一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體的說是一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應(yīng)用。元件為嗜熱II型內(nèi)含子元件TeI3c-4c，其由序列表SEQ ID NO.1和2中核酸序列所示。利用所述嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶載體應(yīng)用于嗜熱微生物中，進(jìn)而使嗜熱微生物基因靶向失活。本發(fā)明利用Thermotargetron應(yīng)用于嗜熱微生物的基于II型內(nèi)含子的靶向基因失活工具。具有基因失活效率高、可輕松改變靶位點(diǎn)（打靶載體構(gòu)建周期短）、宿主范圍廣（可用于革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌中）、無需營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記、對(duì)轉(zhuǎn)化效率要求低、可對(duì)較短基因序列進(jìn)行失活（100-200bp）低等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體的說是一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件 及其載體和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 基于targetron系統(tǒng)的基因敲除方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短、效率高、無需抗性篩 選、對(duì)轉(zhuǎn)化效率要求低等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)同源重組方法的缺點(diǎn)，已廣泛的應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和 工程菌株的改造。
[0003] II型內(nèi)含子基因失活的原理是RNA "歸巢（retrohoming)"，以LI. LtrB內(nèi)含子為 例，II型內(nèi)含子的基因失活分兩階段進(jìn)行（參見圖1):1) LI. LtrB內(nèi)含子(核酶）自我切割 形成"套索"結(jié)構(gòu)；2)自我剪切形成"套索"結(jié)構(gòu)的II型內(nèi)含子與具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的IEP (intron-encoded protein)蛋白結(jié)合，形成RNP復(fù)合體。RNP復(fù)合體識(shí)別特定的DNA序列， 并將內(nèi)含子RNA序列插入識(shí)別位點(diǎn)的DNA正義鏈。IEP部分消化反義鏈，并以內(nèi)含子RNA為 模板，剩余反義鏈DNA為引物，逆轉(zhuǎn)錄出與內(nèi)含子RNA互補(bǔ)的cDNA序列。隨后內(nèi)含子RNA 被胞內(nèi)RNA酶消化，最后DNA正義鏈缺口被胞內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，完成內(nèi)含子的基因失活 過程[1]。
[0004] 目前嗜中溫targetron技術(shù)已廣泛應(yīng)用與多種微生物的基因祀向失活，但目前使 用的targetron系統(tǒng)，都是建立在嗜中溫（37°C -42°C) II型內(nèi)含子元件的基礎(chǔ)上，這種中 溫II型內(nèi)含子元件，在高溫條件下（48°C -65°C)不能工作，因此不能應(yīng)用嗜熱微生物(如 C.thermocellum)中[2, 3]。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件及其載體和應(yīng) 用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0007] -種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件，元件為嗜熱II型內(nèi)含子元件 TeI3c-4c,其由序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示。
[0008] -種適用于嗜熱微生物遺傳改造的載體，載體為具有嗜熱微生物遺傳改造的基因 元件打靶載體，其含有復(fù)制起始位點(diǎn)、耐熱復(fù)制蛋白、多克隆位點(diǎn)、嗜熱II型內(nèi)含子元件 TeI3c_4c和啟動(dòng)子元件。
[0009] 所述嗜熱II型內(nèi)含子元件TeI3c_4c為序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示； 啟動(dòng)子源于嗜熱微生物啟動(dòng)子。
[0010] 進(jìn)一步的說，嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶載體以PHK質(zhì)粒為骨架，含有 嗜熱II型內(nèi)含子元件TeI3c-4c和groEL啟動(dòng)子。
[0011] 所述PHK質(zhì)粒為以pNW33N (BGSC)質(zhì)粒為骨架，含有多克隆位點(diǎn)、ColEl復(fù)制起點(diǎn) (Rep Origin)、repB耐熱（50°C?55°C)復(fù)制蛋白和氯霉素抗性的氯霉素轉(zhuǎn)乙?；福–AT) 基因，能夠在大腸桿菌-熱纖梭菌中穿梭復(fù)制。
[0012] 所述含有多克隆位點(diǎn)為 PstI, NarI, SmaI, BamHI, XhoI, EcoRI, XbaI, HindIII, KpnI ，NdeI 和 NheI。
[0013] 一種嗜熱微生物遺傳改造的應(yīng)用，利用所述嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶 載體應(yīng)用于嗜熱微生物中，進(jìn)而使嗜熱微生物基因靶向失活。
[0014] 由所述嗜熱微生物遺傳改造的基因元件打靶載體中基因元件與嗜熱微生物的識(shí) 別位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而使嗜熱微生物基因靶向失活。
[0015] 所述識(shí)別位點(diǎn)為1)革E DNA識(shí)別位點(diǎn)17個(gè)堿基具有WAAnnnnnnnnnnnnnn( W=A或T， N=A，T，G，C)特征，確保能夠被TeI3c-4c正確識(shí)別；2) TeI3C-4cII型內(nèi)含子元件EBS1，2, 3 與靶序列IBS1，2, 3 (DNA)滿足Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，確保能被RNA正確識(shí)別。
[0016] 所述識(shí)別位點(diǎn)為WAAnnnnnnnnnnnnnA/T/G/C，W代表A或T堿基，η代表任意堿基， A/T/G/C表示EBS3序列可以為任意一種堿基。
[0017] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 本發(fā)明利用Thermotargetron應(yīng)用于嗜熱微生物的基于II型內(nèi)含子的祀向基因 失活工具。具有基因失活效率高、可輕松改變靶位點(diǎn)（打靶載體構(gòu)建周期短)、宿主范圍廣 (可用于革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌中）、無需營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記、對(duì)轉(zhuǎn)化效率要求低、可對(duì)較短 基因序列進(jìn)行失活（100_200bp)低等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為Targetron工作原理圖，其中，左圖顯示II型內(nèi)含子通過兩次轉(zhuǎn)酯化反應(yīng) 自我拼接成RNA "套索"結(jié)構(gòu)；右圖顯示內(nèi)含子RNA "套索"與IEP蛋白形成RNP蛋白復(fù)合 體，RNP復(fù)合體通過反向拼接、反義鏈消化、cDNA合成、DNA修復(fù)四步完成內(nèi)含子的歸巢。
