促進肺癌細胞凋亡的組合藥物、藥物制劑以及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種促進肺癌細胞凋亡的組合藥物、藥物制劑以及檢測方法，所述方法包括：采用促進肺癌細胞凋亡的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，同時采用所述組合藥物中的兩種組分分別對所述肺癌細胞進行處理，與未處理的肺癌細胞組成四組對比樣品，所述組合藥物由3-[2,4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5,6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖兩種組分組成；針對所述四組對比樣品，進行預(yù)處理；對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行流式細胞儀檢測，并比對流式細胞儀的檢測結(jié)果；對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行凋亡蛋白表達的檢測，并比凋亡蛋白表達的檢測結(jié)果。
【專利說明】促進肺癌細胞凋亡的組合藥物、藥物制劑以及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療和醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種促進肺癌細胞凋亡的組合藥物，一種促進肺癌細胞凋亡的藥物制劑以及一種肺癌細胞凋亡的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，惡性腫瘤是危害人類生命健康的細胞性疾病，腫瘤細胞從生物體內(nèi)正常細胞轉(zhuǎn)化為惡性細胞，其形態(tài)、功能、代謝和增殖等都會發(fā)生深刻變化，可以看作是細胞的異常分化導致的其具有永生性。
[0003]絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管粘膜上皮，近年來，隨著吸煙和各種環(huán)境因素的影響，肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增長其死亡率已占癌癥死亡率之首，世界各國特別是工業(yè)發(fā)達國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。在治療肺癌的方向上，如何促進肺癌細胞的凋亡，就成為腫瘤治療中一個關(guān)鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的促進肺癌細胞凋亡的機制。
[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種促進肺癌細胞凋亡的組合藥物，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4_雙((3S)_3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成。
[0006]優(yōu)選地，所述組合藥物中所述3_[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-`甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
[0007]本發(fā)明還公開了一種促進肺癌細胞凋亡的藥物制劑，以促進肺癌細胞凋亡的組合藥物作為活性成分，并輔以可接受的要用載體；
[0008]所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549 ；
[0009]所述組合藥物由3- [2，4-雙((3S) _3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成。
[0010]優(yōu)選地，所述組合藥物中所述3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
[0011]優(yōu)選地，所述制劑為口服液、膠丸、口服混懸液、固體分散體、膠囊、緩釋劑、顆粒劑、片劑、注射劑、軟膏、貼劑或植入劑。
[0012]本發(fā)明還公開了一種肺癌細胞凋亡的檢測方法，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549,所述方法包括:
[0013]采用促進肺癌細胞凋亡的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，同時采用所述組合藥物中的兩種組分分別對所述肺癌細胞進行處理，與未處理的肺癌細胞組成四組對比樣品，所述組合藥物由3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖兩種組分組成；[0014]針對所述四組對比樣品，進行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括:采用胰酶消化所述肺癌細胞，并采用含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止對肺癌細胞的消化，將終止消化后的肺癌細胞進行離心，棄除上清液；
[0015]對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行流式細胞儀檢測，并比對流式細胞儀的檢測結(jié)果;
[0016]對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行凋亡蛋白表達的檢測，并比凋亡蛋白表達的檢測結(jié)果。
