一種定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1能夠從野生型的轉(zhuǎn)移半乳糖變?yōu)榛局晦D(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖，并非如現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的突變后的β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1將同時(shí)轉(zhuǎn)移半乳糖和乙酰氨基半乳糖，并且兩者的轉(zhuǎn)移效率相接近都為50%，有很大的區(qū)別。因此，定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1可在生產(chǎn)不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶中的應(yīng)用。突變后的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1從轉(zhuǎn)移半乳糖變?yōu)檗D(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖，所以改變了乳汁中的乳糖成分，使其成為一種乳糖類(lèi)似物，所以通過(guò)突變育種技術(shù)突變哺乳動(dòng)物的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1基因可以生產(chǎn)出幾乎不含乳糖的新型奶，即可避免乳糖不耐癥的發(fā)生。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，我們已經(jīng)可以通過(guò)基因改造手段培育各種生物新品系，尤其是針對(duì)一些模式生物的技術(shù)手段已經(jīng)非常成熟?，F(xiàn)在常用的基因改造手段有:轉(zhuǎn)基因技術(shù)、常規(guī)基因敲除技術(shù)、基因敲入技術(shù)和條件敲除技術(shù)等。比如基因敲入技術(shù)，可以特異性地在靶基因中引入突變點(diǎn)以模擬人類(lèi)家族遺傳病的基因突變類(lèi)型，也可以將外源基因整合到基因組的特定位點(diǎn)，或者進(jìn)行物種間同源基因的替代。但是對(duì)具體突變位點(diǎn)以及突變方向的選擇，關(guān)系到突變型生物的具體功能，還需要進(jìn)行大量研究。
[0003]糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖從供體的轉(zhuǎn)移過(guò)程，并負(fù)責(zé)糖苷鍵的形成。糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)核苷酸糖供體和接納體具有特異性。β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I是目前人們研究最為廣泛和深入的糖基轉(zhuǎn)移酶之一。該酶在哺乳動(dòng)物的乳腺中表達(dá)量很高，且隨哺乳過(guò)程表達(dá)增高。在細(xì)胞中，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I主要分布在高爾基體上，其基本功能是負(fù)責(zé)將半乳糖基從糖供體UDP-半乳糖苷轉(zhuǎn)移至乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，形成β_1，4糖苷鍵。但已有的文獻(xiàn)表明，突變后的β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I將同時(shí)轉(zhuǎn)移半乳糖和乙酰氨基半乳糖，并且兩者的轉(zhuǎn)移效率相接近，都為50%[1]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是通過(guò)基因敲入技術(shù)，提供一種定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供該定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在生產(chǎn)不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶中的應(yīng)用，其中，所述的定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I是通過(guò)基因工程手段定向突變牛野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者豬野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列的第288位酪氨酸，或者其他哺乳動(dòng)物相似位點(diǎn)的酪氨酸，使野生型的轉(zhuǎn)移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上變?yōu)橥蛔冃偷霓D(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上。
[0008]所述的酪氨酸優(yōu)選定向突變?yōu)榱涟彼帷?br> [0009]定向突變后的牛β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]定向突變后的豬β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。 [0011]一種生產(chǎn)不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶的方法，對(duì)哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列特定位點(diǎn)的酪氨酸進(jìn)行突變，使野生型的轉(zhuǎn)移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上變?yōu)橥蛔冃偷霓D(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，從而使乳汁中的乳糖(Gali3 l，4Glc)發(fā)生改變成為乳糖類(lèi)似物(GalNAc β 1，4Glc) —種在牛初乳中本身微量存在的物質(zhì)[2]。[0012]本發(fā)明所述的極低乳糖含量是指基本不含有乳糖。
[0013]所述的哺乳動(dòng)物選自豬、?；蜓?。
[0014]所述的方法優(yōu)選將牛野生型β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者豬野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列的第288位酪氨酸定向突變?yōu)榱涟彼帷?br> [0015]定向突變后的牛β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0016]定向突變后的牛β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0017]有益效果:
[0018]本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I能夠從野生型的轉(zhuǎn)移半乳糖變?yōu)榛局晦D(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖，并非如現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的突變后的β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I將同時(shí)轉(zhuǎn)移半乳糖和乙酰氨基半乳糖且兩者的轉(zhuǎn)移效率相接近都為50%，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與現(xiàn)有報(bào)道有很大的區(qū)別。