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的pHK質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜，由pNW33N (BGSC)質(zhì)粒改造而 來，在刪除了 CAT基因和ColEl之間的一段760-bp的冗余序列的同時(shí)加入多克隆位點(diǎn)。其 中，Rep Origin質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；CAT氯霉素抗性基因；r印B為復(fù)制蛋白；MCS為多克隆位點(diǎn)： PstI, NarI, SmaI, BamHI, XhoI, EcoRI, XbaI, HindIII, KpnI, NdeI 和 NheI。
[0021 ] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的用于熱纖梭菌基因打祀thermotargetron質(zhì)粒 pHK-TTIA;其中，TeI3c II型內(nèi)含子及TeI4c RT酶使用熱纖梭菌來源的groEL啟動(dòng)子啟動(dòng) 表達(dá)。
[0022] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的嗜熱II型內(nèi)含子在大腸桿菌中不同溫度下"歸巢" 效率測(cè)定原理圖；在大腸桿菌宿主細(xì)胞E. coli HMS174DE3中借助TeI3c-4c供體質(zhì)粒 (pA⑶2X-TeI3C-4c)，受體質(zhì)粒（pBRR-3c (具有氨芐抗性，ampK))系統(tǒng)我們測(cè)定了溫度對(duì) TeI3C-4cII型內(nèi)含子在大腸桿菌中的歸巢效率的影響。我們?cè)赥eI3c內(nèi)含子DIV區(qū)插入 一段?啟動(dòng)子（acgcgtaatacgactcactataggg)(圖6)，并克隆進(jìn)入質(zhì)粒pAO)2X中獲得 TeI3c-4c II 型內(nèi)含子供體質(zhì)粒pACD2X-TeI3c-4c ;受體質(zhì)粒pBRR-3c(ampR)含有TeI3c-4c II型內(nèi)含子"E1-E2"識(shí)別序列且緊接一段無啟動(dòng)子的四環(huán)素抗性（tet K)基因。一旦TeI3c 內(nèi)含子"歸巢"至受體質(zhì)粒"E1-E2"位點(diǎn)，tetR基因即啟動(dòng)表達(dá)使得菌落具有 性（圖4)。因此不同溫度下ampK與tet K雙抗性菌落數(shù)量與ampK抗性菌落數(shù)量的比值即是 TeI3c-4c的"歸巢"效率即歸巢效率=(TetK+AmpK) /AmpK。
[0023] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的Thermotargetron重新編碼圖，其中Thermotargetron 重新編碼分為三步。第一步，在祀基因序列中尋找thermotargetron識(shí)別位點(diǎn) WAAnnnnnnnnnnnnnA (W表示A/T，η表示任意堿基)，確定打祀位點(diǎn)；第二步，根據(jù)祀位點(diǎn)設(shè) 計(jì)TeI3c-4c內(nèi)含子IBS1，2, EBS1，2(RNA)突變引物（圖6,圖8);第三步，通過重疊 （overlap PCR)獲得）獲得IBS1，2 (RNA)，EBS1，2突變的PCR擴(kuò)增片段（兩端具有Spel，BsiwI酶切位 點(diǎn)）；第四步，PCR擴(kuò)增片段SpeI-BsiWI雙酶切后替換pHK-TTIA對(duì)應(yīng)片段，即獲得特異靶 DNA 位點(diǎn) thermotargetron 打祀載體。
[0024] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的基因元件TeI3c_4c結(jié)構(gòu)圖，包括Thermotargetron的 組成元件TeI3c II型內(nèi)含子和TeI4c RT酶。（A)TeI3c II型內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)展 示了為完成"歸巢"試驗(yàn)和構(gòu)建thermotargetron所做的一些突變。小寫字母表示不同于 野生型TeI3c II型內(nèi)含子序列；IBS1/2/3外顯子堿基用帶邊框的字母表示，且標(biāo)明不同 的類型；質(zhì)粒構(gòu)建過程中使用的酶切位點(diǎn)使用粗體表示；在內(nèi)含子DIV區(qū)插入的T7啟動(dòng)子 (acgcgtaatacgactcactataggg)用斜體表示；希臘字母對(duì)應(yīng)的堿基參與內(nèi)含子形成三級(jí)結(jié) 構(gòu)的形成；在DIVa區(qū)的兩個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)（陰影方框)可能形成如圖所示的假結(jié)（pseudoknot)。 (B)TeMc RT的一級(jí)結(jié)構(gòu)，該酶幫助前體TeI3c RNA完成自我拼接和"歸巢"。RT酶結(jié)構(gòu)域具 有很高的保守型，黑框標(biāo)示的RT1-7編碼RT酶"finger and palm"結(jié)構(gòu)域，其中RT-0, RT-2a (斜陰影)相對(duì)non-LTR-retroelement RTs具有保守性[4-6] ;X/Thumb與D結(jié)構(gòu)域參與DNA 結(jié)合；。RT與X/Thumb結(jié)構(gòu)域可以特異的與內(nèi)含子RNA結(jié)合，具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，并且在 RNA拼接過程中穩(wěn)定RNA核酶活性與結(jié)構(gòu)，幫助II型內(nèi)含子歸巢至特異DNA靶點(diǎn)；D結(jié)構(gòu)域 主要承擔(dān)DNA靶位點(diǎn)識(shí)別的功能；En結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA內(nèi)切酶切割靶DNA反義鏈，形成II型內(nèi) 含子RNA逆轉(zhuǎn)錄引物。
[0025] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例提供的溫度對(duì)TeI3c-4c歸巢效率的影響圖，其中，溫度對(duì) TeI3c_4c歸巢效率的影響。用于歸巢試驗(yàn)的供體質(zhì)粒為pACD2X-TeI3c-4c (Targetel為 野生型祀位點(diǎn)，Targete2為IacZ基因祀位點(diǎn)）。供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli HMS174(DE3)宿主細(xì)胞后，在不同溫度使用500 μ M IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)后，使用歸巢試驗(yàn)方法 計(jì)算歸巢效率。TeI3C-4cII型內(nèi)含子，對(duì)于兩個(gè)打靶位點(diǎn)在42°C以下其歸巢效率都為0,當(dāng) 溫度超過45°C時(shí)歸巢效率急劇升高，48°C達(dá)到100m。以上結(jié)果表明來源于嗜熱藍(lán)聚藻來源 的TeI3c-4c II型內(nèi)含子歸巢活性具有高溫依賴性。
