用VLP的裝置和施用途徑的變化而變化。用于給定受試者的具體劑量通?？?通過醫(yī)生的判斷來確定?？梢砸砸粋€或多個劑量給受試者施用免疫原性組合物。
[0069] 提供了包含本發(fā)明的VLP的各種藥物。VLP優(yōu)選在尺寸上是大體上均一的。藥物 可包含適當?shù)淖魟?。在一些實施方案中，藥物可用于在受試者中誘導針對靶多肽的免疫反 應，并且包含有效量的本發(fā)明的VLP。在一些其它實施方案中，藥物可用于在受試者中誘導 針對病原體的保護性免疫反應，并且包含有效量的本發(fā)明的VLP，其中靶多肽來源于所述病 原體。例如，靶多肽可以是血凝素，病原體是流感病毒。
[0070] 對于本發(fā)明的每一種藥物，提供了用于制備藥物的方法。制備方法包括將本發(fā)明 的VLP與藥學上可接受的載體和/或賦形劑混合。VLP優(yōu)選在尺寸上是大體上均一的。
[0071] 如本文中所用，當指可測量的值例如量、百分比等時，術語"約"意指包括與指定值 相比有±20%或±10%，更優(yōu)選±5%，更優(yōu)選±1%，更優(yōu)選±0. 1%的變化，因為這樣的 變化是適當?shù)摹?br> [0072] 實施例1. mini-BYV載體的構建
[0073] 為了證明使用來自不同植物包膜蛋白的基質蛋白（M蛋白）、裝配VLP的可行性，將 彈狀病毒Μ蛋白和包含LNYV糖蛋白（G蛋白）的跨膜結構域和胞質尾的靶抗原工程化以在 植物細胞中進行共表達。為了共表達這些蛋白質，使用miniBYV載體（圖2)。miniBYV載 體包含來源于長線型病毒科病毒（例如，甜菜根黃病毒）的微復制子，其包含僅編碼長線型 病毒科病毒復制所需的蛋白質的核酸序列。具體地，將來自LNYV或NCMV的Μ蛋白與來自 Η5Ν1禽流感病毒（Α/印度尼西亞/05/2005)的血凝素（HAi)共表達。
[0074] 簡而言之，將編碼具有其天然TM結構域的HAi蛋白（HAi-TM)的基因克隆進入 miniBYV 載體以產(chǎn)生 miniBYV-HAi-TM 質粒。HAi-TM 蛋白（SEQ ID N0:1)包括 PRla 煙草信 號肽（加以下劃線的）、HAi胞外結構域、HAi天然跨膜結構域（粗體）和HAi天然胞質尾 (以斜體字標示的）（圖11A)。隨后，將編碼LNYV(M myv蛋白）或NCMV(Mncmv蛋白）的Μ蛋 白的基因在長線形病毒異源衣殼蛋白（CP)啟動子的控制之下引入miniBYV-HAi-TM質粒以 產(chǎn)生 miniBYV-HAi-TM/MOTV 或 miniBYV-HAi-TM/MNQW 質粒（圖 3)。為 了評價 VLP，將陽性克 隆轉化入根癌農(nóng)桿菌株系GV3101，隨后將其引入本氏煙草（Nicotiana benthamiana)植物 以產(chǎn)生VLP。
[0075] 平行地，修飾HAi基因以編碼重組血凝素蛋白（HAi-TM(G))，其中HAi的天然TM 和胞質尾分別被來自LNYV的糖蛋白的跨膜結構域和胞質尾替代。將編碼HAi-TM(G)蛋白 (SEQ ID N0:2)(包括PRla煙草信號肽（加以下劃線的）、HAi胞外結構域、LNYV糖蛋白跨 膜結構域（粗體）和LNYV糖蛋白胞質尾（以斜體字標示的））的核苷酸序列（圖11B)引 入包含編碼LNYV的Μ蛋白（M mv蛋白）的核苷酸序列（SEQ ID N0:3)的miniBYV載體（圖 12A)。對所得的構建體miniBYV-HAi-TM(G)/Mmv(圖4)進行測序，將陽性克隆轉化進入根 癌農(nóng)桿菌，隨后引入本氏煙草植物以產(chǎn)生ΗΑ?-ΤΜ(6)-Μ ωγννυ。