[0017]優(yōu)選地，所述組合藥物中所述3_[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
[0018]優(yōu)選地，對進行一次處理后的四組樣品分別進行流式細胞儀檢測的步驟包括:
[0019]采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞并轉(zhuǎn)入無菌的離心管中；
[0020]進行細胞計數(shù)，提取預(yù)設(shè)個數(shù)的肺癌細胞細胞，離心并棄除上清液；
[0021]采用磷脂結(jié)合蛋白與異硫氰酸熒光素的結(jié)合液重懸細胞，再加入所述結(jié)合液混勻，在室溫下避光孵育后離心并棄除上清液；
[0022]再次加入所述結(jié)合液重懸細胞，加入碘化丙啶染色液混勻，冰浴避光放置后，進行流式細胞儀檢測；
[0023]對進行一次處理后的 四組樣品分別進行凋亡相關(guān)蛋白的表達的步驟包括:
[0024]收集細胞沉淀，并提取蛋白；
[0025]采用蛋白質(zhì)印跡法檢測所述四組樣品凋亡相關(guān)蛋白的表達。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明包括以下優(yōu)點:
[0027]依據(jù)本發(fā)明實施例，采用3-[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成的組合藥物作用于選自非小細胞肺癌細胞株A549的肺癌細胞，通過實驗驗證，本發(fā)明創(chuàng)新提出的組合藥物可以明顯促進肺癌細胞的凋亡。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是本發(fā)明的一種肺癌細胞凋亡的檢測實施例的流程圖；
[0029]圖2是本發(fā)明的一個示例中四組樣品的流式細胞儀檢測結(jié)果的對比圖；
[0030]圖3是本發(fā)明的一個示例中四組樣品的凋亡蛋白表達的檢測結(jié)果的對比圖。
【具體實施方式】
[0031]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0032]細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。在治療肺癌的方向上，如何促進肺癌細胞的凋亡，就成為腫瘤治療中一個關(guān)鍵問題。
[0033]本發(fā)明提供了一種促進肺癌細胞凋亡的組合藥物，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成。
[0034]A549細胞系是由D.J.Griad通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系，患者為58歲白人男性。A549能通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。24%的細胞是亞三倍體細胞，含有66條染色體，并且，產(chǎn)生64、65、67條染色體細胞的頻率也很高，大部分細胞都具有2條X和2條Y染色體。
[0035]其中，3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5, 6-e]嘧啶_7_基]-N-甲基苯甲酰胺即AZD2014,是mTOR (ammalian target of rapamycin,哺乳動物雷帕霉素革巴蛋白)的復合體 mTORCl (ammalian target of rapamycin complexl)和 mT0RC2 (ammaliantarget of rapamycin complex2)的雙重抑制劑,具有潛在的抗腫瘤活性胺。2-DG即2_脫氧-D-葡萄糖，是葡萄糖類似物，能夠短時間一直糖酵解作用。
[0036]與一些mTOR抑制劑相比，AZD2014更有效抑制mTORCl:AZD2014降低P4EBPlThr37/46,抑制翻譯起始復合體，和降低全部蛋白合成。AZD2014也抑制mT0RC2生物標記pAKTSer473和pNDRGlThr346。AZD2014作用于多種腫瘤細胞系，具有廣譜抗增殖活性。
[0037]2_脫氧-D-匍萄糖(2-Dexoy-D-Glucose，2-DG)為天然抗代謝物類抗生素，具有具有能夠抑制病毒感染、酵母發(fā)酵、致病菌及腫瘤細胞生長等多種生理藥理效應(yīng)。具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗癲癇等作用，用于預(yù)防病毒及病原菌感染等。
[0038]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選地，所述組合藥物中所述3- [2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
`[0039]相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種促進肺癌細胞凋亡的藥物制劑，以促進肺癌細胞凋亡的組合藥物作為活性成分，并輔以可接受的要用載體。
[0040]其中，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成。
[0041]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選地，所述組合藥物中所述3_[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
[0042]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選地，所述制劑可以為口服液、膠丸、口服混懸液、固體分散體、膠囊、緩釋劑、顆粒劑、片劑、注射劑、軟膏、貼劑或植人劑之中的任意一種。
