一種用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的用于鑒定黃曲霉菌株不產(chǎn)黃曲霉毒素的引物由如下4個引物對組成：序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1、序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2、序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3，以及序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4。實驗證明，本發(fā)明所提供的用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)毒的引物序列特異性高，PCR擴增鑒定具有速度快，可信度度高等特點，為快速、準確、高通量篩選不產(chǎn)毒黃曲霉菌株提供了很好的技術(shù)手段，對控制農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的污染具有十分重要的意義。
【專利說明】一種用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxins)是一類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,在我國,黃曲霉毒素主要由黃曲霉產(chǎn)生。黃曲霉毒素具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致”作用，僅0.294mg/kg劑量就能引起敏感動物的急性中毒死亡，其主要的作用靶標是肝臟，是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)的主要因素之一,最短24周內(nèi)就能夠?qū)е赂闻K壞死癌變等，此外還可以引起腎臟和腎上腺的急性病變。因此，有效防控黃曲霉毒素污染，對于保障我國食品安全和維護國家經(jīng)濟利益具有重要意義。
[0003]不同黃曲霉菌株在產(chǎn)黃曲霉毒素能力上有很大差異，其中不產(chǎn)毒黃曲霉可以占到0%-80%。最近，利用不產(chǎn)毒黃曲霉來抑制產(chǎn)毒黃曲霉的生長從而控制農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的含量在美國、非洲等國家和地區(qū)得到了較好的應(yīng)用?？梢姡绾舞b定黃曲霉是否產(chǎn)毒是非常重要的。目前，對黃曲霉是否產(chǎn)毒主要是先培養(yǎng)黃曲霉菌株，然后再提取毒素，最后對毒素含量進行檢測，非常費時費力。因此，開發(fā)一種快速鑒定黃曲霉是否產(chǎn)毒的方法對于篩選不產(chǎn)毒黃曲霉，從而控制農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的污染具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物及應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物對組，具體由如下4個引物對組成:序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1、序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2、序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3，以及序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4。
[0006]黃曲霉毒素主要是由黃曲霉3號染色體內(nèi)一個70kb左右基因簇上的29個基因參與其合成與調(diào)控的。研究表明不產(chǎn)毒黃曲霉主要是由于其毒素合成基因缺失造成的。其中，所述引物對I特異于af IT基因；所述引物對2特異于nor-Ι基因；所述引物對3特異于aflR基因；所述引物對4特異于hypB基因。
[0007]在所述引物對組中，每個引物對的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用。
[0008]含有所述引物對組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供所述引物對組的制備方法。
[0010]所述引物對組的制備方法，具體可包括將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0011]本發(fā)明的還一個目的是提供所述試劑盒的制備方法。[0012]所述試劑盒的制備方法，具體可包括如下步驟:將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后,與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi):PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0013]所述引物對組，或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素中的應(yīng)用，或在制備用于鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014]本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用所述引物對組，或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的方法。
[0015]該方法具體可包括如下步驟: [0016](I)從待測黃曲霉菌株中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對組中的4個引物對分別進行PCR擴增，得到4份PCR產(chǎn)物；
[0017](2 )根據(jù)步驟(1)所得4份PCR產(chǎn)物，按照如下方法確定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素:若所述4份PCR產(chǎn)物中目的DNA片段的數(shù)目為3個以下，則所述待測黃曲霉菌株不產(chǎn)黃曲霉毒素，或候選不產(chǎn)黃曲霉毒素；若所述4份PCR產(chǎn)物中目的DNA片段的數(shù)目為4個，則所述待測黃曲霉菌株產(chǎn)黃曲霉毒素，或候選產(chǎn)黃曲霉毒素；
[0018]所述目的DNA片段為如下任一:利用所述引物對I擴增得到的大小為1141bp的DNA片段；利用所述引物對2擴增得到的大小為977bp的DNA片段；利用所述引物對3擴增得到的大小為629bp的DNA片段；利用所述引物對4擴增得到的大小為422bp的DNA片段。
[0019]在步驟(1)中，采用所述4個引物對分別進行PCR擴增時采用的退火溫度均為55。。。
[0020]在所述方法的步驟(1)中，進行所述PCR擴增的反應(yīng)條件具體為:95°C預(yù)變性2min ;94°C變性 30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 lmin30s, 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。[0021 ] 在所述方法的步驟(1)中，在進行所述PCR擴增的每個反應(yīng)體系中，所述引物對中每條單鏈DNA分子的終濃度均可為0.2-0.5 μ M，具體如0.5 μ Μ。
[0022]進一步，進行所述PCR擴增的反應(yīng)體系具體為:模板I μ L，10 μ M的上下游引物各I μ L(終濃度均為 0.5 μ Μ), 2 X Colorless GoTaq? Reaction BufferlO μ L,補雙蒸水 7 μ L至 20 μ L 體系。其中，2XColorless GoTaq? Reaction Buffer Gotag 為美國 promega 公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為M7132。
[0023]在所述方法中，所述大小為1141bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列9所示；所述大小為977bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列10所示；所述大小為629bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列11所示；所述大小為422bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列12所示。
[0024]在本發(fā)明中，所述待測黃曲霉菌株具體為如下中的任一種:黃曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-12> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-14> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-1K 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-27、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-33、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-19、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-14、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-1> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) JZ-2、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-17、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-5> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-6> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-15、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-24、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-10> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-12> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-24> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-15、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) FX-1 和黃曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-9。
