一種熱穩(wěn)定性提高的d-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種熱穩(wěn)定性提高的D-阿洛酮糖?3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用，屬于酶的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開(kāi)了由來(lái)源于梭狀芽孢桿菌（Clostridium?bolteae）ATCC?BAA-613的D-阿洛酮糖?3-差向異構(gòu)酶（簡(jiǎn)稱(chēng)DPE酶）作為親本，利用基因突變技術(shù)，將其109位的甘氨酸Gly替換為脯氨酸Pro，獲得單突變體酶G109P，其熱穩(wěn)定性得到提高，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種熱穩(wěn)定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體
酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)一種熱穩(wěn)定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體酶，屬于酶的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE酶)屬于D-塔格糖3_差向異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱(chēng)DTE)家族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構(gòu)，是生產(chǎn)稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨(dú)或與其他酶偶聯(lián)合成多種碳水化合物，被廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、食品和制藥等領(lǐng)域。DPE酶可分別催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0003]隨著由過(guò)量高能量食物攝入引發(fā)的一系列慢性病在世界范圍內(nèi)的爆發(fā)，膳食結(jié)構(gòu)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。新型的蔗糖替代品的開(kāi)發(fā)和研究仍是功能性甜味劑領(lǐng)域具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)際意義的當(dāng)務(wù)之急。D-阿洛酮糖是一種稀有糖，具有多種營(yíng)養(yǎng)和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低熱量的甜味劑。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認(rèn)定為GRAS食品，允許用于食品和膳食補(bǔ)充劑中。另外D-阿洛酮糖具有保護(hù)胰腺β-胰島細(xì)胞，減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業(yè)中有很大的應(yīng)用前景。
[0004]雖然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但其在自然界中含量極少且極難獲得。生物法制備D-阿洛酮糖是近 年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。良好的生物催化劑的開(kāi)發(fā)對(duì)工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。耐熱酶具有多種優(yōu)點(diǎn)，如轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)速度快，污染少，底物粘度低等。因此，開(kāi)發(fā)具有良好熱穩(wěn)定性的DPE酶對(duì)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。
[0005]由于來(lái)源于野生菌株未經(jīng)改造的DPE酶在熱穩(wěn)定性等方面存在一定的局限性，限制了其應(yīng)用范圍。本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的梭狀芽孢桿菌如7teae)DPE酶可以有效促進(jìn)D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化(Min Jia, et al.2013, Applied Microbiologyand Biotechnology, DOI 10.1007/s00253-013-4924_8)。但為獲得更適合的生物催化劑，通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，對(duì)DPE酶進(jìn)行分子改造，進(jìn)一步提高其熱穩(wěn)定性，以期得到酶學(xué)性質(zhì)更適合工業(yè)應(yīng)用的DPE酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種熱穩(wěn)定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的突變體酶及其應(yīng)用，對(duì)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種熱穩(wěn)定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE的突變體酶G109P，將來(lái)源于梭狀芽孢桿菌bolteae)KTCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，進(jìn)行突變所得的單突變體酶；將原來(lái)DPE酶基因中第109位的甘氨酸Gly替換為脯氨酸Pro,命名為G109P。
[0008]與野生型酶DPE相比，所述DPE的突變體酶G109P的熱穩(wěn)定性獲得提高，以在55°C下的半衰期t5(l來(lái)表示熱穩(wěn)定性，DPE的突變體酶G109P的半衰期為91.5min，是野生型酶DPE 的 2.13 倍。
[0009]一種重組表達(dá)質(zhì)粒，其中含有權(quán)利要求1所述DPE的突變體酶G109P基因。
[0010]一種表達(dá)宿主，其被含有DPE的突變體酶G109P基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
[0011]所述DPE的突變體酶G109P的應(yīng)用，在化學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0012]所述梭狀芽抱桿菌(JJlostridiumbo I teae ) ATCC BAA-613 的 DPE 酶基因在GenBank的編號(hào)為CL0B0L_00069，基因全長(zhǎng)876個(gè)核苷酸(見(jiàn)序列表中SEQ ID No:l)，編碼291個(gè)氨基酸(見(jiàn)序列表中SEQ ID No:2)0
[0013]所述DPE的突變體酶是將其109位氨基酸甘氨酸Gly突變?yōu)楦彼酨ro，命名為G109P (見(jiàn)序列表中SEQ ID No:4)。G109P的核苷酸序列見(jiàn)(SEQ ID No:3)。
[0014]本發(fā)明還提供DPE酶的突變體酶G109P的制備方法，其具體步驟為:
1)在梭狀芽孢桿菌?ο?teae)DPE酶模擬結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上確定突變位點(diǎn)；
2)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶DPE酶基因的載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建突變質(zhì)粒 pet22b(+)-G109P ；
3)將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，挑選驗(yàn)證后的陽(yáng)性單克隆進(jìn)行發(fā)酵培
