一種甾體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種甾體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，用于解決現有的微生物轉化甾體C11α羥化的轉化率低且環(huán)境不友好的問題，包括如下步驟：菌種繁殖：將赭曲霉菌或黑根酶菌菌種接入對應的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；底物乳化：將底物17α-羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16,17-α環(huán)氧黃體酮中的一種在表面活性劑的作用下進行乳化處理；發(fā)酵培養(yǎng)：將第一步得到的赭曲霉菌或黑根酶菌接入對應的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再添加滅菌后的17α-羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16,17-α環(huán)氧黃體酮中的一種的乳化液繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)；成品提取。本發(fā)明具有轉化率高、污染少、環(huán)保壓力小等優(yōu)勢。
【專利說明】一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及留體藥物的微生物轉化【技術領域】，特別是指一種留體激素類物質重要中間體的Ila羥化制備方法。
【背景技術】
[0002]皮質激素是腎上腺皮質合成和分泌的一類留體化合物，主要功能是調節(jié)動物體內的水鹽代謝和糖代謝。留體的Clla羥化是各種皮質激素合成不可缺少的一步，留體上羥基對于化學合成來說非常困難，除留體的C17位上易引入一個羥基，其他位置都很難以化學方法導入。留體Clla羥化是微生物特有的轉化反應，這不僅解決藥物合成合成困難的問題，更重要的意義是增加了皮質激素類化合物活力，使其具有高度抑制炎癥效應，通過微生物的Cll α羥化還為尋找更有效新藥開創(chuàng)了一個新途徑。
[0003]微生物轉化留體Cll α羥化通常分兩個階段，第一階段為菌體生長階段；第二階段為投入底物階段。目前常用的處理底物方式為以溶媒溶解底物后投入一定菌濃的發(fā)酵液中進行進一步轉化培養(yǎng)。其中常用的溶媒有丙二醇、乙醇、丙酮、甲醇等。但是這些溶媒對轉化酶系具有毒性，從而影響底物轉化率，限制了其在工業(yè)中的應用推廣。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明提出了一種甾體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法，用于解決現有的微生物轉化留體Cll α羥化的轉化率低且環(huán)境不友好的問題。
[0005]本發(fā)明的技術方案是這樣實現的:
[0006]一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法，包括如下步驟:
[0007]第一步，菌種繁殖:
[0008]將赭曲霉菌或黑根酶菌菌種接入對應的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0009]第二步，底物乳化:
[0010]將底物17 α -羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮中的一種在表面活性劑的作用下進行乳化處理；
[0011]第三步，發(fā)酵培養(yǎng):
[0012]將第一步得到的赭曲霉菌或黑根酶菌接入對應的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再添加滅菌后的17 α-羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮中的一種的乳化液繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0013]第四步，成品提取。 [0014]優(yōu)選的，第二步中底物17 α-羥基黃體酮對應的表面活性劑為吐溫80、對應的轉化菌為赭曲霉菌，第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮的質量分數為1.5-3.0%、吐溫80的質量分數為0.01-0.2% ο
[0015]優(yōu)選的，第二步中底物16，17-α環(huán)氧黃體酮對應的表面活性劑為苯磺酸鈉、對應的轉化菌為黑根酶菌，第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中底物16，17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數為2-3.5%、苯磺酸鈉的質量分數為0.01-0.2%。
[0016]優(yōu)選的，第二步底物17 α -羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮的乳化的溫度均為50-70°C。
[0017]優(yōu)選的，第一步菌種繁殖的具體操作為:將7-10支IL的赭曲霉菌或黑根酶菌茄子瓶斜面制備為孢子懸液接于種子罐中進行培養(yǎng)，其中每支茄子瓶斜面孢子量為IOic1-1O12個。
[0018]優(yōu)選的，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作為:24_30h后，將第一步得到的種子培養(yǎng)液以5-20%的接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；12-24h后，將滅菌后的17α-羥基黃體酮乳化液、4-雄烯二酮乳化液或16，17-α環(huán)氧黃體酮乳化液中的一種移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化培養(yǎng)。
[0019]優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖25_30g/L，玉米漿20_30g/L，蛋白胨10-15g/L，酵母膏5-10g/L，泡敵0.03% -0.04% ;發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖15-30g/L，蛋白胨10-15g/L，玉米漿20-35g/L，酵母膏5-10g/L，泡敵0.03% -0.2%，硫酸銨0.2-lg/L，磷酸二氫鉀0.2-lg/L ;種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為 3-6。
[0020]優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30_50g/L，玉米漿5_20g/L，硫酸銨l_3g/L，棉 籽餅粉10-20g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿30-50g/L，硫酸銨l_3g/L，磷酸氫二鉀0.3-0.7g/L，棉籽餅粉10_20g/L，蠶蛹粉2-5g/L ;種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為3-6。