[0043]相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種肺癌細胞凋亡的檢測方法，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549,所述方法包括:
[0044]步驟101、采用促進肺癌細胞凋亡的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，同時采用所述組合藥物中的兩種組分分別對所述肺癌細胞進行處理，與未處理的肺癌細胞組成四組對比樣品，所述組合藥物由3-[2，4_雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖兩種組分組成。
[0045]本發(fā)明實施例中，采用組合藥物處理肺癌細胞，并對肺癌細胞的凋亡進行檢測，驗證組合藥物的效果，可以將未處理的肺癌細胞與單一藥物組分處理的肺癌細胞，以及組合藥物共同處理的肺癌細胞作為四組樣品，以對比不同情況下對肺癌細胞凋亡的促進作用。
[0046]在具體的處理時，可以選用指數(shù)生長期的A549細胞，然后種板，在細胞貼壁后采用藥物處理，例如可以種6孔板，細胞密度約為70%，在細胞貼壁后，分別用這兩種藥物單獨處理及聯(lián)合處理A549細胞。
[0047]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選地，所述組合藥物中所述3_[2，4-雙((3S)-3_甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
[0048]步驟102、針對所述四組對比樣品，進行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括:采用胰酶消化所述肺癌細胞，并采用含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止對細胞的消化，將終止消化后的細胞進行離心，棄除上清液。
[0049]得到四組不同的樣品后，首先進行預(yù)處理，包括采用胰酶消化細胞，并進一步采用含有胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基終止對細胞的消化，終止消化后離心，棄除上清液，得到下層的細胞。
[0050]步驟103、對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行流式細胞儀檢測，并比對流式細胞儀的檢測結(jié)果。
[0051]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選地，步驟103可以包括:
[0052]子步驟S11、采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞并轉(zhuǎn)入無菌的離心管中。
[0053]子步驟S12、進行細胞計數(shù)，提取預(yù)設(shè)個數(shù)的肺癌細胞，離心并棄除上清液。
[0054]子步驟S13、采用磷脂結(jié)合蛋白與異硫氰酸熒光素的結(jié)合液重懸細胞，再加入所述結(jié)合液混勻，在室溫下避光孵育后離心并棄除上清液。
[0055]子步驟S14、再次加入所述結(jié)合液重懸細胞，加入碘化丙啶染色液混勻，冰浴避光放置后，進行流式細胞儀檢測。
[0056]流式細胞儀可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。
[0057]Annexin V (磷脂結(jié)合蛋白)是一種檢測細胞凋亡的試劑，在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合，因此Annexin V是檢測細胞早期調(diào)亡的靈敏指標。
[0058]將Annexin V 進行綠色突光 FITC (fluorescein isothiocyanate,異硫氰酸突光素)標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙唳(Propidium 1dide, PI)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜在嵌入細胞核的雙鏈DNA后釋放紅色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
[0059]本發(fā)明采用FITC標記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。具體的，首先將用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕重懸細胞，并轉(zhuǎn)移無菌的EP管中，并進行細胞計數(shù)，取約預(yù)設(shè)個數(shù)的(例如10萬)重懸的細胞，然后進行離心，棄上清，加入Annexin V-FITC輕輕重懸細胞,然后再次加入Annexin V-FITC,輕輕混勻。在室溫(20-25°C)避光孵育，然后再次離心，棄上清，再次加入Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。最后加入碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置后即可進行流式細胞儀檢測，針對四組樣品分別進行檢測，并將檢測的結(jié)果進行比對以驗證組合藥物對肺癌細胞凋亡的影響。
[0060]步驟104、對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行凋亡蛋白表達的檢測，并比凋亡蛋白表達的檢測結(jié)果。
