專利名稱：一種轉(zhuǎn)糖基α一半乳糖苷酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種α-半乳糖苷酶基因，尤其涉及一種轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因及其所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
寡糖是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物來(lái)源的生理活性物質(zhì)的要素之一，具有強(qiáng)大的生物信息傳遞等功能。因而，寡糖用于藥物修飾、寡糖結(jié)構(gòu)的分析和寡糖合成技術(shù)的發(fā)展就引起了人們的極大關(guān)注。寡糖作為一種療法雖然被科學(xué)家公認(rèn)具有相當(dāng)大的潛能，但是至今其重要的作用還是沒(méi)有得到充分的體現(xiàn)。其發(fā)展緩慢的原因之一是合成足夠于臨床使用量的寡糖非常困難。糖類化合物上多個(gè)可反應(yīng)的羥基使特異性糖苷鍵的化學(xué)法合成步驟繁瑣，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。酶法催化合成寡糖憑借其簡(jiǎn)單的步驟、特異的區(qū)域選擇性和立體選擇性，正在成為寡糖和糖綴合物合成的主流。
有兩類酶用于催化糖苷鍵的合成糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶。糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)用于生產(chǎn)某些寡糖，但酶的較難獲得和核苷底物的高成本限制了其廣泛應(yīng)用。而糖苷酶催化的糖苷和低聚糖合成反應(yīng)途徑簡(jiǎn)單，不需要其它輔助因子，底物通常為價(jià)格便宜的單糖和雙糖。酶較易獲得，性質(zhì)穩(wěn)定。但是，糖苷酶所進(jìn)行的合成反應(yīng)中，轉(zhuǎn)糖基新生成的糖苷和寡糖也可以重新被酶作為底物水解，反應(yīng)處于水解和合成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的產(chǎn)量一般較低。為了打破這個(gè)平衡，科學(xué)家進(jìn)行了不懈的努力。利用酶反應(yīng)的熱力學(xué)及動(dòng)力學(xué)原理加大底物濃度、提高反應(yīng)溫度等可以在一定程度上提高糖苷產(chǎn)物的產(chǎn)量(10-40％)；采用高濃度有機(jī)溶劑(80-90％，v/v)或兩相反應(yīng)體系，降低水的濃度和活性，促使反應(yīng)平衡向糖苷合成的方向進(jìn)行，進(jìn)一步提高了糖苷產(chǎn)物的產(chǎn)量(40-60％)。但是反應(yīng)體系中水的有效濃度的維持和低水環(huán)境下水的高活性都在一定程度上限制了產(chǎn)物的產(chǎn)量及這些方法的最終應(yīng)用。
近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步大大推動(dòng)了糖苷酶合成寡糖領(lǐng)域的研究。1998年，科學(xué)家對(duì)糖苷酶進(jìn)行分子改造，在酶催化中心用非親核氨基酸殘基取代親核催化氨基酸殘基，產(chǎn)生了一類新型活性酶，只催化合成反應(yīng)，因此命名為糖苷合成酶(Glycosynthases)。糖苷合成酶的出現(xiàn)，徹底解決了產(chǎn)物被水解的問(wèn)題，從根本上提高了糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基效率(轉(zhuǎn)糖基效率可達(dá)90％以上)。到目前為止，國(guó)際上發(fā)展的糖苷合成酶共有13種，來(lái)源于11種不同的微生物及植物，分別由β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-甘露聚糖苷酶等改造獲得，α-半乳糖苷合成酶的研究還未見(jiàn)報(bào)道。目前寡糖合成領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)就是尋找不同來(lái)源的高效轉(zhuǎn)糖基糖苷酶，并獲得酶基因，以便在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基因改造獲得糖苷合成酶。
α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)，是一類重要的糖苷水解酶，在人、動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，可特異性水解α-半乳糖苷鍵，還可以把α-半乳糖基轉(zhuǎn)移到不同的羥基類衍生物上。其水解活性研究得較多，被廣泛應(yīng)用于加工農(nóng)產(chǎn)品、人B→O血型改造、清除異種抗原以及治療遺傳性疾病法布萊氏病等；其轉(zhuǎn)半乳糖基活性直到1988年才被日本科學(xué)家報(bào)道，目前國(guó)際上僅報(bào)道了十種來(lái)源的α-半乳糖苷酶具有轉(zhuǎn)糖基活性，其中，有四種來(lái)源的α-半乳糖苷酶與蜜二糖進(jìn)行了轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)并鑒定了產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，均為Galα(1→6)Galα(1→6)Glc。為了獲得新的酶法合成α-半乳糖苷鍵型，需要尋找新的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶。此外，由于不同來(lái)源的α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)半乳糖基反應(yīng)的糖基受體專一性存在差異，因此尋找不同來(lái)源的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶對(duì)酶法合成不同α-半乳糖基寡糖及糖綴合物有著重要意義。
值得注意的是，轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶遵循構(gòu)型保持糖苷酶的作用機(jī)制，催化可逆反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率受到一定限制，因此在糖的大規(guī)模合成中存在局限性。這就需要進(jìn)一步研究酶基因，為分子改造提供基礎(chǔ)，以獲得α-半乳糖苷合成酶，從根本上提高合成效率。目前國(guó)際上僅有五種轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因報(bào)道，而有關(guān)α-半乳糖苷合成酶的研究報(bào)道還是空白。所以研究不同來(lái)源的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因，可以為糖苷酶的分子改造提供新的酶源，對(duì)高效合成不同鍵型的α-半乳糖基寡糖及糖綴合物有著重要意義。