[0021]優(yōu)選的，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25_30°C，壓力0.03-0.1Mpa，攪拌速度150-250rpm，溶氧量 15-50%。
[0022]優(yōu)選的，第四步成品提取的具體操作為:首先，將第三步得到的發(fā)酵液進行過濾，得到濾餅；其次，用至少3倍量的丙酮或乙醇將濾餅溶解、過濾并對所得的濾液進行多次萃取脫色后加熱蒸餾，得粗品；最后，用至少6倍量的正己烷、氯仿、苯或甲苯中的一種或多種將上述粗品溶解、脫色、蒸餾，最終得到純度達到98.5%以上的精品。
[0023]本發(fā)明提出的一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法，具有以下有益效果:
[0024]1、提高了底物的利用率，使得底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮的轉化率高達98%,16, 17-α環(huán)氧黃體酮的轉化率高達70% ；
[0025]2、與傳統(tǒng)化學合成方法相比，大大縮短了生產周期，轉化效率高；
[0026]3、成品提取的操作簡單、高效、環(huán)保，所得產品的純度均在98.5%以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0028]圖1為本發(fā)明一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法的流程示意圖?！揪唧w實施方式】
[0029]下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0030]如圖1所示:一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法，包括如下步驟:
[0031]第一步，菌種繁殖:
[0032]將赭曲霉菌或黑根酶菌菌種接入對應的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0033]第二步，底物乳化:
[0034]將底物1 7 α -羥基黃體酮、4_雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮中的一種在表面活性劑的作用下進行乳化處理；
[0035]第三步，發(fā)酵培養(yǎng):
[0036]將第一步得到的赭曲霉菌或黑根酶菌接入對應的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再添加滅菌后的17α-羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮中的一種的乳化液繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0037]第四步，成品提取。
[0038]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第二步中底物17 α-羥基黃體酮或4-雄烯二酮對應的表面活性劑為吐溫80、對應的轉化菌為赭曲霉菌，第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮的質量分數為1.5-3.0 %、吐溫80的質量分數為 0.01-0.2%。
[0039]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第二步中底物16，17-α環(huán)氧黃體酮對應的表面活性劑為苯磺酸鈉、對應的轉化菌為黑根酶菌，第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中底物16，17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數為2-3.5%、苯磺酸鈉的質量分數為0.01-0.2%。
[0040]底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮優(yōu)選的轉化菌為赭曲霉菌，其在適量赭曲霉菌的作用下轉化率可以高達98%，同等條件下若選擇黑根酶菌，底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮的轉化率非常低；而對于底物16，17-α環(huán)氧黃體酮而言，其優(yōu)選的轉化菌則為黑根酶菌，其在適量黑根酶菌的作用下轉化率可以高達70%。
[0041]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第二步底物17 α-羥基黃體酮、
4-雄烯二酮或16，17- α環(huán)氧黃體酮的乳化的溫度均為50-70°C。
[0042]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第一步菌種繁殖的具體操作為:將7-10支IL的赭曲霉菌或黑根酶菌茄子瓶斜面制備為孢子懸液接于種子罐中進行培養(yǎng)，其中每支茄子瓶斜面孢子量為IOic1-1O12個。
[0043]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作為:
24-30h后，將第一步得到的種子培養(yǎng)液以5-20%的接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；12_24h后，將滅菌后的17 α -羥基黃體酮乳化液、4-雄烯二酮乳化液或16，17-α環(huán)氧黃體酮乳化液移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化培養(yǎng)。
[0044]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖25-30g/L，玉米漿20-30g/L，蛋白胨10_15g/L，酵母膏5-10g/L，泡敵0.03% -0.04% ;發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖15-30g/L，蛋白胨10_15g/L,玉米漿20-35g/L,酵母膏5-10g/L,泡敵0.03% -0.2%,硫酸銨0.2-lg/L,磷酸二氫鉀
0.2-lg/L ;種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為3-6。
[0045]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿5-20g/L，硫酸銨l_3g/L，棉籽餅粉10_20g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿30-50g/L，硫酸銨l_3g/L，磷酸氫二鉀