[0061]細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在遺傳機制的控制自動結(jié)束生命的過程。細胞凋亡的過程大致可分為四個階段:
[0062](I)凋亡信號轉(zhuǎn)導
[0063]當細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素與被作用的細胞受體結(jié)合后，細胞產(chǎn)生復雜的生化反應(yīng)，并形成與凋亡有關(guān)的第二信使:cAMP、Ca2+、神經(jīng)酰胺等信號分子形成死亡信號。
[0064](2)凋亡基因激活
[0065]調(diào)控的凋亡基因在接受死亡信號后 ，開始按預(yù)定程序啟動，并合成執(zhí)行凋亡所需的各種酶和相關(guān)物質(zhì)。
[0066](3)凋亡的執(zhí)行(共同通路)
[0067]凋亡的主要執(zhí)行者有兩類酶:核酸內(nèi)切酶(endogenous nuclease Dnase) 一徹底破壞細胞的生物命令系統(tǒng)；CaSpaSeS3—細胞的結(jié)構(gòu)全面解體。
[0068](4)凋亡細胞的清除
[0069]凋亡的調(diào)節(jié)包括一系列復雜的級聯(lián)反應(yīng)，目前研究的最多的caspase (含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依賴的通路主要有兩條:其中一條是細胞外死亡信號激活，死亡信號通過細胞外死亡配體與膜上相應(yīng)的死亡受體結(jié)合傳遞到細胞內(nèi)部，細胞內(nèi)的caspase-2, _8、-10被募集并激活；另一條通路則由細胞內(nèi)應(yīng)急信號激活，它主要由線粒體中的細胞色素C介導，導致caspase-9的激活。一些多肽通過激活受體(如Fas，TNFRl,DR3 / ffsl-1)而直接誘導細胞凋亡。這些多肽屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，它們與相應(yīng)的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員結(jié)合，從而在許多的細胞類型中誘導凋亡。其激活途徑為:配體與受體結(jié)合后，導致受體的三聚體化(trimerization)。使得受體的胞楽:部分與接頭蛋白(adapter protein) Fas-相關(guān)死亡蛋白(fas-associated protein withdeath domain, FADD)和 procaspase-8 結(jié)合，procaspase-8 本身具有成熟的 caspase-8酶的I % -2 %的活性，聚集后的procaspase-8通過自身或相互之間的切割產(chǎn)生成熟的caspase-8 ο caspase-8可激活下游的caspases-3,后者水解ICAD而活化CAD,從而導致細胞凋亡。caspase-8同時也激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid (binding interfacedatabase)。正常狀態(tài)下，Bid以非活性方式存在于胞衆(zhòng)內(nèi)，當被caspase-8激活后，形成一種截短的Bid(truncated Bid, tBid),后者轉(zhuǎn)移到線粒體,破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，導致細胞色素C等釋放入胞質(zhì),激活caspase-9,進一步強化了 caspases級聯(lián)反應(yīng)。一些凋亡刺激因素如射線、化療藥物等，促使線粒體釋放凋亡啟動因子(Cyto-C、AIF、Apaf-1)、Smac / Diablo(second mitochondria—derived activator of caspase / direct IAP—binding protein with low pi)、HtrA2(high—temperature requirement factor A2)和pro-caspase-3 入胞質(zhì)。[0070]上述因子通過下述多種機制導致細胞凋亡:①Cyto-C在dATP存在的情況下，與Apaf—I結(jié)合，使Apaf-1暴露其上的CARD結(jié)構(gòu)域(caspase activation andrecruitment domain),并與 procaspase-9 的 CARD 結(jié)合形成凋亡復合體(apoptosome),導致procaspase-9激活,后者進一步激活caspase-3,6等,從而誘導細胞凋亡?、贏IF通過促進線粒體釋放細胞色素C而增強凋亡信號，并可快速激活核酸內(nèi)切酶；?Smac / Diablo和HtrA2可能通過阻斷凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein, IAPs)的作用參與細胞凋亡的調(diào)控。
[0071]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選地，步驟104可以包括:
[0072]子步驟S21、收集細胞沉淀，并提取蛋白。
[0073]子步驟S22、采用蛋白質(zhì)印跡法檢測所述四組樣品凋亡相關(guān)蛋白的表達。
[0074]蛋白質(zhì)印跡法即Western Blot,通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，并進一步通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。
[0075]本發(fā)明實施例中，在離心后去除上清液并收集細胞沉淀，提取其中的蛋白，通過蛋白質(zhì)印跡法來可以檢測凋亡過程中相關(guān)蛋白的表達。其中，針對四組樣品分別進行檢測，并對比檢測結(jié)果。