經(jīng)檢索，目前國(guó)際上沒(méi)有短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因，為α-半乳糖苷合成酶的獲得提供新的酶源，并填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外短雙歧桿菌轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因研究的空白。
本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因來(lái)源于短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700，特征如下(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全長(zhǎng)2226堿基；(2)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，具有不同于SEQ ID No.1所示核苷酸序列但與SEQID No.1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；(3)該基因編碼741個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示。
上述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其方法是，將該基因克隆到pET-22b質(zhì)粒表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)重組α-半乳糖苷酶，特征如下(1)上述基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組酶為雙亞基蛋白，聚合體分子量約為160kD，單亞基分子量約為80kD；酶對(duì)對(duì)硝基苯酚α-D-半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)的Km為0.17mmol/L，Vmax為4.43μmol/(L·min)，對(duì)蜜二糖和棉子糖的Km值分別為0.66mmol/L，2.20mmol/L，Vmax分別為0.58μmol/(L·min)，0.65μmol/(L·min)；酶對(duì)pNPG適宜反應(yīng)的溫度為37℃～40℃，適宜反應(yīng)的pH為5.5～6.5；酶于4℃保存時(shí)，在pH 5.5～9.5范圍內(nèi)至少穩(wěn)定保存24小時(shí)；Hg2+、Cu2+、Ag+強(qiáng)烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、DTT、EDTA對(duì)酶的活性沒(méi)有抑制作用；(2)上述基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組酶在水解蜜二糖或棉子糖的反應(yīng)體系中具有轉(zhuǎn)糖基活性，反應(yīng)中有轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物生成，其中，酶在蜜二糖反應(yīng)體系中的主要轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為Galα(1→4)Galα(1→6)Glc，國(guó)際上現(xiàn)有的α-半乳糖苷酶的報(bào)道中，將半乳糖基轉(zhuǎn)至蜜二糖的鍵型全部為α(1→6)鍵；在以pNPG為糖基供體時(shí)，能將半乳糖基轉(zhuǎn)移到多種糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等；其廣泛的受糖體底物特異性，可用以合成多種α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。
其中，上述重組酶對(duì)pNPG的最適反應(yīng)溫度為37℃。
其中，上述重組酶對(duì)pNPG的最適反應(yīng)pH為5.5～6.0。
在上述pH5.5～9.5的緩沖范圍中，pH5.5～8.0范圍使用磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液，pH8.0～10.0范圍使用硼酸—?dú)溲趸c緩沖液。
在上述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用中，將該基因克隆到pET-22b質(zhì)粒表達(dá)載體上，不僅可以獲得大量重組酶以解決雙歧桿菌難以培養(yǎng)的問(wèn)題，同時(shí)還可用于基因改造，即對(duì)酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，在酶催化中心用非親核氨基酸殘基取代親核催化氨基酸殘基，以獲得α-半乳糖苷合成酶，徹底去除水解反應(yīng)，從根本上提高α-半乳糖基寡糖及糖綴合物的合成效率。


圖1為本發(fā)明的α-半乳糖苷酶基因表達(dá)的重組酶以蜜二糖為底物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。
其中Lane 1，蜜二糖與滅活酶液反應(yīng)；Lane 2，蜜二糖與純酶反應(yīng)。
圖2為本發(fā)明的α-半乳糖苷酶基因表達(dá)的重組酶以棉子糖為底物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。
其中Lane 1，棉子糖與滅活酶液反應(yīng)；Lane 2，棉子糖與純酶反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700染色體DNA的提取將短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700接種于5mL MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，取1.5ml培養(yǎng)物，12,000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，所得沉淀懸于565μL的TE緩沖液中，加入溶菌酶至終濃度10mg/ml，37℃溫育30分鐘；加入30μL10％(質(zhì)量體積比)的十二烷基硫酸鈉(SDS)和5μL 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1小時(shí)；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)，混勻；12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入新管中，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻；12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入新管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來(lái)；12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，DNA沉淀用70％乙醇洗滌2次；真空干燥10分鐘，重溶于50μL的TE緩沖液。