[0025]在本發(fā)明中，以上所有的所述黃曲霉毒素均可為如下中的至少一種:黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2。
[0026]實驗證明，本發(fā)明提供了用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)毒的引物序列，這些序列特異性高，通過利用該引物序列PCR擴增鑒定產(chǎn)毒黃曲霉和不產(chǎn)毒黃曲霉，具有速度快，可信度度高等特點，為快速、準確、高通量篩選不產(chǎn)毒黃曲霉菌株提供了很好的技術(shù)手段，對控制農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的污染具有十分重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為特異性檢測各菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
[0028]圖2為黃曲霉毒素BpByGpG2混合標準品的HPLC圖譜。其中，I為黃曲霉毒素標準品中AFG2，保留時間為7.861min ；2為黃曲霉毒素標準品中AFG1，保留時間為8.793min ；3為黃曲霉毒素標準品中AFB2,保留時間為10.293min ；4為黃曲霉毒素標準品中AFB1,保留時間為 11.735min。
[0029]圖3為不產(chǎn)毒黃曲霉菌株DW-12發(fā)酵濾液的HPLC圖譜。
[0030]圖4為產(chǎn)毒黃曲霉菌 株DW-5發(fā)酵濾液的HPLC圖譜。
[0031]圖5 為不產(chǎn)毒黃曲霉菌株 DW-12、XinZ-11、XinZ-27 和 QD-1 的 C3，aflT, norA 和hypA四個基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034]黃曲霉菌(Aspergillusflavus)菌株 DW-12、DW-14、XinZ-ll、XinZ-27、XinZ_33、YC-19、HG-14、QD-1、JZ-2、GZ-17，以及 DW-5、DW-6、XinZ-15、XinZ-24、YC-10、HG-12、HG_24、QD-15、FX-1、GZ-9:記載于“張初署.2013.中國四個生態(tài)區(qū)花生土壤中黃曲霉菌分布、產(chǎn)毒特征及遺傳多樣性研究[D]博士學(xué)位論文.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所”一文，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得。
[0035]黃曲霉毒素Bp B2、G2混合標準品(LB96951):購于SUPELC0公司。
[0036]實施例1、用于鑒定黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物的設(shè)計與合成
[0037]根據(jù)毒素合成基因aflT，nor-1，aflR和hypB的序列，設(shè)計4組PCR引物，分別為aflT-F/aflT-R, nor-l-F/nor-l-R, aflR-F/aflR-R 和 hypB-F/hypB-R。具體如表 I 所不。引物由上海生工合成，也可通過常規(guī)的引物合成方法合成。
[0038]表1不同毒素合成基因引物序列
[0039]
【權(quán)利要求】
1.用于鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的引物對組，由如下4個引物對組成:序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1、序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2、序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3，以及序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于:所述引物對組中，每個引物對的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用。
3.含有權(quán)利要求1或2所述引物對組的試劑盒。
4.權(quán)利要求1或2所述引物對組的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括將權(quán)利要求I或2所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
5.權(quán)利要求3所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1或2所述的引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
6.權(quán)利要求1或2所述引物對組，或權(quán)利要求3所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素中的應(yīng)用，或在制備用于鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.利用權(quán)利要求1或2所述引物對組，或權(quán)利要求3所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素的方法，包括如下步驟: (1)從待測黃曲霉菌株中提取基因組DNA作為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的引物對組中的4個引物對分別進行PCR擴增，得到4份PCR產(chǎn)物； (2)根據(jù)步驟(1)所得4份PCR產(chǎn)物，按照如下方法確定待測黃曲霉菌株是否產(chǎn)黃曲霉毒素:若所述4份PCR產(chǎn)物中目的D`N`A片段的數(shù)目為3個以下，則所述待測黃曲霉菌株不產(chǎn)黃曲霉毒素，或候選不產(chǎn)黃曲霉毒素；若所述4份PCR產(chǎn)物中目的DNA片段的數(shù)目為4個，則所述待測黃曲霉菌株產(chǎn)黃曲霉毒素，或候選產(chǎn)黃曲霉毒素； 所述目的DNA片段為如下任一:利用所述引物對I擴增得到的大小為1141bp的DNA片段；利用所述引物對2擴增得到的大小為977bp的DNA片段；利用所述引物對3擴增得到的大小為629bp的DNA片段；利用所述引物對4擴增得到的大小為422bp的DNA片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:在步驟(1)中，采用所述4個引物對分別進行PCR擴增時采用的退火溫度均為55°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述大小為1141bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列9所示；所述大小為977bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列10所示；所述大小為629bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列11所示；所述大小為422bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列12所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的引物對或試劑盒或方法或應(yīng)用，其特征在于:所述待測黃曲霉菌株為如下中的任一種:黃曲霉菌(Aspergillus flavus) DW-12、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-14> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-1K 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-27、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-33、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-19> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-14> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-1> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) JZ-2、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ-17> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus) Dff-5> 黃曲霉菌(Aspergillus flavus)DW_6、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-15、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) XinZ-24、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) YC-10、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-12、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) HG-24、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) QD-15、黃曲霉菌(Aspergillus flavus) FX-1 和黃曲霉菌(Aspergillus flavus) GZ·-9。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710456SQ201410002187
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】劉陽, 周露, 魏丹丹, 張初署, 邢福國, 趙月菊, 王龑 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所