[0019]因?yàn)槿橹腥樘堑膩?lái)源是由β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I轉(zhuǎn)移一個(gè)半乳糖基到葡萄糖基，從而生成乳糖。當(dāng)我們突變了 β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I后，β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I就轉(zhuǎn)移一個(gè)乙酰氨基半乳糖到葡萄糖基上，生成一種乳糖的類(lèi)似物(GalNAc β l，4Glc)，而不再轉(zhuǎn)移半乳糖，所以乳汁中的乳糖則基本不再生成。
[0020]基于本發(fā)明的上述重大發(fā)現(xiàn)，以及哺乳動(dòng)物乳汁中的乳糖來(lái)源很大程度上依靠的是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1，本發(fā)明提出了定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在生產(chǎn)不含乳糖的天然奶中的應(yīng)用。突變后的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I從轉(zhuǎn)移半乳糖變?yōu)檗D(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖，所以改變了乳汁中的乳糖成分，使其成為一種乳糖類(lèi)似物，所以通過(guò)突變育種技術(shù)突變哺乳動(dòng)物的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I基因可以生產(chǎn)出含有新型游離寡糖而幾乎不含乳糖的新型奶，這樣便可以避免乳糖不耐癥的發(fā)生。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1 為本發(fā)明豬源 β 4GalTl 和 β 4GaITlltut 的 western-blot 結(jié)果圖
[0022]圖2 為本發(fā)明牛源 β ’ 4GalTl 和 β ’ 4GaITlltut 的 western-blot 結(jié)果圖
[0023]圖3 為本發(fā)明豬、牛源 MGalTl (β ’ 4GalTl)和 ^4GalTlMut(^ ’ 4GalTlMut)分別獨(dú)立加入U(xiǎn)DP-Gal和UDP-GalNAc兩種底物的反應(yīng)體系的LC譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)例。
[0025]實(shí)施例1
[0026]根據(jù)Gene Bank中豬源β 1，4_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物兩端帶有限制性?xún)?nèi)切酶EcoRl和Xhol的堿基序列以及保護(hù)性堿基。
[0027]Pl-F:5’-CGGAATTCCGAGGGGCCGCACCGCAG-3’ (SEQ ID N0.3)
[0028]Pl-R:5’-CCGCTCGAGCTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACT-3’ (SEQ ID N0.4)
[0029]從豬肝中抽提RNA,采用Takara公司的Trizol試劑盒進(jìn)行RNA的抽提實(shí)驗(yàn)。得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自Promega公司。[0030]采用Takara公司提供的PCR試劑盒，以cDNA為模板，Pl-F和Pl-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 循環(huán)參數(shù):預(yù)變性 980C，5min;98°C，40s ；62°C, Imin; 72°C，Imin 共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOmin0
[0031]采用Axygen公司的膠回收試劑盒將目的基因片段進(jìn)行純化。將純化后的目的基因和空載體pet30a分別進(jìn)行EcoRl和Xhol雙酶切，分別將雙酶切后的目的基因和載體pet30a進(jìn)行切膠回收，然后將目的基因和載體進(jìn)行常規(guī)連接反應(yīng)。
[0032]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有Kana的LB瓊脂平板，培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑取菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，得到完全正確的克隆菌株。其基因的genbank登錄號(hào)為G1: 545853190。
[0033]抽提含有正確目的片段的菌株的質(zhì)粒β 4GalTl_pet30a,抽提試劑盒由Axygen公司提供。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)工程菌BL21 (DE3)。
[0034]實(shí)施例2
[0035]根據(jù)stratagene公司的Quick-change點(diǎn)突變?cè)噭┖械囊?設(shè)計(jì)如下引物:
[0036]P2-F:5’-CCTTATGTGCAGCTGTTCGGCGGTGTCTCTG-3’ (SEQ ID N0.5)
[0037]P2-R:5’-GACACCGCCGAACAGCTGCACATAAGGGAG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0038]PCR的過(guò)程以實(shí)施例1構(gòu)建的β 4GalTl-pet30a質(zhì)粒為模板，將β 4GalTl基因的865-867位堿基TAT改為CTG ，即將豬源β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I第288位酪氨酸(Tyr)突變?yōu)榱涟彼?Leu)，PCR循環(huán)參數(shù):預(yù)變性 98°C，lmin;98°C，50s ;60°C，50s; 68°C，8min共進(jìn)行18個(gè)循環(huán)；68°C再延伸lOmin。得到的PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶Dpnl消化原始質(zhì)粒模板，將經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Dpnl消化的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化高效率的感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)后挑菌提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，即可得到含有突變基因的質(zhì)粒β 4GalTlMut_pet30a。抽提質(zhì)粒β 4GalTlMut_pet30a轉(zhuǎn)化表達(dá)工程菌BL21 (DE3)。
[0039]實(shí)施例3 β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)
[0040]將經(jīng)鑒定后的β 4GalTl-pet30a和β 4GalTlMut-pet30a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)中。置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)成大小合適的菌落。挑取含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種至含kana (50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)液，置搖床37°C，250r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量(v/v)轉(zhuǎn)接至新鮮LB (400mL)培養(yǎng)液中，37°C，250r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6tltl ^ 0.6-0.8)，分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1.0mmoI/L,置25°C搖床，250r/min誘導(dǎo)表達(dá)3h。