上述MRS培養(yǎng)基配方為蛋白胨1g/L；K2HPO40.2g/L；檸檬酸三銨0.2g/L；牛肉浸膏1g/L；NaAc·3H2O 0.05g/L；MgSO4·7H2O 0.02g/L；MnSO4·4H2O 0.005g/L；酵母浸膏0.5g/L；葡萄糖2g/L；Tween 800.1g/L；pH 6.0～6.6，115℃滅菌30分鐘；TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，調(diào)pH為8.0。
實(shí)施例2B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段克隆從GenBank中檢索到不同菌株的α-半乳糖苷酶基因的DNA序列，用在線軟件Clustal W比較序列同源性，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并PCR引物Wtz-F5’-(TC)TI AA(TC)A(AC)(N)TGG GA(AG)G-3’Wtz-R5’-(GA)TC CCA(CT)TT(N)A(CT)(GA)TA(GA)TC-3’以提取的B.breve ATCC 15700染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，含超純水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa Taq 2.5U。PCR擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性5分鐘；反應(yīng)28個(gè)循環(huán)(95℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘)；28個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物約為460bp左右，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測(cè)，然后回收，所得產(chǎn)物即為B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段，測(cè)得序列如SEQ ID No.2。
詳列如下gattatccca ctttatgtag tctatgccga gttcgctcac aagcgcatcc atgcagccgt 60acacctagcc gtaggcctgt gggttcgtca ggtcgaccac ctgctggttg cggccctgca 120ttggcaggcg atgcgccgtg gggcgcagca cccagtcggg gtgctctcgg tacatgtccg 180aatcgggatt caccatctct ggctcgaacc acaagccgaa ctccatgcct ttggcgtgca 240cgtagtcggc gagcgccttg agtgaatggt cgccgtctgg ccacacgtcc tgagctatgt 300gccagtcgcc cagcccagcg gtatcgtcgc gccgggcgcc gaaccacccg tcgtccacca 360cgaagcgttc cacgccgcta gcggcggcct tgtcggcgag cgccttcaac gtgtcgaaat 420catgctggaa ctacaccgcc tcccatgtgt tcaaatc 480上述α-半乳糖苷酶基因保守序列DNA片段與已報(bào)道的2株雙歧桿菌——青春雙歧桿菌(B.adolescentis)和長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)的α-半乳糖苷酶基因均有較高的同源性，說(shuō)明此保守DNA片段非常適合作為探針進(jìn)行標(biāo)記，與B.breve ATCC 15700的DNA進(jìn)行Southern雜交，篩選B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因。
實(shí)施例3B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因克隆(1)B.breve ATCC 15700部分基因文庫(kù)的構(gòu)建B.breve ATCC 15700染色體DNA提取后，同時(shí)進(jìn)行六組完全酶切，六組酶分別是BamH I-HindIII、BamH I-Nde I、BamH I-Xba I、HindIII-Nde I、HindIII-Xba I、BamH I(TaKaRa)。電泳后轉(zhuǎn)膜，用已克隆的457bp的DNA片段為探針，進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果顯示B.breve ATCC 15700染色體DNA經(jīng)BamH I和Nde I雙酶切后，可與探針雜交的片段在6kb左右，可用于構(gòu)建部分基因文庫(kù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)估測(cè)，部分基因文庫(kù)中81.3％左右的重組菌連有外源片段，文庫(kù)構(gòu)建成功。
(2)含α-半乳糖苷酶基因重組質(zhì)粒的篩選、驗(yàn)證及序列測(cè)定挑選重組菌單菌落接種到5ml LB液體氨芐(100μg/mL)培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜搖床培養(yǎng)，離心收集菌細(xì)胞，測(cè)定酶活，篩選到有α-半乳糖苷酶水解活性的重組菌(編號(hào)為51)，提取質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH I單酶切及BamH I-HindIII雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示，單酶切得到11.5kb左右的一條帶，而雙酶切得到5.5kb左右和6kb左右的兩條帶，分別符合載體和外源片段的大小。將該重組菌質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
上述LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉7g/L，pH 7.0～7.5，121℃滅菌20分鐘。
上述α-半乳糖苷酶水解活性測(cè)定取菌細(xì)胞30mg，加150μL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.5)配制的2mmol/LpNPG，37℃反應(yīng)10分鐘后，加入1.05ml、0.2mol/L、pH 10.5硼酸緩沖液終止反應(yīng)，12000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，上清液于400nm比色?；盍挝灰?guī)定每分鐘從對(duì)硝基苯酚糖苷底物中水解釋放1μmol硝基苯酚的糖苷酶量為1個(gè)酶活單位(U)。
(3)B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因序列的確定對(duì)上述測(cè)序得到的序列進(jìn)行分析，顯示有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架，由2226個(gè)核苷酸組成，編碼741個(gè)氨基酸，與已發(fā)表的青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌的α-半乳糖苷酶氨基酸序列同源性均超過(guò)70％，并且具有α-半乳糖苷酶的保守序列模式，因而確定該核苷酸序列為B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因序列，如SEQ ID No.1所示。