0.3-0.7g/L，棉籽餅粉10-20g/L，蠶蛹粉2_5g/L ;種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為3_6。
[0046]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度
25-30°C，壓力 0.03-0.1Mpa，攪拌速度 150_250rpm，溶氧量 15-50%。
[0047]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明的再一實施例，第四步成品提取的具體操作為:首先，將第三步得到的發(fā)酵液進行過濾，得到濾餅；其次，用至少3倍量的丙酮或乙醇將濾餅溶解、過濾并對所得的濾液進行多次萃取脫色后加熱蒸餾，得粗品；最后，用至少6倍量的正己烷、氯仿、苯或甲苯中的一種或多種將上述粗品溶解、脫色、蒸餾，最終得到純度達到98.5%以上的精品。 [0048]與現有技術相比，本發(fā)明提出的一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法，具有以下有益效果:
[0049]1、提高了底物的利用率，使得底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮的轉化率高達98%,16, 17-α環(huán)氧黃體酮的轉化率高達70% ；
[0050]2、與傳統(tǒng)化學合成方法相比，大大縮短了生產周期，轉化效率高；
[0051]3、成品提取的操作簡單、高效、環(huán)保，所得產品的純度均在98.5%以上。
[0052]實施例1
[0053]一種留體激素類物質重要中間體的11 α羥化制備方法，包括如下步驟:
[0054]第一步，菌種繁殖:
[0055]將7支IL的赭曲霉菌茄子瓶斜面制備為孢子懸液接于種子罐的種子培養(yǎng)基內中進行培養(yǎng)，其中每支茄子瓶斜面孢子量為IOic1-1O12個，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖25-30g/L，玉米漿20-30g/L,蛋白胨10_15g/L，酵母膏5-10g/L，泡敵
0.03% -0.04%，種子培養(yǎng)基的pH為3 ;
[0056]第二步，底物乳化:
[0057]將底物17 α -羥基黃體酮在表面活性劑吐溫80、溫度50°C的作用下進行乳化處理；
[0058]第三步，發(fā)酵培養(yǎng):
[0059]24h后，將第一步得到的種子培養(yǎng)液以5%的接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；24h后，將滅菌后的17 α -羥基黃體酮乳化液移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖15-30g/L、蛋白胨10-15g/L、玉米漿20_35g/L、酵母膏
5-10g/L、泡敵0.03% -0.2%、硫酸銨0.2-lg/L、磷酸二氫鉀0.2-lg/L、17 α -羥基黃體酮1.5% (質量分數)、吐溫800.2% (質量分數)，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為3;發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25°C，壓力0.03Mpa，攪拌速度150rpm，溶氧量15% ；
[0060]第四步，成品提取:具體操作如下:[0061]首先，將第三步得到的發(fā)酵液進行過濾，得到濾餅；
[0062]其次，用3倍量的丙酮將濾餅溶解、過濾并對所得的濾液進行多次萃取脫色后加熱蒸餾，得粗品；
[0063]最后，用6倍量的正己烷將上述粗品溶解、脫色、蒸餾，最終得到純度達到98.5%以上的精品。
[0064]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為98.0%，最終效價14.39g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0065]實施例2
[0066]將實施例1中的乳化溫度更改為60°C，其余操作與實施例1相同。
[0067]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為98%，最終效價14.37g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0068]實施例3
[0069]將實施例1中的乳化溫度更改為70°C，其余操作與實施例1相同。
[0070]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為97%，最終效價14.26g/L，得到的11，17 α-二羥基 黃體酮的純度大于98.5%。
[0071]實施例4
[0072]將實施例1中種子培養(yǎng)基的pH更改為4，其余操作與實施例1相同。
[0073]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為98%，最終效價14.41g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0074]實施例5
[0075]將實施例1中種子培養(yǎng)基的pH更改為6，其余操作與實施例1相同。
[0076]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為92%，最終效價13.52g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0077]實施例6
[0078]將實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH更改為5，其余操作與實施例1相同。
[0079]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為96%，最終效價14.llg/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0080]實施例7
[0081]將實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)基的pH更改為6，其余操作與實施例1相同。
[0082]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為83%，最終效價12.18g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0083]實施例8
[0084]將實施例1中第三步的操作更改為:26h后，將種子培養(yǎng)液以16%的接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；20h后，將滅菌后的17 α -羥基黃體酮乳化液移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化培養(yǎng)。其余操作與實施例1相同。
