絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其應(yīng)用，其序列為SEQIDNO.1。該調(diào)控因子的表達(dá)量與絲素蛋白重鏈及繭層量成正相關(guān)，且參與了絲素重鏈基因的表達(dá)調(diào)控，對于家蠶絲腺的理論研究和提高繭絲合成量的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用具有一定的價值。
【專利說明】絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]絲腺是家蠶唯一能生產(chǎn)繭絲的器官，是整個蠶絲業(yè)的生物學(xué)基礎(chǔ)，一頭家蠶一般經(jīng)過25d左右的生長發(fā)育，在幼蟲期食下鮮桑葉約22g，合成并分泌0.5~Ig的絲蛋白，特別是在5齡中、后期，家蠶能夠以驚人的效率將桑葉蛋白轉(zhuǎn)變成絲蛋白。它合成蛋白質(zhì)的能力和效率，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有生物組織器官中最強(qiáng)最高的一種。根據(jù)合成蛋白質(zhì)的初步推測，這種高效率的蛋白質(zhì)合成，不但需要眾多基因的相互協(xié)調(diào)，而且基因的表達(dá)，大多數(shù)都具有高度的組織和時期特異性。家蠶只在其5齡中期后期，絲膠基因于中部絲腺大量表達(dá)合成絲膠蛋白，絲素基因(Fib-H，F(xiàn)ib-L，P25)在后部絲腺特異表達(dá)合成表達(dá)絲素蛋白。絲素蛋白主要由絲素重鏈蛋白(Fib-H)、絲素輕鏈蛋白(Fib-L)及P25蛋白以分子量6:6:1的比例組成。其中，F(xiàn)ib-H的含量高達(dá)70%以上，是絲蛋白的主要成分。家蠶繭絲合成量的多少及繭絲性能與Fib-H的表達(dá)量及蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，從野蠶馴化來的家蠶繭與現(xiàn)在的野蠶繭相比，其繭重比野蠶的要重10-20倍；而絲素重鏈基因的表達(dá)也相差上100倍以上。因此，提高絲素重鏈基因的表達(dá)有望提高繭的重量。研究發(fā)現(xiàn)，絲蛋白基因的特異表達(dá)是受絲腺組織一些特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控，同時一些泛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子也協(xié)作參與這一過程。根據(jù)絲腺中與蠶絲基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的特性、將蠶絲基因表達(dá)調(diào)節(jié)中的轉(zhuǎn)錄因子分為兩類，一種是組織特異因子，如SGF-1、SGF-2、SGF-B和PSGF。另一種是泛在的共同因子，包括SGF-3、SGF -4、TR10、UB2a、UB2b及BMFA、FBF-Al。因此，如何獲得絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的顯得特別重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供的絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其特征在于具有SEQIDN0.1的核苷酸序列或者與SEQIDN0.1具有99%以上同源性的核苷酸序列。
[0005]本發(fā)明另一方面還涉及絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)蛋白，其特征在于含有SEQIDN0.2的氨基酸序列.[0006]本發(fā)明另一方面涉及上述絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在增加絲素重鏈基因的表達(dá)中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明另一方面還涉及上述絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在作為提高家蠶繭絲量的合成的靶標(biāo)基因中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1:pET-28a/Bmsage載體構(gòu)建及原核表達(dá)純化[0009]圖2:pGEX-4T-l/Bmsage載體構(gòu)建及原核表達(dá)純化
[0010]圖3:Bmsage 與 SGF-1 相互結(jié)合
[0011]圖4 =Bmsage與SGF-1復(fù)合物結(jié)合于Fib-H啟動子的A和B位點(diǎn)并調(diào)控絲素重鏈基因的表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不限于此。
[0013]實(shí)施例1
[0014]設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，引物序列為，
[0015]F: 5 ’ -CGCGGATCCATGTACAATCAAACATAC-3，，
[0016]R:5’ -CCCAAGCTTAGTATCTCTGTTGACGC-3’，兩端分別包括酶切位點(diǎn) BamHI 和HindIII。以家蠶5齡3天絲腺cDNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pMD-19-Tsimple(Takara)載體上，得到pMD-Bmsage載體，序列測定表明，擴(kuò)增的片段為編碼這個基因的全長cDNA序列，其編碼序列為SEQIDN0.1。