實(shí)施例4 B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因的亞克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)設(shè)計(jì)引物，引入能插入pET-22b質(zhì)粒(Novagen)的Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)(pET-22b質(zhì)粒載體具有C端6His標(biāo)記，便于表達(dá)蛋白的純化)，序列如下22b-F5’-CTCTCATATGATGGCAATCATGGATTTCCACGGGAG-3’22b-R5’-ATATGGATCCGCTCTC ACGCGCGTGGCGCTGAAC-3’將重組菌51接種于5ml LB液體氨芐培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜搖床培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA作為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，含超純水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa LA Taq 2.5U。PCR擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性5分鐘；反應(yīng)28個(gè)循環(huán)(95℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘)；28個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物約為2.2kb左右，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測(cè)，然后回收，所得產(chǎn)物即為B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶全基因片段。依次加Nde I和BamH I于37℃酶切3小時(shí)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測(cè)，回收目的片段，同時(shí)采用同樣酶切方法處理pET-22b質(zhì)粒載體。將制備好的酶基因片段與pET-22b載體按一定比例混合，采用連接試劑盒(TaKaRa DNA LigationKitVer.2.0)于16℃連接8小時(shí)。然后采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化菌液涂布氨芐青霉素平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，對(duì)質(zhì)粒酶切正確的重組菌進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)，即重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集菌細(xì)胞，測(cè)α-半乳糖苷酶水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性，將完全符合要求的重組菌作為菌種保存。
上述α-半乳糖苷酶水解活性測(cè)定方法同實(shí)施例3。
上述α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖基活性測(cè)定方法取50mg菌細(xì)胞，懸浮于1mL pH7.0、10mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，于冰水浴用玻璃珠破碎細(xì)胞，懸液于10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，所得上清液即為粗酶液。取20μL粗酶液，加入100μL pH7.0磷酸鉀緩沖液配制的100mmol/L蜜二糖或棉子糖溶液，于37℃反應(yīng)2小時(shí)，12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清液即為反應(yīng)產(chǎn)物。
將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，確定轉(zhuǎn)糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)點(diǎn)樣后，在展層劑(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展層，霧噴顯色劑(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羥基甲苯)，于120℃烘烤10分鐘，糖斑點(diǎn)顯色，如果底物糖斑點(diǎn)以下生成了新的大分子寡糖斑點(diǎn)，則α-半乳糖苷酶有轉(zhuǎn)糖基活性。
實(shí)施例5 B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化將實(shí)施例4所保存的E.coli BL21(DE3)重組菌接種于200mL LB氨芐培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)接于2L LB氨芐培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)液在600nm下的吸光度變化。當(dāng)吸光值達(dá)0.5～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度1mmol/L，再繼續(xù)培養(yǎng)3～5小時(shí)，于12000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，獲得細(xì)胞沉淀，懸浮于80mL pH7.0，10mmol/L的磷酸鉀緩沖液。在冰水浴中超聲波破碎細(xì)胞，破碎液于4℃以12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，所得上清即為粗酶液。
粗酶液用Ni-NTA Agarose(QIAGEN)親合柱層析除去不帶6His標(biāo)記的雜蛋白，然后用DEAE Sepharose Fast Flow柱層析得到了電泳純?chǔ)?半乳糖苷酶。
實(shí)施例6B.breve ATCC 15700重組α-半乳糖苷酶的基本酶學(xué)特性(1)酶的分子量酶蛋白分子量的測(cè)定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的PAGE圖，測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移值Rf，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白的Rf值對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)純酶樣品的Rf值，就可求得其分子量。SDS-PAGE采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方式，電泳分離膠濃度為12％，濃縮膠為4％；Native gradient PAGE(非解離梯度聚丙稀酰胺凝膠電泳)采用5～20％線形梯度垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠，4℃電泳。