[0076] 作為對照，將編碼Η5Ν1禽流感病毒（Α/印度尼西亞/05/2005)的基質蛋白（Ml 蛋白）的基因 （SEQ ID N0:4)(圖12B)在長線形病毒衣殼蛋白（CP)啟動子的控制下引入 minBYV-HAi-TM質粒以產(chǎn)生質粒miniBYV-HAi-TM/Ml。如上所述，PRla用作信號肽。將陽 性克隆轉化進入根癌農(nóng)桿菌，隨后引入本氏煙草植物以產(chǎn)生HAi-TM/MIVLP。
[0077] 實施例2.優(yōu)化滲入法以表達HAi
[0078] 為了評價HAi的表達水平和發(fā)展真空滲入條件，使用無土栽培生長的本氏煙草植 物。為了分析HAi-TM的表達，使用相同的緩沖液進行miniBYV-HAi-TM的手工滲入和真空 滲入。將在蛤殼中的石棉中生長的5周齡本氏煙草植物用于真空和手工滲入。將農(nóng)桿菌 生長在LB培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補充有50ng/ml卡那霉素和50ng/ml潮霉素。在28°C，在 220rpm搖動的情況下生長1升過夜培養(yǎng)物，進行18-24小時。
[0079] 通過測量每一個培養(yǎng)物的0D6QQ測定過夜?jié)舛?。通過在4°C以4000g旋轉15min 來沉淀農(nóng)桿菌。將細菌沉淀物重懸浮于l〇〇ml新鮮MMA培養(yǎng)基（10mM MgC12 ;10mM MES，pH 5. 85 ;和20 μ M乙酰丁香酮）。在于室溫搖動2小時后，記錄每一個培養(yǎng)物的終濃度。將包 含miniBYV和Pl/HcPro沉默抑制蛋白（miniBYV需要使用沉默抑制蛋白來實現(xiàn)良好的靶表 達水平）的培養(yǎng)物混合至1. 〇:〇. 2的0D6(?比率。為了進行真空滲入，用包含miniBYV:Pl/ HcPro的農(nóng)桿菌浸潤蛤殼。給經(jīng)滲入的植物喂飼50ppm水溶膠，將其在生長室中放置5-8 天。
[0080] 為了進行手工滲入，使用l〇CC無針注射器手工地滲入無土栽培生長的本氏煙草 的3-5片葉子。給植物喂飼50ppm水溶膠，將其保持在滲入后室中進行5-8天。
[0081] HAi-TM的表達水平基于在Western印跡分析中通過抗-HAi 5G6單克隆抗體檢測 的HAi-TM蛋白的量來測定（圖5)。HAi-TM的表達在滲入后（dpi) 6天和7dpi在真空滲入 的葉中相較于手工滲入葉中的水平更高（表1)。例如，在6dpi，HAi-TM蛋白以249mg/kg在 真空滲入的葉中表達，相較于手工滲入的葉有43%的表達增加。
[0082] 表L HAi-TM的表達水平時間進程
[0083]
【權利要求】
1. 一種包含來源于第一植物包膜病毒的基質蛋白和表面多肽的病毒樣顆粒，其中所述 表面多肽包含 (a) 來源于靶多肽的暴露于表面的部分， (b) 跨膜結構域，和 (c) 來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白的胞質尾。
2. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述第一植物包膜病毒和所述第二植物包膜病毒相 同。
3. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中在植物細胞、植物或植物的部分中產(chǎn)生所述病毒樣 顆粒。
4. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述第一植物包膜病毒是植物彈狀病毒。
5. 權利要求4的病毒樣顆粒，其中所述植物彈狀病毒選自萵苣壞死黃化病毒（LNYV)、 北方谷物花葉病毒（NCMV)、苦苣菜病毒（SonV)和花椰菜壞死性黃化病毒（BNYV)。
6. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述表面多肽的暴露于表面的部分具有抗原性。
7. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述靶多肽來源于病原體。
8. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述表面多肽的暴露于表面的部分是治療性的。
9. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中述述靶多肽是天然表面多肽。
10. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述靶多肽是人工表面多肽。
11. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述跨膜結構域對于所述暴露于表面的部分是天 然的或外來的。
12. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述跨膜結構域來源于所述跨膜蛋白。
13. 權利要求1的病毒樣顆粒，其中所述跨膜結構域來源于細胞或病毒跨膜蛋白。
14. 一種用于在植物細胞、植物或植物的部分產(chǎn)生病毒樣顆粒的方法，包括 (a) 將一種或多種核酸分子引入植物細胞、植物或植物的部分，其中所述一個或多個核 酸分子包含編碼來源于第一植物包膜病毒的基質蛋白的第一核苷酸序列和編碼表面多肽 的第二核苷酸序列，其中所述表面多肽包含 (i) 來源于靶多肽的暴露于表面的部分， (ii) 跨膜結構域，和 (iii) 來源于第二植物包膜病毒的跨膜蛋白的胞質尾；和 (b) 在允許所述基質蛋白和表面多肽共表達的條件下維持所述植物細胞、植物或植物 的部分，由此產(chǎn)生病毒樣顆粒。
15. 權利要求14的方法，其中所述第一植物包膜病毒和所述第二植物包膜病毒相同。
16. 權利要求14的方法，其中所述病毒樣顆粒在尺寸上是大體上均一的。
17. 權利要求14的方法，其還包括（c)純化所述病毒樣顆粒。
18. 權利要求14的方法，其中通過滲入、顆粒轟擊或接種將所述一種或多種核酸分子 引入所述植物細胞、植物或植物的部分。
19. 權利要求14的方法，其中將所述一種或多種核酸分子瞬時地或穩(wěn)定地引入植物細 胞、植物或植物的部分。
20. -種包含有效量的權利要求1所述病毒樣顆粒的免疫原性組合物，其中所述病毒 樣顆粒在尺寸上大體上是均一的。
21. -種包含有效量的由權利要求14所述方法產(chǎn)生的病毒樣顆粒的免疫原性組合物， 其中所述病毒樣顆粒在尺寸上是大體上均一的。
22. 權利要求20或21的免疫原性組合物，其還包含佐劑或賦形劑。
23. -種用于在受試者中誘導對病原體的保護性免疫反應的方法，包括給所述受試者 施用有效量的由權利要求14所述方法產(chǎn)生的病毒樣顆粒，其中所述靶多肽來源于所述病 原體，并且其中所述病毒樣顆粒在尺寸上是大體上均一的。
24. -種包含一種或多種核酸分子的重組植物細胞，其中所述一種或多種核酸分子包 含編碼來源于第一包膜病毒的基質蛋白的第一核苷酸序列和編碼表面多肽的第二核苷酸 序列，并且其中所述表面多肽包含 (a) 來源于靶多肽的暴露于表面的部分， (b) 跨膜結構域，和 (c) 來源于第二包膜病毒的糖蛋白的胞質尾。
25. 權利要求24的重組植物細胞，其中所述第一植物包膜病毒和所述第二植物包膜病 毒相同。
26. -種包含權利要求24或25的植物細胞的植物或其部分。
【文檔編號】C12N15/82GK104203273SQ201380014180
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月15日 優(yōu)先權日:2012年3月22日
【發(fā)明者】A·普羅奈夫斯基, V·尤什波夫 申請人:弗勞恩霍費爾美國股份有限公司