[0017]為了分離純化Bmsage蛋白及制備多克隆抗體,構(gòu)建Bmsage的重組蛋白表達(dá)載體。pMD-Bmsage質(zhì)粒經(jīng)BamHI/Hindlll酶切克隆進(jìn)pET28a載體中，得到pET_28a/Bmsage載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37°C下經(jīng)0.2mMIPTG.誘導(dǎo)表達(dá)獲得以包涵體形式存在的重組蛋白，經(jīng)Ni柱分離純化獲得重組蛋白，重組蛋白用于抗體制備(圖1)。為了獲得可溶的Bmsage蛋白，構(gòu)建帶GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1/Bmsage載體，酶切位點(diǎn)為BamHI/Notl，16°C下經(jīng)0.2mMIPTG.誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可溶的Bmsage蛋白。經(jīng)GST柱親和純化,獲得較純的可溶的Bmsage融合蛋白(分子量約55KDa)，用于后期蛋白相互作用和蛋白與DNA探針的結(jié)合實(shí)驗(yàn)(圖2)。
[0018]Bmsage與SGF-1相互結(jié)合實(shí)驗(yàn)
[0019]在果蜆唾液腺中，果蜆的Sage蛋白能與Forkead轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合調(diào)控分泌蛋白的轉(zhuǎn)錄。家蠶的絲腺與果蠅的唾液腺是同源器官，家蠶絲腺也有一個具有forkead的轉(zhuǎn)錄因子SGF-1,而且,它是家蠶絲膠I基因和幾個絲素基因重要的調(diào)控因子。為了證明Bmsage能與SGF-1結(jié)合，進(jìn)行了蛋白與蛋白相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，這兩種蛋白能相互結(jié)合(圖 3)。
[0020]Bmsage與SGF-1通過絲素重鏈基因的A和B位點(diǎn)參與絲素重鏈基因的調(diào)控
[0021]由于SGF-1已經(jīng)被證明能結(jié)合到絲素重鏈基因的A和B參與調(diào)控,而Bmsage能否結(jié)合到同一位點(diǎn)參與調(diào)控呢？為了證明這一點(diǎn)，進(jìn)行了 Bmsage與A、B位點(diǎn)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。通過EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Bmsage不能與A、B位點(diǎn)的結(jié)合。這就表明，Bmsage是與SGF-1結(jié)合,而SGF-1結(jié)合到A和B位點(diǎn)(圖4A-C)。為了證明Bmsage參與了絲素重鏈基因的調(diào)控，構(gòu)建了在細(xì)胞水平表達(dá)Bmsage的載體和以Fib-H上游1000bp為啟動子的表達(dá)熒光素酶的載體。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞水平表達(dá)Bmsage蛋白能提高熒光素酶的表達(dá)活性(圖4D)。
[0022]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子Bmsage能夠上調(diào)表達(dá)絲素重鏈基因的，該轉(zhuǎn)錄因子在絲腺中特異表達(dá)，可以作為提高絲蛋白合成和繭絲量的基因。
[0023]上述實(shí)施方式旨在舉例說明本發(fā)明可為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)或使用，對上述實(shí)施方式進(jìn)行修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù) 人員來說將是顯而易見的，故本發(fā)明包括但不限于上述實(shí)施方式，任何符合本權(quán)利要求書或說明書描述，符合與本文所公開的原理和新穎性、
【權(quán)利要求】
1.絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其特征在于具有SEQIDN0.1的核苷酸序列或者與SEQIDN0.1具有99%以上同源性的核苷酸序列。
2.絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)蛋白，其特征在于含有SEQIDN0.2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在增加絲素重鏈基因的表達(dá)中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在作為提高家蠶繭絲量的合成的靶標(biāo)基因中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/12GK103805608SQ201410060356
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】劉春 , 趙小明, 夏慶友, 趙萍 申請人:西南大學(xué)