Native gradient PAGE顯示酶蛋白的分子量約為160kD，SDS-PAGE顯示酶蛋白單亞基分子量約為80kD，表明該酶為一個(gè)雙亞基蛋白。
(2)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定采用雙倒數(shù)法。
將30μL純酶(1.42U/mL)與150μL不同濃度(濃度范圍0.24～1.75mmol/L)的pNPG溶液混合，于37℃反應(yīng)3分鐘，加1.05mL 0.2mol/L、pH 10.5硼酸緩沖液終止反應(yīng)，測(cè)定OD400，計(jì)算水解速率，用雙倒數(shù)作圖法測(cè)得酶對(duì)pNPG的Km值為0.17mmol/L，Vmax為4.43μmol/(L·min)。
將30μL純酶(2.5U/mL)與150μL不同濃度(濃度范圍0.072～0.35mol/L)的蜜二糖溶液混合，于37℃反應(yīng)30分鐘，用葡萄糖試劑盒(上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司)測(cè)定水解的葡萄糖含量，計(jì)算水解速率，用雙倒數(shù)作圖法測(cè)得酶對(duì)蜜二糖的Km值為0.66mmol/L，Vmax為0.58μmol/(L·min)。
將30μL純酶(2.5U/mL)與150μL不同濃度(濃度范圍0.072～0.35mol/L)的棉子糖溶液混合，于37℃反應(yīng)30分鐘，用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法測(cè)定水解反應(yīng)產(chǎn)物中的還原糖含量，計(jì)算水解速率，用雙倒數(shù)作圖法測(cè)得酶對(duì)棉子糖的Km值為2.20mmol/L，Vmax為0.65μmol/(L·min)。
(3)溫度和pH對(duì)酶活性的影響在適當(dāng)?shù)臏囟确秶?20℃～70℃)內(nèi)，每5℃為一個(gè)梯度測(cè)定酶在該溫度下的相對(duì)酶活。結(jié)果表明酶適宜反應(yīng)的溫度為37℃～40℃，最適反應(yīng)溫度為37℃。將酶在上述溫度梯度下保溫2小時(shí)后測(cè)定相對(duì)酶活。結(jié)果表明酶在40℃以下比較穩(wěn)定，60℃以上失活很快，70℃失去所有的酶活。
用不同pH的緩沖液配制酶反應(yīng)體系，測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果表明酶適宜反應(yīng)的pH為5.5～6.5，最適反應(yīng)pH為5.5～6.0；酶在不同pH的緩沖液中4℃保存24小時(shí)，測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果表明酶在pH 5.5～9.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。
上述酶活測(cè)定方法為30μL適當(dāng)稀釋的純酶與150μL2mmol/L的pNPG溶液混合，于37℃反應(yīng)10分鐘，加1.05mL 0.2mol/L、pH 10.5的硼酸緩沖液終止反應(yīng)，測(cè)定OD400。
上述不同pH緩沖液分別為醋酸—醋酸鈉緩沖液pH3.5～6.0；磷酸氫二鉀—磷酸二氫鉀緩沖液pH5.5～8.0；硼酸—?dú)溲趸c緩沖液pH8.0～10.0。
(4)部分金屬離子和化合物對(duì)酶活性的影響以pNPG為底物，在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1mmol/L的各種金屬離子、10mmol/L的EDTA、DTT，測(cè)定相對(duì)酶活。結(jié)果顯示，Hg2+、Cu2+、Ag+強(qiáng)烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、DTT、EDTA對(duì)酶的活性沒(méi)有抑制作用。
實(shí)施例7B.breve ATCC 15700重組酶以蜜二糖及棉子糖為底物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)將20μL pH7.0磷酸鉀緩沖液配制的100mmol/L蜜二糖和棉子糖溶液，分別與4μL純酶于37℃反應(yīng)2小時(shí)，100℃煮沸5分鐘滅活酶液，然后進(jìn)行薄層層析(Thin-LayerChromatography，TLC)分析。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)點(diǎn)樣后，在展層劑(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展層，霧噴顯色劑(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羥基甲苯)，于120℃烘烤10分鐘，糖斑點(diǎn)顯色。如圖1、圖2，底物糖斑點(diǎn)以下生成了新的大分子寡糖斑點(diǎn)，是轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物。該酶在蜜二糖反應(yīng)體系中的主要轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為Galα(1→4)Galα(1→6)Glc，而國(guó)際上現(xiàn)有的α-半乳糖苷酶的報(bào)道中，將半乳糖基轉(zhuǎn)至蜜二糖的鍵型全部為α(1→6)鍵。
實(shí)施例8B. breve ATCC 15700重組酶廣泛的受糖體底物特異性B.breve ATCC 15700重組酶具有廣泛的受糖體底物特異性，能以pNPG為糖基供體，將半乳糖基轉(zhuǎn)移到多種糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等。
17μL 10mmol/L pH7.0磷酸鉀緩沖液配制的100mmol/L糖或醇受體溶液、3μL100mmol/L pNPG和5μL純酶，于37℃進(jìn)行反應(yīng)，在5小時(shí)取樣。同時(shí)做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，不加糖基供體pNPG，0小時(shí)、5小時(shí)取樣。然后進(jìn)行TLC分析，結(jié)果表明，pNPG為糖基供體時(shí)，原有的糖受體(醇因不能顯色除外)和水解產(chǎn)生的半乳糖斑點(diǎn)以下出現(xiàn)了新的糖斑點(diǎn)，是轉(zhuǎn)糖基生成的α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未生成新的糖斑點(diǎn)，說(shuō)明上述受體分子不能在酶的作用下發(fā)生自轉(zhuǎn)。重組酶廣泛的受糖體底物特異性，可用以合成多種α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。