[0026] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例提供的TeI3c-4c堿基識(shí)別規(guī)律圖，其中，TeI3c-4c II型內(nèi) 含子的靶DNA識(shí)別規(guī)律。（A)野生型TeI3c II型內(nèi)含子的DNA識(shí)別位點(diǎn)，-13-+1位點(diǎn) 之間的堿基序列為表示RNA識(shí)別區(qū)域，-14, -15位堿基為IEP蛋白識(shí)別區(qū)域。IBS1，2, 3 表示內(nèi)含子結(jié)合位點(diǎn)1，2,3 (intron-binding sitesl，2,3)，EBSl，2,3表示外顯子結(jié)合 位點(diǎn)1,2,3 (Exon-binding sitesl, 2, 3)，箭頭表示內(nèi)含子在祀DNA序列中的插入位點(diǎn) (intron-insertion SiteX(B)TeMc RT在DNA祀序列中的識(shí)別位點(diǎn)。在大腸桿菌（E. coli HMS174DE3)宿主中，使用TeI3c-4c II型內(nèi)含子供體質(zhì)粒pADC2X-TeI3c-4c對(duì)隨機(jī)受體質(zhì) 粒庫(kù)（pBRR-3c，靶位點(diǎn)-35--13/+2- 20為隨機(jī)堿基，+1--12為野生型IBS1，IBS2)進(jìn)行 基因打靶。IPTG誘導(dǎo)完成后，涂布氨芐青霉素/四環(huán)素抗性平板，獲得的陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒 定，統(tǒng)計(jì)TeI3c RT識(shí)別靶DNA序列的偏好性。105個(gè)發(fā)生歸巢事件的靶序列在不同位點(diǎn)的 堿基出現(xiàn)頻率使用WebLogo表示（100未篩選的打靶序列作為矯正對(duì)照）[7]。該結(jié)果表明 IEP蛋白識(shí)別位點(diǎn)具有明顯的AA堿基對(duì)識(shí)別偏好性[8]。（ C)IBS3 (DNA)與EBS3不同的堿 基配對(duì)類型對(duì)TeI3c-4c II型內(nèi)含子歸巢效率的影響。將供體質(zhì)粒pACD-TTIA，pACD-TTIC， pACD-TTIG，or pACD-TTIT 與受體質(zhì)粒pBRR-3cA(WT, IBS3A)，pBRR-3cC, pBRR-3cG, pBRR-3cT 共同轉(zhuǎn)化E. coli HMS174 (DE3)(表I )，采用歸巢試驗(yàn)相同方法，計(jì)算不同IBS3與EBS3堿基 配對(duì)類型對(duì)歸巢效率的影響。EBS3與IBS3 (DNA)不同配對(duì)方式對(duì)歸巢效率的影響如矩陣圖 所示，野生型的A-U配對(duì)用粗體字表示，淺陰影方格內(nèi)為對(duì)應(yīng)堿基互補(bǔ)配對(duì)是的歸巢效率， 白色方格表示堿基之間不形成互補(bǔ)配時(shí)的歸巢效率。該結(jié)果顯示，EBS3與IBS3(DNA)形成 堿基互補(bǔ)配對(duì)是保證高"歸巢"效率（22%-106%)的必要條件。
[0027] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例提供的IacZ基因不同的thermotargetro識(shí)別位點(diǎn) (60a，369a，2586a)，其中the;rmotarget;ronLacZ60a，lacZ369a，lacZ2586aTeI3cEBS與 IacZ基因 IBS(DNA)靶序列的相互作用。野生型TeI3c與靶DNA的識(shí)別在最上方展示；灰 色陰影表示與野生型對(duì)應(yīng)位點(diǎn)堿基相同；IacZ基因使用方框表示，箭頭（IS)及數(shù)字表示 TeI3c II型內(nèi)含子在IacZ基因中的插入位點(diǎn)，用于Southernblot檢測(cè)的Apal，EcoRI酶切 位點(diǎn)位于基因兩側(cè)。
[0028] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例提供的TeI3c-4c II型內(nèi)含子"歸巢"效率與誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān) 系圖，其中 thermotargetron LacZ60a, lacZ369a, lacZ2586a轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli HMS174(DE3) 細(xì)胞后使用500mM IPTG于48°C誘導(dǎo)不同的時(shí)間。歸巢效率為白斑與總菌落數(shù)的比值；表 中的比值表示II型內(nèi)含子單插入突變株數(shù)量/總插入突變株數(shù)量。
[0029] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例提供的IacZ突變株P(guān)CR鑒定圖，其中，PCR檢測(cè)8個(gè)克?。? 個(gè)籃斑（B)和6個(gè)白斑（W))并使用野生型E. coli HMS174(DE3)菌株作為對(duì)照。使用外側(cè) 引物與TeI3c內(nèi)部檢測(cè)引物檢測(cè)時(shí)（lacZ60a使用LacZ30s和Te680rc引物檢測(cè)；lacZ369a 使用 LacZ30s 和 Te680rc 引物檢測(cè)；lacZ2586a 使用 lacZ3060a 和 TeI3c608rc 引物檢測(cè)， 表2)，在TeI3c內(nèi)含子插入后可觀察到PCR條帶（白斑有檢測(cè)條帶)，野生型和藍(lán)斑無檢 測(cè)條帶；使用插入位點(diǎn)兩端引物檢測(cè)時(shí)（lacZ60a使用LacZ30s和LacZ1850as引物檢測(cè)； lacZ369a 使用 LacZ30s_LacZ1850as 引物檢測(cè)；lacZ2586a 使用 LacZ1850s_LacZ3060as 引 物檢測(cè)，表2)，白斑由于外源DNA的插入PCR條帶增大，且增大的數(shù)值正好為II型內(nèi)含子 RNA的長(zhǎng)度。
[0030] 圖12為本發(fā)明實(shí)施例提供的Southernblot檢測(cè)效果圖，其中，Southerblot檢測(cè) 8個(gè)克?。?個(gè)籃斑（B)和6個(gè)白斑（W))并使用野生型E. coli HMS174(DE3)菌株作為對(duì)照。 分別檢測(cè)48°C誘導(dǎo)15-30分鐘的LacZ60a, lacZ369a轉(zhuǎn)化子或誘導(dǎo)1小時(shí)的lacZ2586a轉(zhuǎn) 化子。使用32P標(biāo)記的DNA探針雜交Apal，EcoRI雙酶切的基因組DNA并顯影（IacZ基因 探針：30nt_185nt或TeI3c intron探針：lnt_342nt);當(dāng)使用IacZ基因探針時(shí)，白斑（含 TeI3c)雜交條帶理論大小為4. 5-kb，藍(lán)斑(不含TeI3c)雜交條帶理論大小為3. 7kb。使用 TeI3c探針時(shí)，理論雜交條帶大小為4. 5kb ;出現(xiàn)多條雜交條帶提示有TeI3c脫靶。