[0041 ] 實(shí)施例4目的蛋白的純化
[0042]取適量實(shí)施例3方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌培養(yǎng)液，4800g/min離心20min收集菌體，菌體重懸于裂解液IOmL (P H7.550mM NaCl; 50mM Tris-HCl; l%Triton)緩沖液中，冰浴中超聲破碎細(xì)胞。將超聲破碎后的樣品13000r/min，4°C離心20min取上清即為粗酶液。
[0043]由于設(shè)計(jì)的β 4GalTl_pet30a和β 4GalTlMut-pet30a表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物N端帶有6個(gè)連續(xù)的組氨酸，可以通過(guò)親和層析柱(N1-NTA瓊脂糖凝膠)親和純化。首先用洗脫液平衡柱子(pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl)，將粗酶液負(fù)載上柱；采用5倍體積洗脫液(pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCllOmM咪唑)進(jìn)行洗脫除去雜蛋白，然后用一定量的洗脫液(pH8.050mM NaCl50mM Tris_HC1250mM咪唑)收集目的蛋白。保存目的蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。[0044]實(shí)施例5純化過(guò)后的目的蛋白，做western-blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)
[0045]分別取β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I及其突變體兩種初純化目的蛋白30 μ L，加入5Χ的上樣緩沖液，在100°c加熱IOmin使其失活，采用12%的聚丙烯酰胺濃度的SDS-PAGE跑蛋白樣品，濃縮膠80v電壓半小時(shí)左右，分離膠IOOv電壓2個(gè)小時(shí)左右，然后進(jìn)行2個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)膜，使其轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，電壓使用150v。轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)行1-2小時(shí)的封閉。然后使用小鼠來(lái)源的抗組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體(來(lái)自Sigma公司)按照說(shuō)明書(shū)的要求孵育過(guò)夜，二抗采用山羊來(lái)源的抗小鼠的抗體在室溫下孵育1-2小時(shí)，最后使用DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)。Western-bolt圖如I所不。
[0046]實(shí)施例6
[0047]根據(jù)Gene Bank中牛源β 1，4_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物兩端帶有限制性?xún)?nèi)切酶Kpnl和EcoRl的堿基序列以及保護(hù)性堿基。
[0048]P3-F:5’-GGGGTACCAAGATGAAGTTTCGGGAGCCG-3’ (SEQ ID N0.7)
[0049]P3-R:5’-GGAATTCCTAGCTCGGCGTCCCGATGT-3’ (SEQ ID N0.8)
[0050]從牛肝中抽提RNA,采用Takara公司的Trizol試劑盒進(jìn)行RNA的抽提實(shí)驗(yàn)。得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自Promega公司。
[0051]采用Takara公司提供的PCR試劑盒，以cDNA為模板，P3-F和P3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 循環(huán)參數(shù):預(yù)變性 980C，5min;98°C，40s ；62°C, Imin; 72°C，Imin 共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOmin0
[0052]采用Axygen公司的膠·回收試劑盒將目的基因片段進(jìn)行純化。將純化后的目的基因和空載體pet30a分別進(jìn)行雙酶切，限制性?xún)?nèi)切酶Kpnl和EcoRl由Thermo公司提供。分別將雙酶切后的目的基因和載體pet30a進(jìn)行切膠回收，然后將目的基因和載體進(jìn)行常規(guī)連接反應(yīng)。
[0053]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有Kana的LB瓊脂平板，培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑取菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，得到完全正確的克隆菌株。其 genbank 的登錄號(hào)為 G1: 31343557。
[0054]抽提含有正確目的片段的菌株的質(zhì)粒β ’ 4GalTl_pet30a,抽提試劑盒由Axygen公司提供。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)工程菌BL21 (DE3)。
[0055]實(shí)施例7
[0056]根據(jù)stratagene公司的Quick-change點(diǎn)突變?cè)噭┖械囊?設(shè)計(jì)如下引物:
[0057]P4-F:5’-CCTTACGTGCAGCTGTTTGGAGGTGTCTCTGCTC-3’ (SEQ ID N0.9)
[0058]P4-R:5’-AGACACCTCCAAACAGCTGCACGTAAGGTAGGCTA-3’ (SEQ ID N0.10)
[0059]PCR的過(guò)程以實(shí)施例6構(gòu)建的β，4GalTl-pet30a質(zhì)粒為模板，將β MGalTl基因的868-870位堿基TAT改為CTG，即將牛源β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I第289位酪氨酸(Tyr)突變?yōu)榱涟彼?Leu)，PCR 循環(huán)參數(shù):預(yù)變性 98°C，Imin; 98°C，50s ；60°C, 50s; 68°C，8min共進(jìn)行18個(gè)循環(huán)；68°C再延伸lOmin。用限制性?xún)?nèi)切酶Dpnl消化原始質(zhì)粒模板，將經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Dpnl消化的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化高效率的感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)后挑菌提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，即可得到含有突變基因的質(zhì)粒β ’ 4GalTlMut-pet30a。抽提質(zhì)粒β ’ 4GalTlMut-pet30a轉(zhuǎn)化表達(dá)工程菌BL21(DE3)。