[0076]為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，通過具體的示例對本發(fā)明的肺癌細胞凋亡的檢測方法進行說明。
[0077]用AZD2014 (5 μ mol/L)和2-DG (5 μ mol/L)分別處理肺癌細胞。選用指數(shù)生長期的A549細胞，種6孔板，細胞密度約為70%，細胞貼壁后，分別用這兩種藥物單獨處理及聯(lián)合處理A549細胞，處理48h后，用0.25%的胰酶消化細胞，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基終止消化，1000rpm/min離心5min,棄上清。
[0078]用Iml預(yù)冷的PBS輕輕重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌的EP管中，并進行細胞計數(shù)，取約10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195 μ I Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5μ I Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫(20_25°C )避光孵育10分鐘。1000g離心5分鐘，棄上清，加入190 μ I Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。
[0079]加入10μ I碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即進行流式細胞儀檢測。
[0080]收集細胞沉淀，提取蛋白，Western blot檢測藥物處理后凋亡相關(guān)蛋白的表達。
[0081]圖2是本發(fā)明的示例中四組樣品的流式細胞儀檢測結(jié)果的對比圖，從圖中可以看出，橫坐標和縱坐標顯示的是用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后的細胞數(shù)，正常的活細胞不被Annexin V-FITC和碘化丙唳染色(每個處理的左下角)；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈陰性(每個處理的右下角)；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(每個處理的右上角)。每個處理的左上角出現(xiàn)的是許可范圍內(nèi)的檢測誤差。圖2中可以看出，相比對照組，分別用AZD2014(5 μ mol/L)和2-DG (5 μ mol/L)處理A54948h后，可促進凋亡(對照組凋亡早期的細胞占1.1%，壞死和凋亡晚期的細胞占0.2%，AZD2014處理組兩者所占的比例分別為:2.7%和5.2%，2-DG處理組的兩者所占比例分別為:1.4%和1.2%)，而相比AZD2014 (5 μ mol/L)和2-DG (5 μ 11101/1)單獨處理4549，兩者協(xié)同處理Α549細胞48h后凋亡早期的細胞占15.5%，壞死和凋亡晚期的細胞占16.2%，有顯著的協(xié)同促凋亡作用。
[0082]圖3是本發(fā)明的示例中四組樣品的凋亡蛋白表達的檢測結(jié)果的對比圖，圖中可以看出:BCL-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì).在線粒體上，BCL-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細胞凋亡〃主開關(guān)〃的作用.BCL-2家族包括兩類蛋白質(zhì):一類是抗凋亡蛋白，另一類是促凋亡蛋白.在細胞凋亡時，BCL-2家族中的促凋亡蛋白成員發(fā)生蛋白質(zhì)的加工修飾，易位到線粒體的外膜上，引起細胞色素C、凋亡誘導因子等其他促凋亡因子的釋放，導致細胞凋亡；而平時被隔離在線粒體等細胞器內(nèi)的該家族的抗凋亡蛋白成員則抑制細胞色素c和凋亡誘導因子等促凋亡因子的釋放，具有抑制細胞凋亡的功能。BAX是BCL-2基因家族的一員，其產(chǎn)物是一種與BCL-2同源的相關(guān)蛋白，能拮抗后者的生物學活性。BAX的主要作用是加速細胞凋亡，BCL-2是抗凋亡蛋白。Caspase-3是caspase_3亞家族的主要成員之一，可介導細胞凋亡。在線粒體/細胞色素C介導的凋亡通路中，caspase-3被活化為cleaved-caspase3,并伴隨著其他成員被激活,從而啟動了 caspase級聯(lián)反應(yīng),導致凋亡發(fā)生。PARP是細胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(caspase)的切割底物，cleaved-PARP是細胞發(fā)生凋亡的標志蛋白。圖3中顯示AZD2014 (5ymol/L)和2-DG (5 μ mol/L)協(xié)同處理較之AZD2014 (5 μ mol/L)和 2-DG (5 μ mol/L)單獨處理 BAX、cleaved-caspase3、cleaved_PARP蛋白水平顯著升高，BCL-2顯著下調(diào)，表示AZD2014 (5 μ mol/L)和2-DG (5ymol/L)聯(lián)合用藥后可協(xié)同促進A549細胞株的凋亡。
[0083]綜上所述,上述流式結(jié)果及Western blot的結(jié)果顯示,2-DG和AZD2014聯(lián)合用藥后對A549細胞株的凋亡具有顯著協(xié)同促進效應(yīng)。