[0031] 圖13為本發(fā)明實(shí)施例提供的Thermotargetron基因打祀（失活）原理圖，其中， Thermotargetron質(zhì)粒TeI3c II型內(nèi)含子和TeI4c RT由熱纖梭菌組成型啟動(dòng)子PgroEL 啟動(dòng)表達(dá)。TeI3c基因轉(zhuǎn)錄出具有核酶活性的II型內(nèi)含子RNA ;RT酶基因轉(zhuǎn)錄出RT酶。 TeI3c RNA與RT酶結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP) ;RNP可以特異的識(shí)別靶DNA5'，3'外 顯子（ΕχοηΓ，Exon2' )，插入DNA正義鏈并部分消化反義鏈。RT酶以剩余反義鏈為引物，內(nèi) 含子RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出RNA的cDNA序列；最后通過宿主DNA修復(fù)機(jī)制完成"歸巢"；由于 II型內(nèi)含子DNA內(nèi)部有許多終止密碼子（TAA)所以能夠在蛋白水平上終止目的基因的表 達(dá)，該過程稱為thermotargetron基因打祀或thermotargetron基因失活。
[0032] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例提供的在熱纖梭菌中成功打祀的thermotargetron識(shí)別序 列及打祀效率圖，其中，圖示7個(gè)不同基因的thermotargetron識(shí)別位點(diǎn)、EBS/IBS相互作 用和"歸巢"效率。7個(gè)不同基因及其編碼產(chǎn)物分別為：(^?4((：1 〇1313_0627)，(^11111〇8〇1^ scaffoldin protein;hfat (Clol313_2343), hypothetical formate acetyltransferas e; hyd (C1〇1313_0554)，hydrogenase;Idh(Clo1313_1160)，lactate dehydrogenase;pta( Clol313_1185), phosphotransacetyIase;pyrF(Clol313_1266), orotidine5' -phosphate decarboxylase。野生型TeI3c的識(shí)別序列在圖片頂端展示；灰色陰影的堿基表示與野生型 TeI3c II型內(nèi)含子識(shí)別序列相同；箭頭表示thermotargetron插入位點(diǎn)；歸巢效率等于發(fā) 生特異設(shè)計(jì)位點(diǎn)基因失活的轉(zhuǎn)化子占 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的比例，標(biāo)示在圖片的右側(cè)。
[0033] 圖15為本發(fā)明實(shí)施例提供的熱纖梭菌基因被thermotargetron失活示意圖，其 中，（A) 7個(gè)熱纖梭菌基因被thermotargetron失活示意圖?；蚪MDNA使用平行的線條 表不，基因的5端，3端標(biāo)不在基因的兩端；基因 ORF使用帶箭頭的空心方框表不，箭頭方 向表示基因的轉(zhuǎn)錄方向。使用實(shí)心黑色方框表示插入基因組中的II型內(nèi)含子基因，與ORF 空心方框交界處用黑色箭頭(短）標(biāo)示出II型內(nèi)含子基因的插入位點(diǎn)。外側(cè)檢測(cè)引物（黑 色箭頭）橫跨插入位點(diǎn)且任意一條引物與插入位點(diǎn)的距離至少是200bp。內(nèi)側(cè)的檢測(cè)引物 (Te680rc)與II型內(nèi)含子基因正義鏈互補(bǔ)（658nt675nt)。外側(cè)引物檢測(cè)野生型或突變株的 PCR產(chǎn)物大小如圖右側(cè)所示。（B)使用菌落PCR方法檢測(cè)7個(gè)基因突變株。泳道1，外側(cè)引 物檢測(cè)野生型熱纖梭菌DSM1313菌株；泳道2,外側(cè)引物檢測(cè)突變株（如檢測(cè)CipA基因失 活的外側(cè)引物對(duì)為CipA1827s-F與CipA1827s-R，表2);泳道3,以外側(cè)正向引物與Te680rc 引物檢測(cè)突變株（如檢測(cè)CipA基因失活的外側(cè)-內(nèi)側(cè)引物對(duì)為CipA1827s-F與Te680rc， 表2) ;M，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0034] 圖16為本發(fā)明實(shí)施例提供的Southerblot檢測(cè)TeI3c DNA在不同熱纖梭菌 DSMl 313突變株中的拷貝數(shù)，其中，Southerb lot檢測(cè)Te 13c對(duì)特異靶位點(diǎn)失活過程中是 否存在"脫靶"現(xiàn)象。提取thermotargetron突變株基因組DNA并使用BamHI，EcoRI雙 酶切后在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離的DNA片段轉(zhuǎn)印至尼龍膜上（Hybond-NX，GE Healthcare)與地高辛標(biāo)記的TeI3c DNA特異探針（539nt_710nt)雜交過夜并顯色 (DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I, RocheXM, DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)。Southernblot結(jié)果表明，在熱纖梭菌中thermotargetron的"脫祀"率為50%左右（單 插入菌株/單插入菌株+多插入菌株）

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下述實(shí)施例所涉及的質(zhì)粒與引物具體參見表1和表2。同時(shí)所涉及的大腸桿菌 菌株 E.coli HMS174(DE3) (Novagen)用于"歸巢（retrohoming assays)，'試驗(yàn)，DH5Ct (Life Technologies)用于基因克隆。E.coli細(xì)胞置于Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng) (37°C，200rpm)。用于質(zhì)粒篩選的抗生素濃度為：氨節(jié)青霉素（ampicillin，amp)，100yg/ ml ;氣霉素（chloramphenicol, chi)，25-50 μ g/ml，四環(huán)素（tetracycline, tet) 25 μ g/ml 〇
[0036] 熱纖梭菌（Clostridium thermocellum DSM1313)菌株在改進(jìn)的 GS-2 培 養(yǎng)[9]中培養(yǎng)，IL GS-2 培養(yǎng)基的配方為：KH2P041. 5g，K2HP04 · 3H202. lg，Urea2. lg， MgC12 · 6H201. 0g，CaC12 · 2H20150mg，F(xiàn)eS04 · 6H201. 25mg，Cysteine-HCllg，MOPS-NalOg， Yeast extract6. 0g，Trisodiumcitrate · 2H203. 0g，ResazurinO. lmg，5. 〇-10g/l 纖維二糖 (GS-2-CB)或微晶纖維素（GS-2-AV)作為主要碳源，pH7.4。熱纖梭菌采用半固體包埋法涂布 平皿[10, 11]，半固體瓊脂濃度為0. 8%(w/v)(GS-2-CB-SS)。質(zhì)粒篩選時(shí)高溫條件下，使用 更穩(wěn)定的甲砜氯霉素（thiamphenicol)代替氯霉素（chloramphenicol),作為篩選抗生素， 其濃度為3-6 μ g/ml。培養(yǎng)基配制完成后，分裝至200ml厭氧瓶中，并使用高純氮（99. 999%) 爆氣5min，除去培養(yǎng)基中的溶氧，迅速蓋上橡膠塞，115°C滅菌高壓蒸汽滅菌20min備用。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 全基因合成嗜熱II型內(nèi)含子元件TeI3c-4c :