序列表SEQ ID No.1<110>山東大學(xué)<120>一種轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因<141>2005-9-26<160>2<210>1<211>2226<212>DNA<213>短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700<221>短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC 15700轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因<222>(1)…(2226)<400>1atg gct ata atg gat ttc cac ggg agt tcg agc cgg ggc gaa gat ata cac gtg gtg tag 60Met Ala Ile Met Asp Phe His Gly Ser Ser Ser Arg Gly Glu Asp Ile His Val Val Tyr1 5 10 15 20gtc gag cag cgg gac gcg cgg tcc gcg ttc gct ttc gcg att gtg gat cgc gag ctg cca 120Val Glu Gln Arg Asp Ala Arg Ser Ala Phe Ala Phe Ala Ile Val Asp Arg Glu Leu Pro25 30 35 40cgc ata gtg cat tgg ggc cgg cca ctc tcc gac cca cgc aca ctc gtg gct gcg gtg gat 180Arg Ile Val His Trp Gly Arg Pro Leu Ser Asp Pro Arg Thr Leu Val Ala Ala Val Asp45 50 55 60gcg ctg cgc cca cag cgg gtg tcc ggc gcg ctc gac gag acg gcc tgg cca agc ata ctg 240Ala Leu Arg Pro Gln Arg Val Ser Gly Ala Leu Asp Glu Thr Ala Trp Pro Ser Ile Leu65 70 75 80ccc acg cag gcc gaa gct tgg acc ggc gcg cca cgc ttc gtg gtg cgc gcc ggc ggc gtg 300Pro Thr Gln Ala Glu Ala Trp Thr Gly Ala Pro Arg Phe Val Val Arg Ala Gly Gly Val85 90 95 100gag ctg ttc tgc cgc ttc acc gtg acc gat gtg cgc ata gac gat ggc ggc gct acg gtg 360Glu Leu Phe Cys Arg Phe Thr Val Thr Asp Val Arg Ile Asp Asp Gly Gly Ala Thr Val105 110 115 120agc gcc gag gac gcc gag cag ggc gtg cgc gtg ctg tgg cgg tgc gaa ctg cgg gaa agc 420Ser Ala Glu Asp Ala Glu Gln Gly Val Arg Val Leu Trp Arg Cys Glu Leu Arg Glu Ser125 130 135 140ggc ctc gtg cgc caa cgc atg tcg gtt gtg aac atg cgc gcc gag gaa ctg gaa ata ggc 480Gly Leu Val Arg Gln Arg Met Ser Val Val Asn Met Arg Ala Glu Glu Leu Glu Ile Gly
145 150 155 160acg gtg gag ctc gct ttc ccc gtg ccc gcg gac atg acc gag ata ctc acg acg acc ggc 540Thr Val Glu Leu Ala Phe Pro Val Pro Ala Asp Met Thr Glu Ile Leu Thr Thr Thr Gly165 170 175 180cac cac ctg cgc gaa cgc tcg cca cag cgc cag cca ttc acg ata ggc cgg ttc cag aag 600His His Leu Arg Glu Arg Ser Pro Gln Arg Gln Pro Phe Thr Ile Gly Arg Phe Gln Lys185 190 195 200gcg agc ctc gtg gga cgc ccc gat ttc gat tcg tcg ctg ctg ctg aac gtg ggc cgc ccc 660Ala Ser Leu Val Gly Arg Pro Asp Phe Asp Ser Ser Leu Leu Leu Asn Val Gly Arg Pro205 210 215 220ggc ttc ggt ttc acg cac ggc gac gtg tac tcc gtg cat gtg gcc tgg agc ggc aac tca 720Gly Phe Gly Phe Thr His Gly Asp Val Tyr Ser Val His Val Ala Trp Ser Gly Asn Ser225 230 235 240ctc atg gcc gcg gaa cgg ctg cca tac acc tcc ggc ctg ata ggc ggc gcg gaa gcg ctt 780Leu Met Ala Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Thr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Glu Ala Leu245 250 255 260tcc ggc ggg gaa gtg acg ttg tgt gcg gac ggg gac gat aac cgc tac acg aca cca tgg 840Ser Gly Gly Glu Val Thr Leu Cys Ala Asp Gly Asp Asp Ash Arg Tyr Thr Thr Pro Trp265 270 275 280ctg tac ggc tcg tac ggc gaa ggg ttc aac gag gtg gct tca cgc ttc cac aac gaa ctg 900Leu Tyr Gly Ser Tyr Gly Glu Gly Phe Asn Glu Val Ala Ser Arg Phe His Asn Glu Leu285 290 295 300cgc gcg acg cac gcg cag tgg cgc gcc gaa ctc ggt gtg gcc gaa aaa cca cgc ccc gtg 960Arg Ala Thr His Ala Gln Trp Arg Ala Glu Leu Gly Val Ala Glu Lys Pro Arg Pro Val305 310 315 320atc ctc aac aca tgg gag gcg gtg tag ttc cag cat gat ttc gac acg ttg aag gcg ctc1020Ile Leu Asn Thr Trp Glu Ala Val Tyr Phe Gln His Asp Phe Asp Thr Leu