養(yǎng);
4)離心菌體，重懸后超聲破碎，Ni2+柱純化得到突變體G109P。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種具有較高熱穩(wěn)定性的DPE酶的突變體酶G109P，其半衰期為91.5min,是野生型DPE酶的2.13倍。該突變體酶在化學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1梭狀芽孢桿菌(AoJteae)DPE酶及突變體酶G109P在55°C下的熱穩(wěn)定性，殘余酶活與時(shí)間的曲線圖
:梭狀芽抱桿菌(t/ia?ieae) DPE 酶；.:DPE 的突變體酶 G109P。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1:DPE酶熱穩(wěn)定性定點(diǎn)突變分析及突變體制備方法
通過(guò)對(duì)DPE酶3D空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)G109位于活性位點(diǎn)的β回轉(zhuǎn)區(qū)域，通過(guò)改變109位氨基酸的疏水性，可改變酶分子的穩(wěn)定性。因此將疏水性較弱的甘氨酸Gly替換為疏水性較強(qiáng)的脯氨酸Pro，以增加其熱穩(wěn)定性。
[0018]利用快速PCR定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建pet22b (+) -G109P突變質(zhì)粒；
pet22b (+)-G109P突變質(zhì)粒的構(gòu)建:以pet22b (+)-cb-dpe質(zhì)粒為模板，利用G109P的突變引物通過(guò)一次PCR得到大小為6.4kbp左右的產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。
[0019]測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明除了所需突變位點(diǎn)外，沒(méi)有出現(xiàn)隨機(jī)突變，因此突變質(zhì)粒pet22b (+) -G109P 構(gòu)建成功。
[0020]突變引物如下所示:(下劃線為突變點(diǎn))
G109P 1:5’ -CATATCCTGG GAGGGCCATT ATATTCCTAC-3’G109P 2:5’ -CCCTCCCAGGATATGGATAT CCATTAACTG-3’
所用引物由上海生工生物有限公司合成提供。
[0021]PCR擴(kuò)增體系如下:
組分體積(μυ
5XPrimeSTARTMGC Buffer4
dNTPs (各 2.5 mM)1.6
正向引物(10 μΜ)I
反向引物(10 μΜ)I
模板DNA1.6
PrimeSTARTM HS DNA Ploymerase (2.5U/y L) 0.2 ddH2010.6
上述PCR條件為:
98°C預(yù)變性lOmin，然后進(jìn)行以下循環(huán):98°C變性10s，60°C退火5s，72°C延伸6.5min ；25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保溫。
[0022]實(shí)施例2:梭·狀芽孢桿菌(Clostridium bolteae) DPE的突變體酶的表達(dá)純化方法。
[0023]將測(cè)序驗(yàn)證后的突變質(zhì)粒pet22b (+) -G109P轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中37°C，200rpm搖培過(guò)夜，后接入LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)3_4h至OD值為0.6-0.8，降溫至25°C，加入IPTG終濃度為0.8mM誘導(dǎo)8h。
[0024]發(fā)酵液于4°C、1000Orpm 離心 20min,取菌體。加入 15 mL Binding Buffer(50 mMNa2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl，調(diào)節(jié)pH至7.4)充分重懸浮菌體，然后將離心管置于冰浴中，放入超聲波細(xì)胞破碎儀中，超聲破碎的條件為:工作時(shí)間I S，停止時(shí)間2s，共計(jì)20mirio將獲得的破碎液進(jìn)行低溫高速離心，4°C、10000 r/min離心30 min,所得即粗酶液。用微孔濾膜過(guò)濾，備用。
[0025]準(zhǔn)備N(xiāo)i2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和介質(zhì)填充層析柱,首先,在4°C環(huán)境下利用恒流泵，向柱子里泵入Binding Buffer平衡柱子環(huán)境，然后將得到的過(guò)膜粗酶液加入到柱子中，利用恒流泵向柱子加入Wash Buffer (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500mM NaCl,50 mM咪唑，調(diào)節(jié)pH至7.4)洗滌雜蛋白，待基線平穩(wěn)后，泵入Elution Buffer(50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl，500 mM 咪唑，調(diào)節(jié) pH 至 7.4)洗脫目的蛋白。收集目的蛋白的洗脫液。將洗脫液放入處理后的透析袋中，采用平衡液透析過(guò)夜，得到純化后的DPE的突變體酶。純化后DPE的突變體酶G109P達(dá)到電泳純。
[0026]實(shí)施例3 =DPE酶在55 °C下的熱穩(wěn)定性
1.DPE酶活測(cè)定方法:I mL的反應(yīng)體系中，加入700 yL用100 g/LD_果糖，200 μ L稀釋酶液，100 μ L終濃度為I mM的Co2+離子。55°C保溫5 min，然后煮沸10 min以終止酶反應(yīng)。
[0027]2.將純化后的DPE酶液置于55°C水浴中保溫，定期測(cè)定殘余酶活。繪制殘余酶活與時(shí)間的關(guān)系曲線(如圖1)，根據(jù)曲線得到該溫度下DPE酶的半衰期。
[0028]表1.DPE酶在55°C熱穩(wěn)定性
—|t1/a(55°C ) (min) |t1/a(55°C )提高倍數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種熱穩(wěn)定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPE的突變體酶G109P，其特征在于將來(lái)源于梭狀芽孢桿菌bolteae) ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行突變所得的單突變體酶；將原來(lái)DPE酶基因中第109位的甘氨酸Gly替換為脯氨酸Pro，命名為G109P。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DPE的突變體酶G109P，其特征在于與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶G109P的熱穩(wěn)定性獲得提高，以在55°C下的半衰期t5(l來(lái)表示熱穩(wěn)定性，DPE的突變體酶G109P的半衰期為91.5min,是野生型酶DPE的2.13倍。
3.—種重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于其中含有權(quán)利要求1所述DPE的突變體酶G109P基因。
4.一種表達(dá)宿主，其特征在于其被權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求1所述DPE的突變體酶G109P的應(yīng)用，其特征在于在化學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用?！?br> 【文檔編號(hào)】C12N15/61GK103849613SQ201410002096
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】江波, 沐萬(wàn)孟, 賈敏, 張濤, 黃敏, 周榴明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)