[0085]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為98%，最終效價14.40g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0086]實施例9
[0087]將實施例1中第三步的操作更改為:30h后，將種子培養(yǎng)液以20%的接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；12h后，將滅菌后的17 α -羥基黃體酮乳化液移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化培養(yǎng)。其余操作與實施例1相同。
[0088]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為97%，最終效價14.26g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0089]實施例10
[0090]將實施例1中第三步發(fā)酵培養(yǎng)基中底物17 α -羥基黃體酮的質量分數更改為2%，吐溫80的質量分數更改為0.15%，其余操作與實施例1相同。
[0091]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為98%，最終效價19.21g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0092]實施例11
[0093]將實施例1中第三步發(fā)酵培養(yǎng)基中底物17 α-羥基黃體酮的質量分數更改為3.0%，吐溫80的質量分數更改為0.01%，其余操作與實施例1相同。
[0094]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為85 %，最終效價24.93g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0095]實施例12
[0096]將實施例1中 第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件更改為:溫度30°C，壓力0.1Mpa，攪拌速度250rpm，溶氧量50%，其余操作與實施例1相同。
[0097]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為90%，最終效價13.25g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0098]實施例13
[0099]將實施例1中第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件更改為:溫度27°C，壓力0.07Mpa,攪拌速度200rpm，溶氧量35%，其余操作與實施例1相同。
[0100]測試結果:17 α-羥基黃體酮的轉化率為93%，最終效價13.67g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0101]實施例14
[0102]將實施例1中底物17 α -羥基黃體酮替換為16，17-α環(huán)氧黃體酮，表面活性劑吐溫80替換為苯磺酸鈉，對應的種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿5-20g/L，硫酸銨l_3g/L，棉籽餅粉10-20g/L ;對應的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿30-50g/L，硫酸銨l_3g/L，磷酸氫二鉀0.3-0.7g/L，棉籽餅粉10-20g/L，蠶蛹粉2-5g/L ;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中16，17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數為1.0%，苯磺酸鈉的質量分數為0.2%,16, 17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數2.0%，種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的PH均為3。其余操作條件與實施例1相同。
[0103]測試結果:16，17-α環(huán)氧黃體酮的轉化率為65%，最終效價12.74g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0104]實施例15
[0105]將實施例14中16，17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數更改為3.5%，苯磺酸鈉的質量分數為0.01%，其余與實施例14相同。
[0106]測試結果:16，17_α環(huán)氧黃體酮的轉化率為42 %，最終效價14.40g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。[0107]實施例16
[0108]將實施例14中16，17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數更改為2.5%，苯磺酸鈉的質量分數為0.1%，其余與實施例14相同。
[0109]測試結果:16，17-α環(huán)氧黃體酮的轉化率為59%，最終效價14.46g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0110]實施例17
[0111]將實施例14中種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均更改為4，其余操作與實施例14相同。
[0112]測試結果:16，17_α環(huán)氧黃體酮的轉化率為70 %，最終效價13.72g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0113]實施例18
[0114]將實施例14中種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均更改為6，其余操作與實施例14相同。
[0115]測試結果:16，17_α環(huán)氧黃體酮的轉化率為50 %，最終效價9.77g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0116]實施例19
[0117]將實施例14中的第四步成品提取的工藝更改為:首先，將第三步得到的發(fā)酵液進行過濾，得到濾餅；其次，用4倍量的乙醇將濾餅溶解、過濾并對所得的濾液進行多次萃取脫色后加熱蒸餾，得粗品；最后，用7倍量的氯仿將上述粗品溶解、脫色、蒸餾，最終得到純度達到98.5%以上的精品。其余操作與實施例14相同。
[0118]測試結果:16，17_α環(huán)氧黃體酮的轉化率為65 %，最終效價12.74g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于98.5%。
[0119]實施例20