Lys Ala Leu325 330 335 340gcc gac aag gcc gcc gct agc ggc gtg gaa cgc ttc gtg gtg gac gac ggg tgg ttc ggc1080Ala Asp Lys Ala Ala Ala Ser Gly Val Glu Arg Phe Val Val Asp Asp Gly Trp Phe Gly345 350 355 360gcc cgg cgc gac gat acc gct ggg ctg ggc gac tgg cac ata gct cag gac gtg tgg cca1140Ala Arg Arg Asp Asp Thr Ala Gly Leu Gly Asp Trp His Ile Ala Gln Asp Val Trp Pro365 370 375 380gac ggc gac cat tca ctc aag gcg ctc gcc gac tac gtg cac gcc aaa ggc atg gag ttc1200Asp Gly Asp His Ser Leu Lys Ala Leu Ala Asp Tyr Val His Ala Lys Gly Met Glu Phe385 390 395 400ggc ttg tgg ttc gag cca gag atg gtg aat ccc gat tcg gac atg tac cga gag cac ccc1260Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asp Ser Asp Met Tyr Arg Glu His Pro405 410 415 420gac tgg gtg ctg cgc ccc acg gcg cat cgc ctg cca atg cag ggc cgc aac cag cag gtg1320
Asp Trp Val Leu Arg Pro Thr Ala His Arg Leu Pro Met Gln Gly Arg Asn Gln Gln Val425 430 435 440gtc gac ctg acg aac cca cag gcc tac ggc tag gtg tac ggc tgc atg gat gcg ctt gtg1380Val Asp Leu Thr Asn Pro Gln Ala Tyr Gly Tyr Val Tyr Gly Cys Met Asp Ala Leu Val445 450 455 460agc gaa ctc ggc ata gac tac ata aag tgg gac cac aac aaa tag gtg acc gaa gcg gtg1440Ser Glu Leu Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Trp Asp His Asn Lys Tyr Val Thr Glu Ala Val465 470 475 480tcg cca cgc acc ggc cga cca gcc gtg cat ggg cag aca ctc gcc gtg tac cgc ata ttc1500Ser Pro Arg Thr Gly Arg Pro Ala Val His Gly Gln Thr Leu Ala Val Tyr Arg Ile Phe485 490 495 500cgc gac ctc aaa acc gcg cac ccc ggc ctg gag ata gaa agc tgc tcg tcc ggc ggc ggc1560Arg Asp Leu Lys Thr Ala His Pro Gly Leu Glu Ile Glu Ser Cys Ser Ser Gly Gly Gly505 510 515 520cgc gtg gac ctc gcg ata ctc tcg ctc gcc gac cgc ata tgg gcg tcg gat tgc gtg gat1620Arg Val Asp Leu Ala Ile Leu Ser Leu Ala Asp Arg Ile Trp Ala Ser Asp Cys Val Asp525 530 535 540ccg gtg gaa cgc gcg gac ata cag cgc tac acg tcg ctt ctc gtg cca cca gag atg ata1680Pro Val Glu Arg Ala Asp Ile Gln Arg Tyr Thr Ser Leu Leu Val Pro Pro Glu Met Ile545 550 555 560ggc gaa cat gtg ggc gcg agc ccc gcg cat tcc acc cac cgg gcg acg agc cag cag atg1740Gly Glu His Val Gly Ala Ser Pro Ala His Ser Thr His Arg Ala Thr Ser Gln Gln Met565 570 575 580cgc atg gcg atg gcg ttc ttc ggg cat ctg ggc ata gaa tgg aac ctg ctc aag gaa cca1800Arg Met Ala Met Ala Phe Phe Gly His Leu Gly Ile Glu Trp Asn Leu Leu Lys Glu Pro585 590 595 600cag tcg gcg ctc gac gaa ctc ggt gtg tgg gtg gac gcg tac aag cgg cac cgc gcg gac1860Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Gly Val Trp Val Asp Ala Tyr Lys Arg His Arg Ala Asp605 610 615 620ttc gcg cac ggc acc gtg gtg cac ggc gat gcg gcc gat ccc gcg gtg cgc gtg gat ggc1920Phe Ala His Gly Thr Val Val His Gly Asp Ala Ala Asp Pro Ala Val Arg Val Asp Gly625 630 635 640gtc gtg agc gcc agc ggc gaa cgc gcc gtg tac cgc ttc acg caa ttg acg aca tcg cag1980Val Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Ala Val Tyr Arg Phe Thr Gln Leu Thr Thr Ser Gln645 650 655 660acc tac cca gcg gct cca gtg cgc ctg cca gga ctc gcc cca gac gcc gac tag ctg ata2040Thr Tyr Pro Ala Ala Pro Val Arg Leu Pro Gly Leu Ala Pro Asp Ala Asp Tyr Leu Ile665 670 675 680cag cca ctc gct tgc aat ctc gcc agc ggc gag cca ttc aca caa ata ggt aac ggg cag2100Gln Pro Leu Ala Cys Asn Leu Ala Ser Gly Glu Pro Phe Thr Gln Ile Gly Asn Gly Gln685 690 695 700