[0039] 嗜熱藍(lán)聚藻 BP-1 菌株（Thermosynechococcus elongates BP-1)含有 28 種 IIB 型內(nèi)含子。他們親緣關(guān)系很近，被認(rèn)為是由同一祖先進(jìn)化而來，橫向轉(zhuǎn)移進(jìn)入該微生物的 基因組中[8，12，13]。其在全序列合成了了613〇11型內(nèi)含子基因（873拉，5'端5?61，3' 端PstI)的同時(shí)將其20, 319, 321，337, 339位A，T，A，T，A序列分別突變?yōu)門，A，G，C，T形成 SpeI-BsiwI 酶切位點(diǎn)（序列）。SpeI-BsiwI 酶切片段長(zhǎng) 357bp，覆蓋 IBS1-IBS2, EBSl, EBS2， 可以通過酶切連接快速的替換成靶DNA識(shí)別序列。另外，野生型TeI3c本身不編碼RT酶， TeI4c編碼的RT酶可以促進(jìn)TeI3c的"歸巢（retrohoming)"。因此全序列合成了編碼TeI4c 的RT酶的基因（1701nt，5'端PstI, 3'端Xhol，序列)并連接至TeI3c下游，形成TeI3c-4c 內(nèi)含子（Tel3c的intron，Tel4c的RT酶，圖6)，用于構(gòu)建嗜熱t(yī)argetron。
[0040] SEQ ID NO. 1 所示為 TeI3c DNA，5'SpeI_3'PstI 的核酸序列：
[0041] actagtaacacccctatcagggtgcgacgcgaaagctagccagatgattgtcccactagcccaacaagc tagaacgggaccggttgttcccccaaccgtagcctaaggaggcatgcgtgactggtaacggtcaggtatgaagccct cccgacaatgaagcccgaaccggaaggttggagccgaatccgtgaggaggaagcaacttcaccagcgtcaggtgata gggagctaggcttgagggtatggtgaacgcaagtgaagtgacgctagaagcctcgttagggtgagcaggccaaagat gctgataggcctgagccaaaatggcaaagcggattggatacgctgctcctgattcagcgtacggggacagcaactcc gccggggtatagtcaccacctaacccctcgtgtcatctggttggaacgcggtaagcccgtatcttcgccttgaacat tcaaggcaggcaaaccgtaaggaatgctgatgggggtgcgggtagaggaggtgggaaaaagcgaatgctagcctgta atgggctagatagggattgagaatgctggcaggacattcaacatcatcccactcgaaagagggcagacttcccgccg gtccccccttacgagaaagtctatagaaccttcctaatggtgacaatgcaaatggcggtgatcttgagtcactggtg cggtcaccaacctgctcaaaaggtagagaggctgtagatgagtatcgtaaaggttgcatgcacaaccggttcctctt aaatgaggggtcctggggggctcgagccggatgcggggaaacttgcacgtccggttcctagggggctagggggcagc gatgcccccctgctacccgacaatgacgctgcag
[0042] (a)序列特征：
[0043] ?長(zhǎng)度：873
[0044] 籲類型：核酸序列
[0045] ?鏈型：?jiǎn)捂?br> [0046] ?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0047] (b)分子類型：DNA
[0048] (c)假設(shè)：否
[0049] (d)反義：否
[0050] (e)最初來源：嗜熱藍(lán)聚藻
[0051] SEQ ID NO. 2 所示為 TeI4c RT DNA, 5'PstI-3'XhoI 的核酸序列：
[0052] ctgcaggaaggagatatacatatgacggtggaccaaaccactggtgcggtcaccaaccaaacggaaaca agetggcacagcataaactggaccaaagccaaccgtgaggtaaagaggctgcaagtgcgtatcgcaaaggctgtgaa ggaaggacgctggggcaaagtgaaagctttgcaatggctcctgacccactcgttctacggcaaagccctcgccgtga aacgggtaactgacaactcaggcagtagaacacctggtgtggacgggataacctggtccacacaagagcagaaaacc caagccataaagtccctcaggagaagaggctataaaccccaacccctgaggcgggtatacatcccgaaagcaaacgg caaacagcgcccgctaggaatcccgacaatgaaggacagggcaatgcaggcactatatgccctagccctagaaccag tcgcggaaaccacagcggaccggaactcctatgggttccgccgagggcgatgtacggcagatgcggcaggacaatgc ttccttgctctggcaaaagccaagtcggctgaacacgtccttgacgctgacatatccggatgctttgataacatcag ccatgagtggctactagccaacactccactggacaaagggatcttacggaaatggcttaaatctgggttcgtctgga aacagcaactcttccccacccatgctgggacacctcagggaggggtaatctccccagttcttgccaatataacccta gatgggatggaagaactgttggccaaacacctcagaggtcaaaaagtcaacctcatccgatatgctgacgattttgt cgtgacgggaaaagatgaggaaaccctggagaaagccagaaacctaatccaggagttcctaaaagaacggggcttga ccctgtcccccgagaagacaaaaatcgtccatattgaggaaggcttcgactttctcggatggaacattcgcaagtac aacggggttcttctcatcaaacccgcgaagaagaacgtgaaagcgttcctcaagaaaatccgagacactctaaggga acttaggacagcaacccaggaaatcgtgatagacacactcaacccaatcattagaggttgggccaactatcacaaag gacaagtctctaaggaaaccttcaaccgagtggacttcgccacctggcacaaattgtggcgatgggcaaggcgccgg cacccaaacaaacctgcccaatgggtgaaggacaaatacttcatcaaaaacggaagcagagactgggtattcggtat ggtgatgaaagacaagaacggggaactgaggaccaaacgcctaatcaaaacctctgacacccgaatccaacgccacg tcaaaatcaaggcagacgccaatccgtttctcccagagtgggcagaatactttgagaaacgcaagaaactcaaaaaa gcccctgctcaatatcggcgcatccgccgagaactatggaagaaacagggtggtatctgtccagtatgcgggggtga aattgagcaagacatgctcactgacatccaccacatattgcccaaacacaagggtggttctgacgacctggataatc ttgtcttaatccacgccaactgccacaaacaggtgcacagccgagatggtcagcacagccggtccctcttgaaagag gggctttgactcgag