[0084]依據(jù)本發(fā)明實施例，采用3_[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成的組合藥物作用于選自非小細胞肺癌細胞株A549的肺癌細胞，通過實驗驗證，本發(fā)明創(chuàng)新提出的組合藥物可以明顯促進肺癌細胞`的凋亡。
[0085]對于方法實施例，為了簡單描述，故將其都表述為一系列的動作組合，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知悉，本發(fā)明并不受所描述的動作順序的限制，因為依據(jù)本發(fā)明，某些步驟可以采用其他順序或者同時進行。其次，本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)該知悉，說明書中所描述的實施例均屬于優(yōu)選實施例，所涉及的動作和部件并不一定是本發(fā)明所必須的。
[0086]以上對本發(fā)明所提供的一種促進肺癌細胞凋亡的組合藥物，一種促進肺癌細胞凋亡的藥物制劑以及一種肺癌細胞凋亡的檢測方法進行了詳細介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實施方式】及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
【權(quán)利要求】
1.一種促進肺癌細胞凋亡的組合藥物，其特征在于，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549，所述組合藥物由3-[2，4-雙((3S)_3_甲基嗎啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成。
2.如權(quán)利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述組合藥物中所述3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
3.一種促進肺癌細胞凋亡的藥物制劑，其特征在于，以促進肺癌細胞凋亡的組合藥物作為活性成分，并輔以可接受的要用載體； 所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549 ； 所述組合藥物由3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖組成。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物制劑，其特征在于，所述組合藥物中所述3-[2，4-雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
5.如權(quán)利要求3所述的藥物制劑，其特征在于，所述制劑為口服液、膠丸、口服混懸液、固體分散體、膠囊、緩釋劑、顆粒劑、片劑、注射劑、軟膏、貼劑或植入劑。
6.一種肺癌細胞凋亡的檢測方法，其特征在于，所述肺癌細胞選自非小細胞肺癌細胞株A549,所述方法包括: 采用促進肺癌細胞凋亡的組合藥物對所述肺癌細胞進行處理，同時采用所述組合藥物中的兩種組分分別對所述肺癌細胞進行處理，與未處理的肺癌細胞組成四組對比樣品，所述組合藥物由3-[2，4-雙((3S)-3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及產(chǎn)生糖酵解作用的2-脫氧-D-葡萄糖兩種組分組成； 針對所述四組對比樣品，進行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括:采用胰酶消化所述肺癌細胞，并采用含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止對肺癌細胞的消化，將終止消化后的肺癌細胞進行離心,棄除上清液； 對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行流式細胞儀檢測，并比對流式細胞儀的檢測結(jié)果; 對進行預(yù)處理后的四組樣品分別進行凋亡蛋白表達的檢測，并比凋亡蛋白表達的檢測結(jié)果。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述組合藥物中所述3-[2，4_雙((3S) -3-甲基嗎啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺與所述2-脫氧-D-葡萄糖的摩爾濃度比為1:1。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，對進行一次處理后的四組樣品分別進行流式細胞儀檢測的步驟包括: 采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞并轉(zhuǎn)入無菌的離心管中； 進行細胞計數(shù)，提取預(yù)設(shè)個數(shù)的肺癌細胞細胞，離心并棄除上清液； 采用磷脂結(jié)合蛋白與異硫氰酸熒光素的結(jié)合液重懸細胞，再加入所述結(jié)合液混勻，在室溫下避光孵育后離心并棄除上清液； 再次加入所述結(jié)合液重懸細胞，加入碘化丙啶染色液混勻，冰浴避光放置后，進行流式細胞儀檢測； 對進行一次處理后的四組樣品分別進行凋亡相關(guān)蛋白的表達的步驟包括: 收集細胞沉淀，并提取蛋白； 采用蛋白質(zhì)印`跡法檢測所述四組樣品凋亡相關(guān)蛋白的表達。
【文檔編號】C12Q1/02GK103768077SQ201410060361
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】湯郡, 聶培培, 鄒爭志, 陳穎, 莊元元, 彭碧玲, 何娟 申請人:廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司