一種同時靶標番木瓜病毒prsv和pldmv的嵌合基因、植物表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因，其篩選兩種病毒基因組范圍內(nèi)的共同保守區(qū)域，分別針對PRSV和PLDMV的復制酶Nib和輔助成分蛋白基因Hc-Pro，按照PRSV-Nib1-PRSV-Nib2-PLDMV-Nib1-PLDMV-Nib2-PRSV-Hc-Pro-PLDMV-Hc-Pro的排列順序，連接成總長為621bp的基因序列，如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明還涉及一種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表達載體及其構建方法，所述的植物表達載體可用于基因槍或農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化，創(chuàng)造高效、廣譜同時抗PRSV和PLDMV病毒病的新種質。所述方法用于構建RNAi表達載體時，能簡化實驗步驟，節(jié)省實驗時間，并且提高RNAi植物表達載體的抗病毒效率。
【專利說明】—種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因、植物表達載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種同時祀標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因及植物表達載體。通過對GenBank中的兩種病毒(番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)和番木瓜畸形花葉病毒(PLDMV))的多條基因組全長序列進行比對，篩選到兩種病毒在基因組范圍內(nèi)的共同保守區(qū)域；最終選定各病毒序列，人工合成621 bp的嵌合基因。以該嵌合基因為模板，用高保真Taq酶進行PCR反應獲得不同長度的正反向序列，提供不需要另外插入內(nèi)含子，同時靶標PRSV、PLDMV的取Hc-Pro基因的RNAi植物表達載體構建方法。該載體可用于基因槍或農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化，獲得高效、廣譜同時抗PRSV和PLDMV病毒病的新種質。 【背景技術】
[0002]番木瓜(Ckrica papaya L.)與香蕉、菠蘿并稱為熱帶三大草本果樹,是人們喜愛的果蔬兼藥用的熱帶水果，在我國南方享有“萬壽果”和“嶺南佳果”的美譽。目前在番木瓜生產(chǎn)中遇到了實際性迫切需要解決的問題:番木瓜環(huán)斑病毒引起的毀滅性嚴重病害威脅著世界番木瓜生產(chǎn)國之種植業(yè)和加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，它能導致當年種植的木瓜全部發(fā)病，產(chǎn)量、酶含量嚴重下降，使番木瓜由多年生變?yōu)橐荒晟@一因素大大限制了番木瓜的生產(chǎn)和利用。并且有報道抗PRSV的轉基因番木瓜能被PLDMV侵染，說明PLDMV在臺灣和其他地區(qū)有可能威脅著目前轉基因番木瓜的推廣和應用。由于目前在栽培技術上還很難通過化學防治的方法予以防治PRSV和PLDMV，因此種植抗病品種是防治病毒病害的經(jīng)濟而有效的措施。然而由于番木瓜株性復雜(有雄性株、雌性株和兩性株)，并且番木瓜是異花授粉果樹，即使通過雜交手段成功選育抗耐病品種，其后代的性狀必然嚴重分離，很難保持其抗病優(yōu)良性狀不變。因此，通過轉基因技術培育出穩(wěn)定、高抗、譜抗，且安全性好的新品種是發(fā)展番木瓜生產(chǎn)的當務之急，是防治番木瓜病毒病的根本途徑。
