一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體及其制備方法和應用。本發(fā)明以來源于Penicillium?sp.的酸性多聚半乳糖醛酸酶為母本，采用分子生物學技術對酸性多聚半乳糖醛酸酶序列進行區(qū)域替換后表達。在此改造條件下，酸性多聚半乳糖醛酸酶比活性比野生型（突變前）的比活性提高11.1倍；催化效率比野生型（突變前）提高33.5倍，并且最適反應pH值不變。利用此策略可以大大提高多聚半乳糖醛酸酶的催化效率，為其在食品、果蔬加工等工業(yè)生產(chǎn)領域提供了基礎。此策略對多聚半乳糖醛酸酶及其它酶的催化效率提高具有重要的指導意義。
【專利說明】一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]果膠是一類帶負電荷的高分子多糖，由不同酯化度的D-(+)_-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵連接而成的多糖鏈，常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等組成的側鏈，分子量介于25~360kDa之間(Jayani et al.，2005)。它廣泛存在于高等植物，特別是水果和蔬菜的組織中，是果蔬植物細胞中膠層(胞間層)的主要成分。
[0003]內切多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)屬于糖苷水解酶第28家族(GH28)，作用于果膠酸時能隨機地從多聚半乳糖醛酸鏈內部消解α-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生聚合度為10~14的寡聚半乳糖醛酸。它是一種降解果膠的重要工業(yè)用酶，主要應用在食品工業(yè)中的果蔬汁生產(chǎn)加工領域。果蔬汁的混濁和粘度大等問題主要是由果膠質引起的，在果蔬汁的提取和澄清過程通過酸性果膠酶處理可提高果蔬汁的出汁率和澄清度(Nakkeeran etal., 2011;Rehman et al.，2013)。
[0004]我國果蔬汁生產(chǎn)規(guī)模逐年擴大，目前在商品化的果膠酶主要有黑曲霉等真菌來源的復合果膠酶酶系，也有單一的果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酯酶酶種。從質量上看，現(xiàn)有果膠酶還普遍存在酶活力不高，穩(wěn)定性較差的問題。高比活、高催化效率的多聚半乳糖醛酸酶工程菌株的獲得主要通過誘變、篩選和酶分子改良獲得。誘變分為自然突變和人工誘變，自然突變成功的幾率非常小，人工誘變的工作量較大且有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質難以控制。篩選的盲目 性較大，不容易獲得目的菌株。酶分子改良目的性強，針對酶分子具體結構分析進行改造，從而達到提高比活力和催化效率的目的。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供了一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體。
[0006]本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的基因。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009]本發(fā)明以來源于Penicillium sp.的酸性多聚半乳糖醒酸酶為母本,采用分子生物學技術對酸性多聚半乳糖醛酸酶序列進行區(qū)域替換后表達。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體，是多聚半乳糖醛酸酶的催化活性通道loop區(qū)域替換后得到的突變體，即多聚半乳糖醛酸酶的loop區(qū)域氨基酸序列由“RNGDKGSL” 突變?yōu)?“SAGDSQG”
[0011]所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]SPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGTNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNSAGDSQGGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC
[0013]所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0014]TCTCCAGCTGCCGAACCGGCTGAAGGGAACAGACTCATCCCTCGTGGATCTGCTTGCACCTATTCAGGAGTCAATGGTGCAGCTGCAGCGATAGCCGGAAAGGCAGGTTGCTCCAGTATTACTCTCAATAACGTTGCAGTGCCTGCCGGGACTACGCTGGATTTGACTGGTCTGGCCGCGGGTACCAAGGTGATATTTGAGGGAACCACTACTTTCGGCCATAAGCAGTGGGTGGGCCCTCTGATCTCCATCTCTGGGACCAACATCGCAGTTTCTGGGGCTGCCGGTCACGTCATTGATGGCCAAGGTGCCCGCTGGTGGGATGGAAAGGGTTCCAACACCAAGACCAATATCAAACCTAAGTTCTTCCTCGCCCACAATCTCAAGGGAGCCTCCACTATTACGGGGTTGAACATCAAGGATACTCCCGTTCAGGTCTTCAGCATCGATAGCTCGTCGGGTCTGACGATCAGTGGTGTCACAATTGACAACTCGGCCGGCGACTCCCAGGGCGGTCACAACACCGACGGGTTCGATATCGGCGACAGTGATCACATTACCATCACTGGTGCTACAGTTTATAACCAAGACGACTGCCTGGCCATCAATTCTGGGACGAACATTATTTTCTCCGGCGGTTACTGCTCTGGTGGGCACGGATTGTCTATCGGCTCAGTCGGTGGCCGTTCCAATAATGTGGTAGACACCGTCCATATCAGCAGCACCCAGGTCGTCAACTCTCAGAATGGTGTCCGTGTCAAAGCTGTCGCTGGCGCCACCGGTAGTATCAAAGGCGTGACTTACCAGGATATTACCCTCTCCGGCATTACGAGCCAGGGAGTCACCATCCGCCAAGACTACACCAATTCTGGCTACACTGGAAACCCCACGACCCAGGTTCCAATCACTGGACTCACCTTGAATAATGTGCACGGCACGGTCACATCCAGTGGCACCGATATCACCGTCGAGTGTGGAAGTGCTGCCAGTTGTTCAGGCTGGACTTGGACTAAAGTTGCAGTCAGTGGCGGCAAGGCGGATTTGTGCAAGAATGCACCTGCCAACACTTGC
[0015]本發(fā)明還是提供一種制備高催化效率多聚半乳糖醛酸酶的方法:
[0016]I)采用over-lap PCR的方法擴增高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因序列；
[0017]2)將催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體序列片段克隆到表達載體pPIC9r上，重組載體命名pPIC9r-PG63X ；
[0018]3)將突變體重組載體轉化畢赤酵母GSl 15，誘導表達，獲得突變株，優(yōu)選為GSl 15/PG63X。
[0019]本發(fā)明還提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組載體，優(yōu)選為pPIC9r-PG63X。將本發(fā)明的多聚半乳糖醛酸酶突變體基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將多聚半乳糖醛酸酶基因插入到質粒pPIC9r上的SnaB I和Not I限制性酶切位點之間，得到重組表達質粒pPIC9r-PG63X。