agc gaa ctc ggc tgg tgg aac agc caa ggc gtg gtg atg aac ggc ggt gcg ctc gac gcg2160Ser Glu Leu Gly Trp Trp Asn Ser Gln Gly Val Val Met Asn Gly Gly Ala Leu Asp Ala705 710 715 720ttc ggc ttg cgc cca cca tgc ata cac cca gcg aac gcc gtg ctg ttc agc gcc acg cgc2220Phe Gly Leu Arg Pro Pro Cys Ile His Pro Ala Asn Ala Val Leu Phe Ser Ala Thr Arg725 730 735 740gtg tga2280Val741SEQ ID No.2<210>2<211>457<212>DNA<221>B.breve ATCC 15700α-半乳糖苷酶基因高保守DNA片段<222>(1)…(457)<400>2gattatccca ctttatgtag tctatgccga gttcgctcac aagcgcatcc atgcagccgt 60acacctagcc gtaggcctgt gggttcgtca ggtcgaccac ctgctggttg cggccctgca 120ttggcaggcg atgcgccgtg gggcgcagca cccagtcggg gtgctctcgg tacatgtccg 180aatcgggatt caccatctct ggctcgaacc acaagccgaa ctccatgcct ttggcgtgca 240cgtagtcggc gagcgccttg agtgaatggt cgccgtctgg ccacacgtcc tgagctatgt 300gccagtcgcc cagcccagcg gtatcgtcgc gccgggcgcc gaaccacccg tcgtccacca 360cgaagcgttc cacgccgcta gcggcggcct tgtcggcgag cgccttcaac gtgtcgaaat 420catgctggaa ctacaccgcc tcccatgtgt tcaaatc 480
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因，具有如下特征(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全長(zhǎng)2226堿基；(2)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，具有不同于SEQ ID No.1所示核苷酸序列但與SEQID No.1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；(3)該基因編碼741個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，將所述基因克隆到pET-22b質(zhì)粒表達(dá)載體上，在大腸桿菌中表達(dá)重組α-半乳糖苷酶；其中上述基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組酶為雙亞基蛋白，聚合體分子量約為160kD，單亞基分子量約為80kD；酶對(duì)對(duì)硝基苯酚α-D-半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)的Km為0.17mmol/L，Vmax為4.43μmol/(L·min)，對(duì)蜜二糖和棉子糖的Km值分別為0.66mmol/L，2.20mmol/L，Vmax分別為0.58μmol/(L·min)，0.65μmol/(L·min)；酶對(duì)pNPG適宜反應(yīng)的溫度為37℃～40℃，適宜反應(yīng)的pH為5.5～6.5；酶于4℃保存時(shí)，在pH5.5～9.5范圍內(nèi)至少穩(wěn)定保存24小時(shí)；Hg2+、Cu2+、Ag+強(qiáng)烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、DTT、EDTA對(duì)酶活性沒(méi)有抑制；酶在水解蜜二糖或棉子糖的反應(yīng)體系中具有轉(zhuǎn)糖基活性，反應(yīng)中有轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物生成，其中，酶在蜜二糖反應(yīng)體系中的主要轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為Galα(1→4)Galα(1→6)Glc；酶在以pNPG為糖基供體時(shí)，能將半乳糖基轉(zhuǎn)移到多種糖、醇化合物上。
3.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，所述酶對(duì)pNPG的最適反應(yīng)溫度為37℃。
4.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，所述酶對(duì)pNPG的最適反應(yīng)pH為5.5～6.0。
5.如權(quán)利要求2或4所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，在所述pH5.5～9.5的緩沖范圍中，pH5.5～8.0范圍使用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，pH8.0～10.0范圍使用硼酸-氫氧化鈉緩沖液。
6.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，所述糖、醇化合物是半乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇。
7.如權(quán)利要求2或6所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，所述酶具有廣泛的受糖體底物特異性，酶將半乳糖基轉(zhuǎn)移到所述糖、醇化合物上，可用以合成多種α-半乳糖基寡糖及糖綴合物。
8.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶基因的應(yīng)用，其特征是，將所述基因克隆到pET-22b質(zhì)粒表達(dá)載體上，可用于基因改造，即對(duì)酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，在酶催化中心用非親核氨基酸殘基取代親核催化氨基酸殘基，以獲得α-半乳糖苷合成酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)糖基α－半乳糖苷酶基因，所述基因由短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)基因組DNA借助PCR擴(kuò)增獲得高保守DNA片段，然后進(jìn)行Southern雜交獲得。該基因核苷酸序列全長(zhǎng)2226堿基，編碼741個(gè)氨基酸。由該基因表達(dá)的重組酶特征為酶為雙亞基蛋白，聚合體分子量約為160kD，單亞基分子量約為80kD；酶對(duì)對(duì)硝基苯酚α－D－半乳糖苷的K
文檔編號(hào)C12N9/38GK1778928SQ200510044898
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者肖敏, 趙晗, 王勤鵬, 王鵬 申請(qǐng)人:山東大學(xué)