[0003]Fitch等(1990)首次將PRSV外殼蛋白CP基因轉入到番木瓜中并成功獲得了穩(wěn)定遺傳的轉化植株，這也是首例商業(yè)化的轉基因水果。國內(nèi)，葉長明等首次克隆了 PRSV華南優(yōu)勢株系Ys的CP基因，并轉化了番木瓜。周鵬等也利用農(nóng)桿菌轉化法獲得了轉CP基因的植株。臺灣Yeh研究組通過將PRSV和PLDMV的CP基因構成融合基因，獲得抗PRSV和PLDMV的轉基因番木瓜。由于PRSV在各地區(qū)的病毒株系的CP基因存在很大差異，這些轉基因植株僅對病毒基因同源性高的病毒株系有抗性，而對同源性較底的株系沒有抗性，造成一個地區(qū)的轉基因植物在另一地區(qū)種植表現(xiàn)出的抗病能力減弱甚至抗性喪失，并且抗病效果還與基因的表達量相關。CP基因介導的抗病性主要表現(xiàn)在病毒侵染的早期，表現(xiàn)在只是延遲發(fā)病，當存在高接種量或重復接種時則會破壞其抗性。此外，還有一個非常重要的問題是PRSV田間發(fā)病生態(tài)復雜，不同株系間復合感染的比例可達44.08%，也給番木瓜的抗PRSV育種造成了非常大的困難。另外利用CP基因介導的抗病性具有潛在的危險性，如外殼蛋白對其它病毒的包殼作用可能會導致非蚜傳病毒變?yōu)檠羵鞑《?。因此，人們擔心導入植物的CP基因的mRNA可能與病毒基因重組導致新病毒的產(chǎn)生。Nib基因介導的抗性在番木瓜抗病毒病的研究中取得了一定成功。與CP基因介導的抗性相比，Nib基因介導的抗性有以下特點:抗性強，能使轉基因植株產(chǎn)生免疫或高抗；持續(xù)時間長；但作用范圍相對狹窄，只對Nib基因來源的親本株系有抗性，而對那些與親本株系有一定差別的同種不同株病毒不表現(xiàn)抗性；許多轉基因植株表現(xiàn)起初感染而后康復的可誘導抗性。
[0004]RNA沉默是真核生物中普遍存在，發(fā)生在轉錄或轉錄后水平的基因沉默現(xiàn)象。雙鏈RNA(dsRNA)或帶部分雙鏈的發(fā)夾結構(hpRNA)被切割加工成小的干擾RNA( siRNA)，siRNA利用堿基互補的原則指導RNA沉默誘導復合物(RISC)的Argnaute蛋白降解同源RNA或抑制它們的翻譯或者修飾同源DNA，從而抑制它們的表達。由于不需要產(chǎn)生新的蛋白，因此應用RNA沉默技術在育種中具有高效特異和安全等特點。RNA沉默技術的應用，為我們提供了一條更為有效、安全的抗病毒新策略。由于反向重復序列轉入植物后，可以通過轉錄產(chǎn)生互補的雙鏈RNA或發(fā)夾結構RNA，有效引發(fā)轉基因植物中的RNA沉默；并且反向重復序列片段小，有利于構建含多個病毒基因的嵌合基因，獲得同時抗多種病毒的轉基因植株，因此已經(jīng)成為最有效的抗病毒策略之一。目前利用RNA沉默技術已經(jīng)成功獲得高抗、穩(wěn)定、且安全性高的抗病毒轉基因大豆、西紅柿、馬鈴薯等作物。因此利用RNAi技術培育同時抗PRSV和PLDMV番木瓜新品系，在理論上是可行的。
[0005]Nib對病毒復制起關鍵作用，并在各病毒株系中比較保守。Hc-Pio不僅具有蛋白酶活性，作為蚜傳輔助因子參與病毒蚜傳過程，調節(jié)病毒中宿主體內(nèi)的轉移，并且是馬鈴薯Y病毒屬病毒的沉默抑制子，在病毒復制、宿主癥狀表達及增強異源病毒復制等方面發(fā)揮作用。因此同時沉默病毒的Nib和Hc-Pro基因能有效提高沉默效率。
[0006]傳統(tǒng)的抗多種病毒RNAi載體的構建方法是將多種病毒的保守片段連接成長片段，以相反方向插入到內(nèi)含子序列(形成發(fā)夾結構的環(huán))兩端，形成具有長的反向重復序列的RNAi載體或每種病毒的保守 序列各自形成小的發(fā)夾結構后在再連接一起。如一種構建方法，在載體構建過程中由于長的反向重復序列可能發(fā)生重組，導致載體內(nèi)含子序列的截斷或缺失，增加載體構建的難度和降低載體的穩(wěn)定性。第二種方法由于首先要將每種病毒的保守序列各自形成小的發(fā)夾結構，然后再連接在一起，需要反復酶切、連接，操作過程復雜、費事費工。
[0007]目前，還沒有利用RNAi技術培育同時抗PRSV和PLDMV病毒病的轉基因番木瓜新種質的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一種同時祀標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因、植物表達載體及其構建方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因，其通過對GenBank中危害番木瓜的兩種病毒PRSV和PLDMV的多條基因組全長基因組序列進行比對，篩選兩種病毒基因組范圍內(nèi)的共同保守區(qū)域，分別針對PRSV和PLDMV的復制酶和輔助成分蛋白基因Hc-Pro,按照 PRSVtV^7-PRSVtV2U-PLDMVtV^7-PLDMVtV2U-PRSV-汝TdTo-PLDMV-汝-Pro 的排列順序，連接成總長為621 bp的基因序列，如SEQ ID N0.1所示。[0010]一種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表達載體，其由上述包含PRSV、PLDMV的NIb和Hc-Pro保守區(qū)域的人工合成嵌合基因及載體質粒pSW4i (其圖譜如圖9所示)構成。
