基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法
【專利摘要】一種生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法，該阿拉伯呋喃糖苷酶基因克隆自灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseus)JSD-1，將其連接到表達(dá)載體上得到重組表達(dá)載體，進(jìn)一步將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌并誘導(dǎo)合成阿拉伯呋喃糖苷酶。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中阿拉伯呋喃糖苷酶多為誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量較低等不足，應(yīng)用基因工程菌表達(dá)本發(fā)明所述的基因制備阿拉伯呋喃糖苷酶，可為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶提供一種新方法。
【專利說明】基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其實(shí)現(xiàn)方法，具體是一種能夠外源表達(dá)胞外a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)的大腸桿菌工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產(chǎn)生的主要干物質(zhì)，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。據(jù)估計(jì)，每年全世界綠色植物光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素總干重為1730億t，所含總能量可達(dá)2X 1018kJ，相當(dāng)于每年全世界消耗能量的10倍。木質(zhì)纖維素的生物降解和解聚作用是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。
[0003]木質(zhì)纖維素中的半纖維素組分是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，這些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。半纖維素主要分為三類:聚木糖類、聚葡萄甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類，其中聚木糖類是以1，4-β -D-吡喃型木糖構(gòu)成主鏈，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖；聚葡萄甘露糖類是由D-吡喃型葡萄糖基和吡喃型甘露糖基以1，4-β型連接成主鏈；另一類聚半乳糖葡萄甘露糖類則還有D-吡喃型半乳糖基用支鏈的形式以1，6-a型連接到此主鏈上的若干D-吡喃型甘露糖基和D-吡喃型葡萄糖基上。半纖維素在木質(zhì)組織中占總量的50%，它結(jié)合在纖維素微纖維的表面，并且相互連接，這些纖維構(gòu)成了堅(jiān)硬的細(xì)胞相互連接的網(wǎng)絡(luò)。
[0004]半纖維素的主要降解酶有內(nèi)切-β -1, 4-木聚糖酶(Endo-β -1, 4-xylanases)和β -1, 4-木糖苷酶(β -1, 4-xylosidase)，此外，半纖維素的降解還需要木聚糖酯酶、α -葡糖醒酸酶(a -glucuronidases)、a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a -L-arabinofuranosidase)和乙酰酯酶(Acetylesterase)等輔助酶的作用。由此可見，內(nèi)切_β _1，4_木聚糖酶在纖維素的酶降解過程中起重要的輔助作用。
[0005]目前，在許多微生物中已經(jīng)`發(fā)現(xiàn)并克隆得到a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。與真核生物基因相比，原核生物基因結(jié)構(gòu)簡單、無內(nèi)含子，具有易克隆、易表達(dá)及種類多等優(yōu)勢?；衣约t鏈霉菌(Streptomyces griseus)是一種常見的土壤細(xì)菌(或放線菌)?；衣约t鏈霉菌之前的研究重點(diǎn)為如何改造其代謝途徑以提高抗生素尤其是鏈霉素的發(fā)酵產(chǎn)量，對其基因組內(nèi)其他功能基因的開發(fā)和利用還相對不足。
[0006]與大多數(shù)細(xì)菌相比，鏈霉菌具有較為復(fù)雜的生長、分化機(jī)制，基因組較其他的原核生物也更大，可達(dá)8-9Mb。一般情況下，鏈霉菌對大分子多糖物質(zhì)有很強(qiáng)的分解利用能力，如半纖維素等。因此，研究鏈霉菌對半纖維素的分解利用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)全新的阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列并通過轉(zhuǎn)基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行外源表達(dá)，對新型半纖維素酶制劑的開發(fā)及生產(chǎn)具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于胞外a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明涉及一種基于胞外α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌，能夠外源表達(dá)胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的DH5a大腸桿菌。
[0010]所述工程菌通過以下方式構(gòu)建得到:
[0011]I)設(shè)計(jì)并合成PCR引物，自灰略紅鏈霉菌JSD-1 (CGMCC N0.5706)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012]所述的PCR引物是指含有Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物，具體包括:
[0013]正向引物Abl-Nde 1-F:
[0014]5’-GGAATTCCATATGGCGACCGTGGACACGAACGCCTCGTAC-3’
[0015]反向引物Abl-EcoR 1-R:
[0016]5，-GGAATTCTCAGCGCCGCAGCGTCAGCAGACC-3’
[0017]所述的PCR擴(kuò)增采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性3min ;98°C變形10s，68。。延伸Imin ；30個(gè)循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0018]2)構(gòu)建具有Sg-Abl基因的質(zhì)粒:將步驟I得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接至克隆載體，并導(dǎo)入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；挑取具有相應(yīng)抗性的克隆并通過菌落PCR進(jìn)行鑒定，直至獲得陽性克隆后挑取并搖菌提取得到pET_41a質(zhì)粒。
[0019]所述的克隆載體采用pMD?19 -T Vector。
[0020]3)構(gòu)建具有Sg-Abl基因的表達(dá)載體，具體步驟包括:
[0021]3.1)用Nde I和EcoR I雙酶切處理含有Sg-Abl基因的克隆質(zhì)粒后通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有β_1，4-胞外a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因的片段；
[0022]3.2)用Nde I和EcoR I內(nèi)切酶處理pET_41a質(zhì)粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收載體片段；
[0023]3.3)將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下過夜連接，然后導(dǎo)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒，獲得含有Sg-Abl基因的表達(dá)載體。
[0024]4)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌:將步驟3中得到的含有Sg-Abl基因的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。通過具有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選獲得陽性克隆，即含有Sg-Abl基因的工程菌。
[0025]所述的β-1，4_胞外a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，其原始氨基酸序列如SEQ IDN0.3，共編碼490個(gè)氨基酸，切除前35個(gè)氨基酸信號肽序列后的成熟蛋白為455個(gè)氨基酸，分子量為49.9KD,如SEQ ID N0.4 (加入起始氨基酸M共456個(gè)氨基酸)。
[0026]所述的Sg-Abl基因，其原始核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其長度為1473個(gè)堿基對，切除編碼信號肽對應(yīng)的105個(gè)核苷酸后成熟蛋白對應(yīng)的氨基酸為1368個(gè)核苷酸，如SEQ IDN0.2 (加入起始密碼子ATG共1371個(gè)核苷酸)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1目的基因序列信號肽分析圖。
[0028]圖2目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。[0029]圖3含有目的基因的克隆載體酶切電泳圖。
[0030]圖4含有目的基因的表達(dá)載體酶切電泳圖。
[0031 ] 圖5重組菌誘導(dǎo)蛋白SDS-PAGE電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
[0033]灰略紅鏈霉菌(Streptomycesgriseus) JSD-1 的培養(yǎng)[0034]灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseus)分離自上海浦江鎮(zhèn)腐爛土壤,保藏編號為CGMCC N0.5706 ;該菌株于2012年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心中國科學(xué)院微生物研究所(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號100101)
[0035]將該菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)60h，離心收集菌體并提取細(xì)菌的基因組 DNA。
[0036]所述的LB液體培養(yǎng)基組分為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC15g、去離子水1L，pH6.8-7.2ο
實(shí)施例2
[0037]灰略紅鏈霉菌阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因的克隆
[0038]通過對灰略紅鏈霉菌阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列進(jìn)行信號肽序列分析(如圖1)，以成熟蛋白的編碼基因序列的兩端設(shè)計(jì)含有Nde I和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物如下:
[0039]正向引物Abl-Nde 1-F:
[0040]5’-GGAATTCCATATGGCGACCGTGGACACGAACGCCTCGTAC-3’
[0041]反向引物Abl-EcoR 1-R:
[0042]5，-GGAATTCTCAGCGCCGCAGCGTCAGCAGACC-3’
[0043]以灰略紅鏈霉菌JSD-1基因組DNA為模板，采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性3min ;98°C變形10s，68°C延伸Imin ；30個(gè)循環(huán)后68°C終延伸3min。
實(shí)施例3
[0044]含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因克隆載體的構(gòu)建
[0045]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果表明獲得片段約為1.4Kb(見圖2);然后將PCR產(chǎn)物切膠回收后，通過A-Tailing Kit(TaKaRa)進(jìn)行加A反應(yīng)并連接到pMD?19-TVector (TaKaRa),隨后導(dǎo)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
[0046]挑取具有相應(yīng)抗性的克隆，通過菌落PCR進(jìn)行鑒定，直至獲得陽性克隆。挑取陽性克隆，搖菌提取其質(zhì)粒后送上海桑尼生物有限公司進(jìn)行測序。
實(shí)施例4
[0047]含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0048]選取序列正確的質(zhì)粒，用Nde I和EcoR I雙酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因的片段(如圖3);同樣，用Nde I和EcoR I內(nèi)切酶處理pET-41a表達(dá)載體，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收較大的載體片段。
[0049]將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下過夜連接，然后導(dǎo)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒便獲得含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因表達(dá)載體。用Nde I和EcoR I雙酶切通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖4)，確認(rèn)載體構(gòu)建無誤。
實(shí)施例5
[0050]含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0051]將含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。通過含有卡那抗生素(25yg/mL)的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選獲得陽性克隆。獲得的陽性克隆便為含有阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)基因的表達(dá)菌株。
實(shí)施例6