[0060]實(shí)施例8 β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)[0061]將經(jīng)鑒定后的β ’ 4GalTl-pet30a和β ’ 4GalTlMut-pet30a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)中。置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)成大小合適的菌落。挑取含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種至含kana (50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)液，置搖床37°C，250r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量(v/v)轉(zhuǎn)接至新鮮LB (400mL)培養(yǎng)液中，37°C，250r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6tltl~0.6-0.8)，分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1.0mmoI/L,置25°C搖床，250r/min誘導(dǎo)表達(dá)3h。
[0062]實(shí)施例9目的蛋白的純化
[0063]取適量實(shí)施例8方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌培養(yǎng)液，4800g/min離心20min收集菌體，菌體重懸于裂解液IOmL (P H7.550mM NaCl; 50mM Tris-HCl; l%Triton)緩沖液中，冰浴中超聲破碎細(xì)胞。將超聲破碎后的樣品13000r/min，4°C離心20min取上清即為粗酶液。
[0064]由于設(shè)計(jì)的β ’ 4GalTl-pet30a和β ’ 4GalTlMut-pet30a表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物N端帶有6個(gè)連續(xù)的組氨酸，可以通過(guò)親和層析柱(N1-NTA瓊脂糖凝膠)親和純化。首先用洗脫液平衡柱子(pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl),將粗酶液負(fù)載上柱；采用5倍體積洗脫液(pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCllOmM咪唑)進(jìn)行洗脫除去雜蛋白，然后用一定量的洗脫液(pH8.050mM NaCl50mM Tris_HC1250mM咪唑)收集目的蛋白。保存目的蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0065]實(shí)施例10純化過(guò)后的目的蛋白，做western-blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)
[0066]分別取β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I及其突變體兩種初純化目的蛋白30 μ L，加入5Χ的上樣緩沖液，在100°c加熱IOmin使其失活，采用12%的聚丙烯酰胺濃度的SDS-PAGE跑蛋白樣品，濃縮膠80v電壓半小時(shí)左右，分離膠IOOv電壓2個(gè)小時(shí)左右，然后進(jìn)行2個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)膜，使其轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，電壓使用150v。轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)行1-2小時(shí)的封閉。然后使用小鼠來(lái)源的抗組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體(來(lái)自Sigma公司)按照說(shuō)明書(shū)的要求孵育過(guò)夜，二抗采用山羊來(lái)源的抗小鼠的抗體在室溫下孵育1-2小時(shí)，最后使用DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)。Western-bolt圖如2所不。
[0067]實(shí)施例11
[0068]豬源及牛源的β I, 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I (實(shí)施例4和9制備)及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定一共進(jìn)行8組反應(yīng):
[0069]
【權(quán)利要求】
1.定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在生產(chǎn)不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶中的應(yīng)用，其中，所述的定向突變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I是通過(guò)基因工程手段定向突變牛野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列第289位酪氨酸，或者豬野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列第288位酪氨酸，或者其他哺乳動(dòng)物相似位點(diǎn)的酪氨酸，使野生型β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的轉(zhuǎn)移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上變?yōu)橥蛔冃挺?1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的轉(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的酪氨酸定向突變?yōu)榱涟彼帷?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于定向突變后的牛β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于定向突變后的豬β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.一種生產(chǎn)不含乳糖或極低乳糖含量的天然奶的方法，其特征在于對(duì)哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列特定位點(diǎn)的酪氨酸進(jìn)行突變，使野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的轉(zhuǎn)移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上變?yōu)橥蛔冃挺?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I的轉(zhuǎn)移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，從而使乳汁中的乳糖(Gal β I, 4Glc)發(fā)生改變成為乳糖類(lèi)似物(GalNAc β I, 4Glc)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物選自豬、牛或羊。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于將牛野生型β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者豬野生型β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列的第288位酪氨酸定向突變?yōu)榱涟彼帷?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的·方法，其特征在于定向突變后的牛β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于定向突變后的牛β?，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK103849606SQ201410027426
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】約瑟夫·弗戈邁爾, 劉麗, 陳歡 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)