[0011]上述同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表達載體的構建方法，其包括以下步驟:
O首先以嵌合基因為模板，用高保真Taq酶進行PCR反應獲得兩個長度不同的長片段和短片段；為使用酶切鑒定的方法判斷短片段的插入方向，在短片段的正向引物中插入NcoI位點；在長片段的正反向引物中分別添加酶切位點EcoRI和ΚρηΙ，使長片段定向插入PMD18-T載體上的EcoRI和KpnI之間。
[0012]2)短片段和長片段與克隆載體連接，分別命名為PMD18-S和pMD19_L ;分別用EcoRI和KpnI對pMD19_L和pMD18_S進行雙酶切，回收pMD19_L的小片段和pMD18_S的大片段；兩個片段連接轉化形成含有目的發(fā)夾結構的克隆載體，命名為PMD18-LS ;用EcoRI和SalI對pMD18-LS進行雙酶切，回收小片段并與經(jīng)同樣雙酶切的克隆載體pRTL-Sall (其圖譜如圖10所示)的大片段連接，構建成中間載體pRTL-LS ；pRTL-LS經(jīng)PstI單酶切回收小片段，與載體質粒pSW4i經(jīng)PstI酶切后的回收產(chǎn)物連接，經(jīng)電泳檢測并測序驗證后RNAi植物表達載體PSW-LS構建成功。
[0013]本發(fā)明通過對GenBank中的兩種病毒PRSV和PLDMV的多條基因組全長序列進行比對，篩選到兩種病毒在基因組范圍內(nèi)的共同保守區(qū)域；最終選定各病毒序列，人工合成621 bp的嵌合基因，并依此基因構建成RNAi載體。該載體通過農(nóng)桿菌介導法、基因槍等方法導入番木瓜后能同時靶標PRSV、PLDMV的取Hc-Pro的兩個基因，提高RNAi效率，獲得高效、廣譜同時抗PRSV、PLDMV病毒病的新種質。本發(fā)明還提供了一種以人工合成的嵌合基因為模板，用高保真Taq酶進行PCR反應獲得不同長度的正反向序列片段，以長片段的一部分序列形成發(fā)夾結構的環(huán)，不需要另外插入內(nèi)含子的RNAi植物表達載體構建方法。該方法不用反復酶切、連接就能將靶標多個病毒不同基因的保守序列構建在同一個載體上，并且不需要插入內(nèi)含子片段，降低RNAi載體中插入片段的長度，因而降低載體構建的難度、增強載體的穩(wěn)定性。另外，發(fā)夾結構中非反向重復部分的序列也是病毒來源的保守序列，在轉基因植物中也能產(chǎn)生dsRNA，因此能有效的提高RNAi載體的抗病毒效率。具體步驟如下:
第一，構建發(fā)夾結構。
[0014]首先以嵌合基因為模板，用高保真Taq酶進行PCR反應獲得不同長度的正反向序列，為運用酶切鑒定短片段的插入方向，在短片段的正向引物插入NcoI位點；為便于長片段的定向插入，在引物中分別設計了 EcoRI和KpnI兩個酶切位點，引物如下:
短片段(S):
PRSV-Nib 573Fb-NcoI: CCCATGG CCTCTCGACACTTTGTTGGGAG



NcoI
PLDMV-HC1037Rb:GATCCAATAACCTTCCTTAGCCACAATCA
基因大小530bp ；
長片段(L):
PRSV-M/? 608Fa-EcoRI:CATGGAATTCTGATGATTTCAATAATTGGTTCTACAGC




EcoRIPLDMV-HC1118R-KpnI: CGGGGTACCTTATATCTCTAACCTTCTTTGTG




KpnI
基因大小598bp。
[0015]其次，短片段PCR產(chǎn)物連接到pMD18_T載體，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子并進行測序鑒定，選擇反向插入，不存在突變位點的克隆，命名為PMD18-S。