[0053] (a)序列特征：
[0054] ?長(zhǎng)度：1701
[0055] 籲類型：核酸序列
[0056] 籲鏈型：?jiǎn)捂?br> [0057] #拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0058] (b)分子類型：DNA
[0059] (C)假設(shè)：否
[0060] (d)反義：否
[0061] (e)最初來源：嗜熱藍(lán)聚藻
[0062] 實(shí)施例2
[0063] 基于TeI3c_4c的高溫微生物基因打靶載體pHK-TTIA的構(gòu)建一即 Thermotargetron
[0064] 構(gòu)建thermotargetron質(zhì)粒pHK-TTlA質(zhì)粒過程分三步：
[0065] 第一步，將 C. thermcellum 分子伴侶蛋白 CpnlO (C1〇1313_0432)啟動(dòng)子 PgroEL， 克隆至TeI3c intron/TeI4RT元件上游。具體過程為使用Ct_PgroEL5-BamHI, Ct_ PgroEL3-SpeI-XhoI-EcoRI引物（表2)從質(zhì)粒熱纖梭菌DSM1313基因組中擴(kuò)增groEL啟動(dòng) 子，PCR產(chǎn)物BamHI, EcoRI酶切后連接入pIKMl質(zhì)粒[14]獲得pIKMIPgroEL質(zhì)粒；
[0066] 第二步，將實(shí)例 1 合成的 897nt TeI3c 內(nèi)含子 DNA 序列（Spel/PstI)，SpeI, PstI 雙酶切后克隆進(jìn)入PlKMlPgroEL質(zhì)粒對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，獲得PIKMlPgr〇EL-TeI3 C質(zhì)粒；將實(shí) 例1合成的1710nt TeI4c RT酶基因序列（PstI/XhoI)，PstI，XhoI雙酶切后連接進(jìn)入 PIKMlPgroEL-TeI3c質(zhì)粒對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，獲得pIKMI-TTIA質(zhì)粒。
[0067] 第三步：EcoRI 和 BamHI 酶切 pIKMI-TTIA 質(zhì)粒，克隆 2. 8-kbPgroEL-TeI3c/TeI4c 元件至pHK對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，即獲得thermotargetron質(zhì)粒pHK-TTIA (參見圖3)。
[0068] 其中，基于TeI3c-4c的大腸桿菌打靶質(zhì)粒pAC2-TTlA，C，G，T的構(gòu)建分為兩步：
[0069] 第一步，pIKMI-TTIA質(zhì)粒Spel，PstI雙酶切片段(含Spel/BsiWI突變位點(diǎn)的 TeI3c)替換 pADC2X-TeI3c-4c 質(zhì)粒中[15]野生型 TeI3c 片段，獲得 pACD2X-TTlA 質(zhì)粒；
[0070] 第二步，構(gòu)建 pACD2X-TTlC，G，T 質(zhì)粒。C，G，T 表示 IBS3 堿基。以 pACD2X-TeI3c-4c 作為模板，使用TeI3cEBS3mutA，C，G，T/TeI3cIBS3mutT，G，C，A作為引物，突變TeI3c內(nèi)含 子IBS3 (RNA)和EBS3序列。PCR產(chǎn)物使用BsiWI和PstI酶切后，插入pAC2-TTlA質(zhì)粒中， 獲得 PACD2-TTI A, C，G，T 質(zhì)粒(表 1，表 2 )。
[0071] 實(shí)施例3
[0072] 以大腸桿菌為宿主測(cè)試嗜熱II型內(nèi)含子元件TeI3c_4c的功能：
[0073] 1)溫度對(duì)TeI3c_4c II型內(nèi)含子在大腸桿菌中的"歸巢"效率的影響 (TeI3c_4c "歸巢"試驗(yàn)）：
[0074] TeI3c_4c "歸巢"試驗(yàn)原理為：DIV區(qū)攜帶含有T7啟動(dòng)子 (acgcgtaatacgactcactataggg)的 TeI3c_4c 內(nèi)含子供體質(zhì)粒 pACD2X_TeI3c_4c[15](參見 圖4)可以識(shí)別并插入具有氨芐抗性的內(nèi)含子受體質(zhì)粒pBRR-3C El，E2(exon)位點(diǎn)(表1)。 PBRR-3C質(zhì)粒El，E2位點(diǎn)后攜帶一段沒有啟動(dòng)子的四環(huán)素抗性基因。當(dāng)供體質(zhì)粒的TeI3c 內(nèi)含子"歸巢"至受體質(zhì)粒El，E2位點(diǎn)后，其DIV區(qū)攜帶的T7啟動(dòng)子啟動(dòng)四環(huán)素抗性基因 的表達(dá)，使得發(fā)生內(nèi)含子"歸巢"的大腸桿菌菌株獲得四環(huán)素抗性，因此"歸巢"效率=四環(huán) 素+氨芐雙抗性菌落數(shù)/氨芐抗性菌落數(shù)[8]。
[0075] 具體過程為：
[0076] 將供體質(zhì)粒 pACD2X-TeI3c-4c (ChlK)和受體質(zhì)粒 pBRR-3c (AmpK)共同轉(zhuǎn)化 E. Coli HMS174(DE3)細(xì)胞[15]。轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物在5ml液體氨芐青霉素和氯霉素抗性（AmpK+Chl K) LB培養(yǎng)基37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜。取5 μ 1過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)Ih 后加入500 μ M終濃度的IPTG，置于37°C -48°C培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后稀釋至合適濃度涂布于氨 芐(AmpK)或氨芐-四環(huán)素（AmpK+Tet K)抗性平皿中，37°C培養(yǎng)過夜。供體質(zhì)粒內(nèi)含子"歸巢" 至受體質(zhì)粒E1，E2位點(diǎn)后，T7啟動(dòng)子隨TeI3c RNA "歸巢"至四環(huán)素抗性（tetK)基因上游， 即啟動(dòng)該基因的表達(dá)，從而使得發(fā)生RNA "歸巢"的菌株獲得四環(huán)素抗性，通過檢測(cè)群落中 四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量即可計(jì)算出嗜熱t(yī)argetron在不同溫度下的歸巢效率。"歸巢"效 率=(AmpK+TetK)/AmpK。為了排除自發(fā)突變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，E.Coli HMS174(DE3)對(duì)數(shù) 期細(xì)胞以50%接種量接種于含IPTG的抗性培養(yǎng)基中（AmpK+TetK，500 μ M IPTG)作為對(duì)照， 置于上述實(shí)驗(yàn)相同溫度下培養(yǎng)。
[0077] 使用上述方法測(cè)定了 TeI3c-4c在不同的誘導(dǎo)溫度下的"歸巢"效率(參見圖7)。 與1^1.1^池11型內(nèi)含子"歸巢"效率在371：以上迅速的降低不同[8]，1^13(3-4(311型內(nèi)含子 在高溫時(shí)歸巢效率逐漸提高。TeI3 C-4cII型內(nèi)含子在37°C時(shí)基本上沒有活性，但當(dāng)溫度提 高至>42°C其歸巢效率迅速提高至100% (參見圖7)
[0078] 2) Tel3c/4c內(nèi)含子靶位點(diǎn)識(shí)別規(guī)律及重新編碼：
[0079] ① Tel3c/4c內(nèi)含子隨機(jī)打靶實(shí)驗(yàn)