[0120]將實施例14中的第四步成品提取的工藝更改為:首先，將第三步得到的發(fā)酵液進行過濾，得到濾餅；其次，用5倍量的乙醇將濾餅溶解、過濾并對所得的濾液進行多次萃取脫色后加熱蒸餾，得粗品；最后，用至少8倍量的苯將上述粗品溶解、脫色、蒸餾，最終得到純度達到98.5%以上的精品。其余操作與實施例14相同。
[0121]測試結果:16，17_α環(huán)氧黃體酮的轉化率為65 %，最終效價12.74g/L，得到的11，17 α-二羥基黃體酮的純度大于99.0%。
[0122]實施例21
[0123]將實施例9中底物17 α-羥基黃體酮替換為等量的4_雄烯二酮，其余操作條件與實施例9相同。 [0124]測試結果:4_雄烯二酮的轉化率為98 %，最終效價14.38g/L，得到的11 α -羥基-4-雄烯-3，17 二酮的純度大于98.5%。
[0125]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種留體激素類物質重要中間體的Ila羥化制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 第一步，菌種繁殖: 將赭曲霉菌或黑根酶菌菌種接入對應的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 第二步，底物乳化: 將底物17 α-羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮中的一種在表面活性劑的作用下進行乳化處理； 第三步，發(fā)酵培養(yǎng): 將第一步得到的赭曲霉菌或黑根酶菌接入對應的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再添加滅菌后的17 α-羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17-α環(huán)氧黃體酮中的一種的乳化液繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)； 第四步，成品提取。
2.根據權利要求1所述的一種留體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，其特征在于:所述第二步中底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮對應的表面活性劑為吐溫80、對應的轉化菌為赭曲霉菌，所述第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中底物17 α -羥基黃體酮或4-雄烯二酮的質量分數為1.5-3.0%、吐溫80的質量分數為0.01-0.2%。
3.根據權利要求1所述的一種留體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，其特征在于:所述第二步中底物16，17-α環(huán)氧黃體酮對應的表面活性劑為苯磺酸鈉、對應的轉化菌為黑根酶菌，所述第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中底物16，17-α環(huán)氧黃體酮的質量分數為2.0-3.5%、苯磺酸鈉的質量分數為0.01-0.2%。
4.根據權利要求1所述的一種留體激素類物質重要中間體的Ila羥化制備方法，其特征在于:所述第二步底物17 a -羥基黃體酮、4-雄烯二酮或16，17- α環(huán)氧黃體酮的乳化的溫度均為50_70°C。
5.根據權利要求1所述的一種留體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，其特征在于:所述第一步菌種繁殖的具體操作為:將7-10支IL的赭曲霉菌或黑根酶菌茄子瓶斜面制備為孢子懸液接于種子罐中進行培養(yǎng)，其中每支茄子瓶斜面孢子量為IOic1-1O12個。
6.根據權利要求1所述的一種留體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，其特征在于:所述第三步發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作為:24-30h后，將所述第一步得到的種子培養(yǎng)液以5-20%的接種量移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；12-24h后，將滅菌后的17 α-羥基黃體酮乳化液、4-雄烯二酮乳化液或16，17-α環(huán)氧黃體酮乳化液中的一種移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行轉化培養(yǎng)。
7.根據權利要求2所述的一種留體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖25-30g/L，玉米漿20-30g/L，蛋白胨10-15g /L，酵母膏5-10g/L，泡敵0.03% -0.04% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖15_30g/L，蛋白胨10-15g/L，玉米漿20-35g/L，酵母膏5_10g/L，泡敵0.03% -0.2%，硫酸銨0.2-lg/L，磷酸二氫鉀0.2-lg/L ;所述種子培養(yǎng)基與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為3-6。
8.根據權利要求3所述的一種留體激素類物質重要中間體的Ila羥化制備方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿5-20g/L，硫酸銨l-3g/L，棉籽餅粉10-20g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖30-50g/L，玉米漿30-50g/L，硫酸銨l_3g/L，磷酸氫二鉀0.3-0.7g/L，棉籽餅粉10_20g/L，蠶蛹粉2-5g/L ;所述種子培養(yǎng)基與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為3-6。
9.根據權利要求2或3所述的一種留體激素類物質重要中間體的11α羥化制備方法，其特征在于:所述第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25-30°C，壓力0.03-0.1Mpa，攪拌速度150-250rpm，溶氧量 15-50%。
10.根據權利要求1-8任一項所述的一種留體激素類物質重要中間體的Ila羥化制備方法，其特征在于:所述第四步成品提取的具體操作為: 首先，將所述第三步得到的發(fā)酵液進行過濾，得到濾餅； 其次，用至少3倍量的丙酮或乙醇將所述濾餅溶解、過濾并對所得的濾液進行多次萃取脫色后加熱蒸餾，得粗品； 最后，用至少6倍量的正己烷、氯仿、苯或甲苯中的一種或多種將上述粗品溶解、脫色、蒸餾，最終得到純度達 到98.5%以上的精品。
【文檔編號】C12P33/10GK103966299SQ201410174391
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權日:2014年4月28日
【發(fā)明者】宋浩雷, 張耀勛, 張敏然, 楊科 申請人:河北眾盛生物科技有限公司