[0016]第三，長片段PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子并進行測序，證實不存在突變位點，命名為PMD19-L。
[0017]第四，利用pMD18-T載體上EcoRI和KpnI的酶切位點將pMD18_S線性化，并與經(jīng)同樣雙酶切后回收的PMD19-L上的目的片段連接、轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子，獲得PMD18-LS。通過雙酶切能夠得到大小約為1100 bp的DNA片段；經(jīng)過測序證實所得到的片段確為目的發(fā)夾結構，且方向無誤，不存在突變位點。
[0018]第五，構建植物RNAi載體。為使發(fā)夾結構在植物細胞內(nèi)具有較高的轉錄水平，選擇含有35S啟動子和終止子的pRTL-Sall為中間載體，用EcoRI和SalI將其線性化，并與經(jīng)同樣雙酶切后回收的PMD18-LS上的目的片段連接、轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子，獲得pRTL-LS。pRTL-LS經(jīng)PstI單酶切回收含發(fā)夾結構的目的小片段，與載體質粒pSW4i經(jīng)PstI酶切后的回收產(chǎn)物連接、轉化、篩選陽性克隆子，酶切鑒定并測序驗證，植物表達載體PSW-LS構建成功。本發(fā)明中載體質粒pSW4i和pRTL-Sall均由美國俄亥俄州立大學瞿峰教授 惠贈。
[0019]本發(fā)明的技術優(yōu)勢和有益效果:
I)采用RNAi技術，設計、人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因保守區(qū)域，并依此構建成反向重復發(fā)夾結構，使之能夠高效快速穩(wěn)定的產(chǎn)生同時靶標PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro兩個基因的dsRNA。與已報道的轉病毒全長CPiNIb等基因產(chǎn)生dsRNA相比，本發(fā)明構建的具有反向重復發(fā)夾結構RNAi載體產(chǎn)生dsRNA的效率更高，并且由于同時靶標每種病毒的兩個基因的保守序列，因此導入植物后有望獲得高抗、光譜并且同時抗PRSV和PLDMV的番木瓜新品系。
[0020]2)與傳統(tǒng)抗多種病毒RNAi載體的構建方法不同，本發(fā)明直接人工合成兩種病毒六個基因保守片段的嵌合基因，避免反復酶切、連接，簡化操作過程。并且較短的序列就能包含更多的保守序列，提高抗病毒效率，同時避免載體構建過程中由于長的反向重復序列可能發(fā)生重組，導致載體內(nèi)含子序列的截斷或缺失，增加載體構建的難度和降低載體的穩(wěn)定性。
[0021]3)以人工合成的嵌合基因為模板合成長短不同的兩個片段，通過引物設計添加特定的酶切位點使長短不同的片段以相反方向連接，形成反向重復發(fā)夾結構。該方法以長片段的一部分序列作為發(fā)夾結構的環(huán)，不需要另外插入內(nèi)含子序列，因此簡化了實驗步驟，節(jié)省了實驗時間。另外，發(fā)夾結構中非反向重復部分的序列也是病毒來源的保守序列，在轉基因植物中也能產(chǎn)生dsRNA，因此能有效的提高RNAi載體的抗病毒效率。
[0022]4)本發(fā)明構建的RNAi表達載體pSW-LS為首次報道，通過基因槍或農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化，可獲得高效、廣譜同時抗PRSV和PLDMV兩種病毒病的新種質。
【專利附圖】

【附圖說明】[0023]圖1為長、短片段在人工合成嵌合基因中的相對位置示意圖；
圖2為長、短片段PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；L:長片段PCR擴增產(chǎn)物；S:短片段PCR擴增產(chǎn)物；
圖3為克隆載體PCR鑒定；泳道1-2:pMD18-S ;泳道3-4:pMD19_L ；
圖4為克隆載體雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳；I為pMD18-S (EcoRI + NcoI) ;2為PMD19-L (EcoRI + Kpn)；
圖5為中間載體PMD18-LS雙酶切(EcoRI + NcoI)后瓊脂糖凝膠電泳；