[0080] 將上述II型內(nèi)含子受體質(zhì)粒PBRR-3C靶位點(diǎn)-35--13/+2-20替換為隨機(jī)堿基， +1--12為野生型IBS1，IBS2位點(diǎn)替換成隨機(jī)序列(合成隨機(jī)序列)。進(jìn)行TeI3c-4c"歸巢" 試驗(yàn)（48°C)。具體過程為：將供體質(zhì)粒pACD2X-TeI3c-4c (ChlR)和受體質(zhì)粒pBRR-3c (隨 機(jī)，AmpK)共同轉(zhuǎn)化E. Coli HMS174(DE3)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物在5ml液體氨芐青霉素和氯 霉素抗性（AmpK+Chl K) LB培養(yǎng)基37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜。取5 μ 1過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至 相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)Ih后加入500 μ M終濃度的IPTG，置于48°C培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后稀釋至合 適濃度涂布于氨芐（AmpK)或氨芐-四環(huán)素（Amp K+TetK)抗性平皿中，37°C培養(yǎng)過夜。挑取四 環(huán)素/氨芐抗性的菌落進(jìn)行測(cè)序，分析TeI3c-4c II型內(nèi)含子高溫條件下（48°C )插入位點(diǎn) 的堿基偏好性。
[0081] TeI3c-4c對(duì)靶DNA位點(diǎn)的識(shí)別由TeI3c RNA(圖6)和RT酶共同決定(如圖8所示)。 TeI3c RNA可以識(shí)別靶DNA位點(diǎn)任意的IBS1，IBS2, IBS3序列但必須與TeI3c RNA EBS1， EBS2，EBS3滿足Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（圖8A)。如圖8-A所示TeI3c EBSl, 2位 點(diǎn)分別由6個(gè)和5個(gè)堿基組成且EBS2與EBSl間隔兩個(gè)隨機(jī)堿基，EBS3僅由1個(gè)堿基組成， 因此DNA祀位點(diǎn)IBS1，2, 3應(yīng)由14個(gè)隨機(jī)堿基組成（即ηηηηηηηηηηηηηη，η代表隨機(jī)堿基， 圖8-Α)。另外，隨機(jī)打靶實(shí)驗(yàn)表明TeI4c RT酶對(duì)IBS2上游-14, -15, -16位的WAA(W=A/ T)堿基具有偏好性(如圖8-B)，因此由TeI3c RNA(圖6)和RT酶共同決定的識(shí)別序列為 WAAnnnnnnnnnnnnnn(W=A/T, n=A/T/G/C)〇
[0082] 仔細(xì)觀察TeI3c II型內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)我們發(fā)現(xiàn)（圖6)，RNA內(nèi)部IBS3序列距離 IBS1，2 (RNA)，EBS1，2, 3序列較遠(yuǎn)，不能通過一次突變PCR重新編碼。又因?yàn)獒槍?duì)A，G，C，T 四種不同IBS3(DNA)的打靶質(zhì)粒pACD2-TTlA，G，C，T歸巢效率為22%-106% (圖8-C)，且 EBS3-IBS3為U-A配對(duì)時(shí)歸巢效率為100%。因此，為了方便嗜熱II型內(nèi)含子打靶載體的重 新編碼，進(jìn)而規(guī)定IBS3(DNA)為A，即TeI3c_4c識(shí)別序列為：WAAnnnnnnnnnnnnnA。
[0083] ②Thermotargetron載體重新編碼
[0084] 嗜熱II型內(nèi)含子打靶載體重新編碼是指：根據(jù)特異DNA靶 點(diǎn)（WAAnnnnnnnnnnnnnA) 突變TeI3c_4c II型內(nèi)含子革巴DNA識(shí)別序列 (EBS1，2, 3-IBS1，2, 3(RNA))，獲得特異DNA靶位點(diǎn)打靶載體的過程，通常分為三步：1)在靶 基因內(nèi)部尋找WAAnnnnnnnnnnnnnA識(shí)別位點(diǎn)；2)根據(jù)識(shí)別位點(diǎn)IBS2, I (DNA)，使用PCR方 法突變 TeI3c RNA 中的 EBS2, 1-IBS2, I (RNA) ;3) SpeI-BsiWI 雙酶切 PCR 片段（? 400-bp) 替換打靶載體的對(duì)應(yīng)區(qū)域(參見圖5)。
[0085] ③Tel3c/4c內(nèi)含子失活大腸桿菌中IacZ基因
[0086] 根據(jù)TeI3c_4c II型內(nèi)含子的祀DNA序列識(shí)別規(guī)律（WAAnnnnnnnnnnnnnA)構(gòu)建了 基于實(shí)施例2中pA⑶2X-TT1A質(zhì)粒的3個(gè)大腸桿菌β -半乳糖苷酶基因（IacZ)失活載體： lacZ60a，lacZ369a和lacZ2586a (圖9,表I) (a, s分別表示識(shí)別序列在反、正義鏈；阿拉伯 數(shù)字表示TeI3c插入位點(diǎn)p ;令基因起始密碼子第一位至IBS3 (包括A)的堿基數(shù)為n，當(dāng) 插入s鏈時(shí)p=n-l，插入a鏈時(shí)p=n)。IacZ基因打祀載體構(gòu)建僅需簡(jiǎn)單三步：1)在IacZ基 因序列中尋找WAAnnnnnnnnnnnnnA內(nèi)含子識(shí)別祀位點(diǎn)（圖8) ;2)根據(jù)祀位點(diǎn)IBSl, 2 (DNA) 序列，設(shè)計(jì)重疊 PCR(overlapPCR)引物，突變TeI3c內(nèi)部EBSl，2;IBSl，2(RNA)序列(表2， 如用于構(gòu)建 lacZ60a 的引物為 LacZ60aIBS12-TeI3cUNI，LacZ60aEBS2_LacZ60aEBSla，其中 TeI3cUNI為重編碼通用引物);3)將重疊 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SpeI-BsiWI酶切后置換打靶載體中 對(duì)應(yīng)區(qū)段，即完成特異基因打靶載體的構(gòu)建(表1)。
[0087] IacZ基因打靶載體構(gòu)建完成后，轉(zhuǎn)化E. coli HMS174(DE3)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng) 物轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中48°C培養(yǎng)1小時(shí)后使用IPTG誘導(dǎo)15min-lh，獲得的培養(yǎng)物稀釋涂布 在含有IPTG/X-gal的平皿上。由于IacZ基因可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)，使整個(gè)培養(yǎng)菌落變 藍(lán)，該基因失活后在IPTG/X-gal平板上形成的菌落為白色，因此白色菌落與總菌落數(shù)的 比值即為IacZ基因的失活效率（圖10)。進(jìn)一步使用lacZ30s/lacZ1850a, lacZ1850s/ lacZ3060a, lacZ3060a/TeI3c608rc，lacZ30s/TeI3c608rc，lacZ1850s/TeI3c420s (表 2)五 對(duì)引物檢測(cè)藍(lán)色或白色克?。↖acZ基因失活后失去將X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色顯色物質(zhì)的能力） (圖11)。連續(xù)傳代丟失IacZ突變株thermotargetron質(zhì)粒，使用southerblot檢測(cè)是否存 在內(nèi)含子"脫靶"現(xiàn)象（圖12)。