[0020]本發(fā)明還提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株GS115/PG63X。
[0021]本發(fā)明還提供了上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的應用，例如在果蔬汁工業(yè)中的應用。
[0022]本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、適合于在食品工業(yè)中應用新的多聚半乳糖醛酸酶。本發(fā)明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體最適PH為3.5，與野生型的一致，但是比活力比野生型提高11.1倍；催化效率比野生型提高33.5倍。最適pH值都與蘋果汁天然pH值3.5—致且在低溫范圍內都能保持穩(wěn)定的活性，單酶應用試驗結果表明它性質優(yōu)良，與一定量的果膠裂解酶協(xié)同效果能達到商業(yè)復合酶的水平。這樣一種在酸性PH環(huán)境和中低溫范圍內保持穩(wěn)定并具有高酶活的多聚半乳糖醛酸酶被認為是果蔬汁生產(chǎn)行業(yè)中性質優(yōu)良的工業(yè)用酶，有著非常廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:在畢赤酵母中表達的重組高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白質Marker ；1:純化的酶液。
[0024]圖2:高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體與野生型的最適pH。
[0025]圖3:高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體與野生型的最適溫度。
[0026]圖4:高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體與野生型的動力學曲線。
【具體實施方式】
[0027]試驗材料和試劑
[0028]1、菌株及載體:表達宿主Pichia pastoris GS115，表達質粒載體pPIC9r為本實
驗室保存。
[0029]2、酶類及其它生化試劑:內切酶購自Fermentas公司，連接酶購自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸購自Sigma公司。其它都為國產(chǎn)分析純試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
[0030]3、培養(yǎng)基:
[0031](I)LB培養(yǎng)基:0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，l%NaCl，ρΗ7.0
[0032]⑵YPD培養(yǎng)基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖
[0033](3)MD 固體培養(yǎng)基:2% 葡萄糖，1.5% 瓊脂糖，1.34%ΥΝΒ, 0.00004%Biotin
[0034](4)MM 固體培養(yǎng)基:1.5% 瓊脂糖，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 0.5% 甲醇
[0035](5) BMGY培養(yǎng)基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油(V/V)，1.34%YNB，0.00004%Biotin
[0036](6)BMMY培養(yǎng)基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 0.5% 甲醇(V/V)
[0037]實施例1高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體編碼基因PG63X的克隆
[0038]本發(fā)明以來源于PeniciIIium sp.的酸性多聚半乳糖醛酸酶(其氨基酸序列如SEQID N0.3)為母本，采用分子生物學技術對酸性多聚半乳糖醛酸酶序列進行區(qū)域替換后表達。
[0039]SEQ ID N0.3 如下所示:
[0040]SPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGTNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNRNGDKGSLGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC
[0041]以Penicillium sp.基因組DNA為模板，在多聚半乳糖醛酸酶的催化活性通道loop區(qū)域處設計區(qū)域替換引物，采用over-lap PCR的方法擴增高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體編碼基因PG63X。
[0042]表1.高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體PG63X特異性引物
[0043]
【權利要求】
1.一種高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體，其特征在于，所述多聚半乳糖醛酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因，其特征在于，編碼權利要求1所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體。
3.根據(jù)權利要求2所述的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.包含權利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組載體。
5.包含權利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組載體pPIC9r-PG63X。
6.包含權利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組菌株。
7.包含權利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組菌株GSl15/PG63X。
8.一種制備高催化效率多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步驟: 1)用權利要求4所述重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組多聚半乳糖醛酸酶的表達； 3)回收并純化所表達的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶。
9.權利要求1所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突變體的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK103525788SQ201310520015
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權日:2013年10月29日
【發(fā)明者】姚斌, 孟昆, 涂濤, 羅會穎, 石鵬君, 黃火清, 王亞茹, 柏映國, 楊培龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所