圖6為發(fā)夾結構示意圖；
圖7為中間載體pRTL-LS雙酶切WcoR I + Sal I)后瓊脂糖凝膠電泳；
圖8為表達載體pSW-LS單酶切(Pst I)后瓊脂糖凝膠電泳；
圖9為載體質粒pSW4i的圖譜示意圖；
圖10為載體質粒pRTL-Sall的圖譜示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。下述實施實例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0025]實施例1:嵌合基因的設計和合成
通過對GenBank中的兩種病毒PRSV和PLDMV的多條基因組全長基因組序列進行比對，篩選兩種病毒基因組范圍內(nèi)的多個共同保守區(qū)域。另外，根據(jù)相關文獻報道PRSV和PLDMV編碼的Nib蛋白對病毒復制起關鍵作用，并在各病毒株系中比較保守。而這兩種病毒編碼的Hc-Pro蛋白不僅具有蛋白酶活性，作為蚜傳輔助因子參與病毒蚜傳過程，調節(jié)病毒中宿主體內(nèi)的轉移，并且是馬鈴薯Y病毒屬病毒的沉默抑制子，在病毒復制、宿主癥狀表達及增強異源病毒復制等方面發(fā)揮作用。
[0026]本發(fā)明設計針對這兩種病毒的Nib和Hc-Pro基因選擇了祀定區(qū)域。最終選定的病毒序列信息見表 1，按照 PRSVtV^ 1-PRSVtV27?2-PLDMVtV27?1-PLDMVTVi^-PRSV-VcT0TO-PLDMV-汝-/￥0的排列順序連接成總長為621 bp的序列(如SEQ ID N0.1所示)，即為人工合成的嵌合基因。 [0027]表1各病毒序列的相關信息
【權利要求】
1.一種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因，其特征在于，通過對GenBank中危害番木瓜的兩種病毒PRSV和PLDMV的多條基因組全長基因組序列進行比對，篩選兩種病毒基因組范圍內(nèi)的共同保守區(qū)域，分別針對PRSV和PLDMV的復制酶和輔助成分蛋白基因汝-/￥o，按照 PRSVtV^7-PRSVtW於-PLDMVTViW-PLDMVTVi於-PRSV-汝-/￥o-PLDMV-#c-Pro的排列順序，連接成總長為621 bp的基因序列，如SEQ ID N0.1所示。
2.一種同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表達載體，其特征在于，由權利要求1所述包含PRSV、PLDMV的取Hc-Pro保守區(qū)域的人工合成嵌合基因及載體質粒pSW4i構成。
3.權利要求2所述同時靶標番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: O首先以嵌合基因為模板，用高保真Taq酶進行PCR反應獲得兩個長度不同的長片段和短片段；為使用酶切鑒定的方法判斷短片段的插入方向，在短片段的正向引物中插入NcoI位點；在長片段的正反向引物中分別添加酶切位點EcoRI和ΚρηΙ，使長片段定向插入PMD18-T載體上的EcoRI和KpnI之間； 2)短片段和長片段與克隆載體連接，分別命名為PMD18-S和pMD19-L ;分別用EcoRI和KpnI對pMD19-L和pMD18_S進行雙酶切后，回收pMD19_L的小片段和pMD18_S的大片段；兩個片段連接轉化形成含有目的發(fā)夾結構的克隆載體，命名為PMD18-LS ;用EcoRI和SalI對pMD18-LS進行 雙酶切，回收含有發(fā)夾結構的小片段并與經(jīng)同樣雙酶切的克隆載體pRTL-Sall的大片段連接，構建成中間載體pRTL_LS ;pRTL_LS經(jīng)PstI單酶切回收含發(fā)夾結構的目的片段，與載體質粒pSW4i經(jīng)PstI酶切后的回收產(chǎn)物連接，經(jīng)電泳檢測并測序驗證RNAi植物表達載體pSW-LS構建成功。
【文檔編號】C12N15/62GK103952423SQ201410144401
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權日:2014年4月11日
【發(fā)明者】張秀春, 劉志昕, 張雨良, 王健華 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所