西尼羅病毒的熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑、試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑、試劑盒及其檢測(cè)方法，所述檢測(cè)試劑是針對(duì)以西尼羅病毒E基因的保守片段為靶目標(biāo)的，包括一對(duì)特異性引物、一條特異性探針和一條內(nèi)標(biāo)探針。試劑盒包括PCR混合液、Taq?DNA聚合酶、DEPC-H2O、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、定量用標(biāo)準(zhǔn)品和假病毒內(nèi)標(biāo)溶液；其中PCR混合液中含有一對(duì)特異性引物、一條特異性探針和一條內(nèi)標(biāo)探針。檢測(cè)方法包括：總RNA提取、反應(yīng)組分配制、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增、結(jié)果判定。本發(fā)明的試劑和試劑盒特異性強(qiáng)、靈敏度高、無(wú)污染、高通量、可對(duì)低含量西尼羅病毒感染、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，檢測(cè)方法快速、特異、敏感、可定量、可同時(shí)檢測(cè)大量樣品。
【專利說(shuō)明】西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑、試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種PCR檢測(cè)試劑、試劑盒及其檢測(cè)方法，尤其涉及一種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑、試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]西尼羅病毒病是一種烈性人畜共患傳染病，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。西尼羅河病毒可以通過(guò)蚊或蜱等血媒介傳播，大多缺乏有效的治療和預(yù)防措施，給疾病控制提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。西尼羅病毒血清學(xué)診斷方法較多，但這些方法都有一定得局限性。比如ELISA不是特異診斷方法，只能用于病毒抗體的篩查，不能進(jìn)行確診；特異的蝕斑減少中和試驗(yàn)操作較繁，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以應(yīng)用于大規(guī)模普查。西尼羅病毒核酸檢測(cè)方法主要有普通RT-PCR方法，但是其在檢馬腦組織病料時(shí)，敏感性差。此方法還有一個(gè)很大的缺點(diǎn):就是易污染、易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、無(wú)污染、高通量、可對(duì)低含量西尼羅病毒感染、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑和西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
[0004]本發(fā)明進(jìn)一步要解決的問(wèn)題在于，提供一種快速、特異、敏感、可定量、可同時(shí)檢測(cè)大量樣品的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑是針對(duì)以西尼羅病毒E基因的保守片段為靶目標(biāo)的，包括:
[0007]引物:WNV-PF909:5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
[0008]WNV-PR999:5/ -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3;
[0009]探針:WNV-PB941:5' -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3'
[0010]內(nèi)標(biāo)探針:WNV-PBIC:5' -CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3'，
[0011]所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的5'端有用熒光染料標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的3'端有用淬滅熒光染料標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)。
[0012]所述西尼羅病毒E基因的保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為:
[0013]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0014]所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑，所述探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM,所述探針的3'端標(biāo)記的突光淬滅基團(tuán)為BHQl ;所述內(nèi)標(biāo)探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX，所述內(nèi)標(biāo)探針的3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0015]所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑中，還包括作為內(nèi)標(biāo)的假病毒，用于制作所述假病毒的內(nèi)標(biāo)核苷酸序列為:
[0016]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCC GTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0017]一種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O,陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、定量用標(biāo)準(zhǔn)品和假病毒內(nèi)標(biāo)溶液；
[0018]其中，所述PCR混合液中包含:
[0019]引物:WNV-PF909:5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
[0020]WNV-PR999:5/ -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3;
[0021]探針:WNV-PB941:5' -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3'
[0022]所述假病毒內(nèi)標(biāo)溶液中包含:內(nèi)標(biāo)核苷酸序列制作的假病毒；
[0023]所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的5'端有用熒光染料標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的3'端有用淬滅熒光染料標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)；
[0024]所述引物和探針對(duì)應(yīng)于西尼羅病毒E基因的保守片段，所述西尼羅病毒E基因的保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為: [0025]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0026]所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒中，所述探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM,所述探針的3'端標(biāo)記的突光淬滅基團(tuán)為BHQl ;所述內(nèi)標(biāo)探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX，所述內(nèi)標(biāo)探針的3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0027]所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒中，用于制作假病毒的內(nèi)標(biāo)核苷酸序列為:
[0028]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0029]所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選各種試劑的含量為:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑，其特征在于，所述檢測(cè)試劑是針對(duì)以西尼羅病毒E基因的保守片段為靶目標(biāo)的，包括:
弓丨物:WNV-PF909: 5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
WNV-PR999: 5' -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3'
探針:WNV-PB941:5/ -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3' 內(nèi)標(biāo)探針:WNV-PBIC:5/ -CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3'， 所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的5'端有用熒光染料標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的3'端有用淬滅熒光染料標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)； 所述西尼羅病毒E基因的保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑，其特征在于，所述探針5'端標(biāo)記的突光報(bào)告基團(tuán)是FAM,所述探針的3'端標(biāo)記的突光淬滅基團(tuán)為BHQl ;所述內(nèi)標(biāo)探針的5'端標(biāo)記的突光報(bào)告基團(tuán)是HEX,所述內(nèi)標(biāo)探針的3'端標(biāo)記的突光淬滅基團(tuán)為BHQl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西尼 羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑，其特征在于，所述檢測(cè)試劑還包括作為內(nèi)標(biāo)的假病毒，用于制作所述假病毒的內(nèi)標(biāo)核苷酸序列為:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
4.一種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括PCR混合液、TaqDNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O,陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、定量用標(biāo)準(zhǔn)品和假病毒內(nèi)標(biāo)溶液； 其中，所述PCR混合液中包含:
弓丨物:WNV-PF909: 5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
WNV-PR999: 5' -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3' 探針:.ν-ΡΒ941:5' -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3' 所述假病毒內(nèi)標(biāo)溶液中包含:內(nèi)標(biāo)核苷酸序列制作的假病毒； 所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的5'端有用熒光染料標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針和內(nèi)標(biāo)探針的3'端有用淬滅熒光染料標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)； 所述引物和探針對(duì)應(yīng)于西尼羅病毒E基因的保守片段，所述西尼羅病毒E基因的保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，所述探針的3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl ；所述內(nèi)標(biāo)探針的5'端標(biāo)記的突光報(bào)告基團(tuán)是HEX,所述內(nèi)標(biāo)探針的3'端標(biāo)記的突光淬滅基團(tuán)為BHQl。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于制作假病毒的內(nèi)標(biāo)核苷酸序列為:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒中各種試劑的含量為:
8.—種西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，采用權(quán)利要求4的試劑盒，檢測(cè)方法包括以下步驟: (1)、總RNA提取:在待測(cè)樣品中加入假病毒內(nèi)標(biāo)溶液后，提取待測(cè)樣品的RNA，得到模板RNA溶液； (2 )、反應(yīng)組分配制:分別配制檢測(cè)物、陽(yáng)性對(duì)照物和陰性對(duì)照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、模板RNA溶液和DEPC-H2O制成檢測(cè)物；加入PCR混合液、TaqDNA聚合酶、AMV酶、陽(yáng)性質(zhì)控品和DEPC-H2O制成陽(yáng)性對(duì)照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、陰性質(zhì)控品和DEPC-H2O制成陰性對(duì)照物； (3)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多種比例的稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.-^4 ， (4)、擴(kuò)增:分別將檢測(cè)物、陽(yáng)性對(duì)照物和陰性對(duì)照物放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，首先50°C下反轉(zhuǎn)錄20min,接著95°C預(yù)變性3min, 95°C下變性IOsec,在60°C下退火延伸45sec,采集熒光信號(hào)，進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)； (5)結(jié)果判定:根據(jù)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值判定結(jié)果；當(dāng)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的Ct值小于35或者靶基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)結(jié)果有效；若內(nèi)標(biāo)檢測(cè)和靶基因檢測(cè)結(jié)果均為陰性時(shí)結(jié)果無(wú)效，需重復(fù)此樣本的檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的西尼羅病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(5)中，判定結(jié)果包括定性結(jié)果判定和定量結(jié)果判定； 所述定性結(jié)果判定為: Ct值> 40.0或無(wú)擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)西尼羅病毒； Ct值< 35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在西尼羅病毒； Ct值在35.0-40.0之間的重做檢測(cè)，重做結(jié)果Ct值大于40.0或無(wú)擴(kuò)增曲線者為陰性，否則為陽(yáng)性； 所述定量結(jié)果判斷為:先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多種比例的稀釋后與未知樣品同時(shí)做熒光PCR檢測(cè)；然后根據(jù)已知量，計(jì)算出各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的核酸拷貝數(shù)；以標(biāo)準(zhǔn)品的核酸拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為Y軸，熒光PCR檢測(cè)的Ct值為X軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線；將樣品的檢測(cè)Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式算出未知樣品的核酸濃度。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773896SQ201410014796
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】翟建新, 花群義, 朱志杰, 張利 申請(qǐng)人:深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司