[0088] 通過以上實(shí)驗(yàn)測(cè)定了 500μΜ IPTG濃度下，不同誘導(dǎo)時(shí)間（15min-60min)對(duì)TeI3c 對(duì)IacZ基因的失活效率的影響。隨著IPTG量的增加和誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，白色菌落的數(shù)量逐 漸增加(誘導(dǎo)15分鐘，IacZ失活率0%-2%，誘導(dǎo)1小時(shí)，IacZ失活率14%-51%)(圖10)。檢 測(cè)PCR和測(cè)序結(jié)果顯示，所有白色克隆IacZ基因都被TeI3c-4c intron精確失活（圖11)。 另外，southern blot結(jié)果顯示，lacZ2586a在IPTG不同的誘導(dǎo)階段，對(duì)所有突變株中都為 單插入（圖12)。但是當(dāng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間超過30min后lacZ60a，lacZ369a出現(xiàn)了多插入的 情況（即存在TeI3c脫祀現(xiàn)象)。同樣的脫祀現(xiàn)象在LL LtrB和EcI5intron中是很少見的 [2, 3]。
[0089] 實(shí)施例4
[0090] 使用thermotargetron失活6個(gè)熱纖梭菌基因：
[0091] pHK-TTIA由大腸桿菌-熱纖梭菌穿梭質(zhì)粒pHK和嗜熱II型內(nèi)含子元件 (TeI3c-4c)組成，其靶向基因失活的原理與LI. LtrB II型內(nèi)含子相似（圖13)。
[0092] 選擇了熱纖梭菌中6個(gè)具有代表性的基因作為thermotargetron失活的革巴 基因，分別為纖維小體腳架蛋白基因 cipA (Cl〇1313_1827)，假定的甲酸脫氫酶的基因 hfat (Clol313_2343)，假定的氫酶的基因 hyd (C1〇1313_0554)，乳酸脫氫酶的基因 Idh (C1〇1313_1160)，磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因 pta (Clol313_1185)和乳清酸核苷-5'磷酸脫 羧酶 PyrF (Clol313_1266)(圖 14)。
[0093] 參照基因打祀載體重新編碼的步驟構(gòu)建了 7個(gè)termotargetron基因打革巴載 體（圖14,表1，表2)，分別為：pHK-TTlA-CipA1827s (舉例，參照載體重編碼步驟，使用 CipA1827sIBS12-TeI3cUNI，CipA1827sEBS2-CipA1827sEBSla 引物構(gòu)建），pHK-TTlA-Hfatl6 5s，pHK-TTlA-Hydl525a，pHK-TTlA-Ldh309s，pHK-TTlA-Ldh508s，pHK-TTlA-Pta318a，pHK-T TlA_PyrF281s(表1，表2)。將7個(gè)thermotargetron打祀載體，分別轉(zhuǎn)化熱纖梭菌DSM1313 菌株。轉(zhuǎn)化子使用PCR檢測(cè)（圖15,表2)，并進(jìn)一步Southerblot驗(yàn)證（圖16)。測(cè)序突變 株培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至4ml無抗性GS-2培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代至質(zhì)粒丟失。質(zhì)粒丟失后使用TeI3c 特異探針（TeI3c539_710nt，172bp，probel72_F/R 表 2) Southerblot (DIG-High Prime DNALabeling Detection Starter Kit I，Roche)檢測(cè) TeI3c 在突變株基因組中的拷貝數(shù)。
[0094] Thermotargetron質(zhì)粒轉(zhuǎn)化熱纖梭菌的效率通常為50-200CFU/ μ g DNA。轉(zhuǎn)化子 使用插入位點(diǎn)兩側(cè)或內(nèi)側(cè)引物直接檢測(cè)TeI3c II型內(nèi)含子在靶位點(diǎn)的插入情況（圖15,表 2)。PCR結(jié)果表明thennotargetiOn對(duì)靶基因進(jìn)行的正確的失活且效率為67%-100%(圖14) (打靶效率等于基因失活克隆數(shù)與檢測(cè)克隆數(shù)的比值)。對(duì)突變株的Southemblot結(jié)果表 明 Cipal827s，Pta318a，Ldh508s，Hfatl65s 為單插入突變株；Ldh309s，Pyrf281s，Hydl525a 為多插入突變株。單插入率為57% (圖16)。
[0095] 參考文獻(xiàn)
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[0113] 表I質(zhì)粒列表

【權(quán)利要求】
1. 一種適用于嗜熱微生物遺傳改造的基因元件，其特征在于：元件為嗜熱II型內(nèi)含子 元件TeI3c-4c，其由序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示。
2. -種適用于嗜熱微生物遺傳改造的載體，其特征在于：載體為具有嗜熱微生物遺傳 改造的基因元件打靶載體，其含有復(fù)制起始位點(diǎn)、耐熱復(fù)制蛋白、多克隆位點(diǎn)、嗜熱II型內(nèi) 含子元件TeI3c_4c和啟動(dòng)子元件。
3. 按權(quán)利要求2所述的適用于嗜熱微生物遺傳改造的載體，其特征在：所述嗜熱II型 內(nèi)含子元件TeI3c-4c為序列表SEQ ID NO. 1和2中核酸序列所示；啟動(dòng)子源于嗜熱微生物 啟動(dòng)子。
4. 一種嗜熱微生物遺傳改造的應(yīng)用，其特征在于：利用所述嗜熱微生物遺傳改造的基 因元件打靶載體應(yīng)用于嗜熱微生物中，進(jìn)而使嗜熱微生物基因靶向失活。
5. 按權(quán)利要求4所述的嗜熱微生物遺傳改造的應(yīng)用，其特征在于：由所述嗜熱微生物 遺傳改造的基因元件打靶載體中基因元件與嗜熱微生物的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而使嗜熱微生 物基因靶向失活。
6. 按權(quán)利要求5所述的嗜熱微生物遺傳改造的應(yīng)用，其特征在于：所述識(shí)別位點(diǎn)為1) 革巴DNA識(shí)別位點(diǎn)17個(gè)堿基具有WAAnnnnnnnnnnnnnn (W=A或Τ，N=A, T, G, C)特征，確保能夠 被TeI3c-4c正確識(shí)別；2) TeI3c-4c II型內(nèi)含子元件EBS1，2, 3與靶序列IBS1，2, 3(DNA) 滿足Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，確保能被RNA正確識(shí)別。
7. 按權(quán)利要求6所述的嗜熱微生物遺傳改造的應(yīng)用，其特征在于：所述識(shí)別位點(diǎn)為 WAAnnnnnnnnnnnnnA/T/G/C，W代表A或T堿基，η代表任意堿基，A/T/G/C表示EBS3序列可 以為任意一種堿基。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104293777SQ201410155715
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月17日
【發(fā)明者】崔球, 洪偉, 喬治·莫爾, 艾倫·萊伯維茲, 劉亞君, 馮銀剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所, 德克薩斯大學(xué)體系董事會(huì)