[0052]阿拉伯呋喃糖苷酶(Sg-Abl)的外源表達(dá)
[0053]挑取陽性克隆并接種于含有卡那霉素(濃度為25 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，320C、150rpm震蕩培養(yǎng)2_3h，當(dāng)0D600達(dá)到0.5-0.6時(shí)，加入IPTG使發(fā)酵液中IPTG濃度達(dá)為0.lmM，28°C、140rpm繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并分別取空白(誘導(dǎo)前)、2、4、6、8小時(shí)樣品。待誘導(dǎo)表達(dá)完成，離心收集菌體，用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再用1/10發(fā)酵液體積的IXPBS緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下超聲波破碎至菌液澄清，13000rpm/min離心IOmin收集上清，上清液即為阿拉伯呋喃糖苷酶的粗酶液。
實(shí)施例7`
[0054]重組菌誘導(dǎo)表達(dá)阿拉伯呋喃糖苷酶粗酶液的SDS-PAGE
[0055]制備12%SDS-PAGE 膠，將粗酶液與 5XSDS-PAGE Loading Buffer 比例混合，與沸水浴lOmin，每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣10yL，120V電泳IOmin待條帶進(jìn)入分離膠后調(diào)高電壓至160V，電泳65-75min，直至溴酚藍(lán)指示條帶完全跑出膠。立即停止電泳，用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液過夜染色，然后用脫色液進(jìn)行洗滌，直至背景色完全脫去，條帶清晰可見(如圖5)。
[0056]所述的12%SDS_PAGE是由濃縮膠與分離膠構(gòu)成的，其組分分別為:
[0057]分離膠:蒸餾水1.6mL, 30% 丙烯酰胺溶液 2.0mL, 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3mL，10% 過硫酸銨(APS) 0.05mL, 10%SDS 溶液 0.05mL, TEMED0.002mL ；
[0058]濃縮膠:蒸餾水0.68mL，30%丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0MTris-HCl (pH6.8)0.13mL, 10% 過硫酸銨(APS)0.01mL, 10%SDS 溶液 0.01mL, TEMED0.0OlmL ；
[0059]所述的5 X SDS-PAGE Loading Buffer 組分為:IM Tris-HCl (ρΗ6.8) 1.25mL,SDS0.5g，溴酚藍(lán)25mg，甘油2.5mL,去離子水定容至5mL。小份分裝(500 μ L)后與室溫保存，使用前每小份加入β -巰基乙醇25 μ L0
[0060]所述的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液組分為:考馬斯亮藍(lán)R_2501g，異丙醇250mL，冰醋酸10OmT,,去離子水 650mL。
[0061]所述的脫色液組分為:冰醋酸IOOmL,無水乙醇50mL,去離子水850mL。
【權(quán)利要求】
1.一種基于胞外a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達(dá)胞外a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶的DH5 α大腸桿菌； 所述的胞外a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具體為β-1,4-胞外a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所不； 所述的β -1, 4-胞外a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有Sg-Abl基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示，其長度為1473個(gè)堿基對，共編碼490個(gè)氨基酸，切除前35個(gè)氨基酸信號肽序列后的成熟蛋白加入起始氨基酸M共456個(gè)氨基酸，分子量為49.9KD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)設(shè)計(jì)并合成PCR引物，自灰略紅鏈霉菌JSD-1(CGMCC N0.5706)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 正向引物Abl-Nde 1-F:
5’-GGAATTCCATATGGCGACCGTGGACACGAACGCCTCGTAC-3’ 反向引物Abl-EcoR 1-R:
5，-GGAATTCTCAGCGCCGCAGCGTCAGCAGACC-3， 2)構(gòu)建具有Sg-Abl基因的質(zhì)粒:將步驟I得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接至克隆載體，并導(dǎo)入DH5ci大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；挑取具有相應(yīng)抗性的克隆并通過菌落PCR進(jìn)行鑒定，直至獲得陽性克隆后挑取并搖菌提取得到pET-41a質(zhì)粒。 3)構(gòu)建具有Sg-Abl基因的表達(dá)載體； 4)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌:將步驟3中得到的含有Sg-Abl基因的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。通過具有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選獲得陽性克隆，即含有Sg-Abl基因的工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR擴(kuò)增采用PrimeSTARGXL高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性3min ;98°C變形10s，68°C延伸Imin ;30個(gè)循環(huán)后68°C終延伸3min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的步驟3具體包括: 3.1)用Nde I和EcoR I雙酶切處理含有Sg-Abl基因的克隆質(zhì)粒后通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有Sg-Abl基因的片段； 3.2)用Nde I和EcoR I內(nèi)切酶處理pET_41a質(zhì)粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收載體片段； 3.3)將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下過夜連接，然后導(dǎo)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒，獲得含有Sg-Abl基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的克隆載體采用pMD?19-TVector。
【文檔編號】C12N9/42GK103865867SQ201410125508
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 支月娥, 孫玉靜, 初少華, 羅艷青 申請人:上海交通大學(xué)