一種與豬肉pH值性狀相關(guān)的分子標(biāo)記鑒定及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及兩個(gè)與豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記和由這兩個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型定位及應(yīng)用。該SNP分子標(biāo)記由全基因組關(guān)聯(lián)分析中得到，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1-2以及圖2-3所示。再利用所得到的SNP經(jīng)單倍型分析得到一個(gè)如圖4所示的相應(yīng)的單倍型。本發(fā)明的標(biāo)記及單倍型可用于豬肉pH值性狀相關(guān)檢測(cè)中。
【專利說(shuō)明】一種與豬肉PH值性狀相關(guān)的分子標(biāo)記鑒定及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及兩個(gè)與豬肉PH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記和這兩個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型的鑒定及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾年，在豬育種工作中，提高瘦肉含量和降低背膘厚一直被育種者作為主要育種目標(biāo)，并取得了顯著的成效。但這種選育方式的遺傳選擇最終導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪含量的下降，進(jìn)而導(dǎo)致豬肉品質(zhì)的下降。隨著消費(fèi)者對(duì)肉質(zhì)要求的不斷提高，改善豬肉品質(zhì)的遺傳研究已成為畜牧業(yè)的研究熱點(diǎn)。
[0003]肉質(zhì)性狀是一個(gè)復(fù)雜的性質(zhì)。影響肉質(zhì)的因素很多，包括遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境衛(wèi)生、屠宰前的管理、屠宰工藝和屠宰后的加工處理。評(píng)定豬肉品質(zhì)好壞的指標(biāo)主要包括:肌內(nèi)脂肪含量、大理石紋、pH、肉色、系水力、滴水損失、肌纖維特性(類型、直徑、面積比等)及肉品中脂肪酸的組成等。
[0004]pH值是肉品質(zhì)測(cè)定的最重要的指標(biāo)之一。pH值直接體現(xiàn)了肌肉酸度，對(duì)豬肉品質(zhì)影響很大。肉品PH值多用pH計(jì)直接測(cè)定。機(jī)體在屠宰后肌肉的運(yùn)動(dòng)機(jī)能被終止并處于缺氧狀態(tài)，但新陳代謝仍在繼續(xù)消耗ATP，短時(shí)間內(nèi)磷酸肌酸由肌酸激酶使ADP變成ATP，除此之外不會(huì)再生成ATP，這時(shí)糖酵解產(chǎn)生的乳酸使肌肉pH值降低，但隨著ATP分解生成的胺的積累和PH值的降低使糖原酵解的酶活性減弱甚至失活，最終導(dǎo)致糖酵解停止，肌肉的pH值達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)(Kocwin-Podsiadla, Przybylski et al.1995)。
[0005]由于肉質(zhì)性狀的測(cè)定只能在屠宰后進(jìn)行而且相對(duì)困難，因此采取傳統(tǒng)的育種方法進(jìn)行肉質(zhì)改良受到一定的限制。此外，目前對(duì)影響肉質(zhì)性狀的基因的研究，以及這些基因之間的通路研究尚不全面透徹，同樣限制了育種進(jìn)展。而分子育種可以克服這些困難，為提高豬肉品質(zhì)提供另一條研究途徑，直接從DNA水平上分析數(shù)量遺傳變異，使單個(gè)基因甚至單個(gè)位點(diǎn)對(duì)數(shù)量性狀影響的檢測(cè)成為可能。因此，采用分子遺傳學(xué)方法從本質(zhì)上提高豬肉品質(zhì)越來(lái)越受到關(guān)注，已經(jīng)成為該研究方向的重要研究途徑。
[0006]雖然候選基因法和QTL定位已經(jīng)在豬標(biāo)記輔助選擇中用于豬肉質(zhì)性狀遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，并取得了一定的成效，如豬與所有性狀相關(guān)QTL有8421個(gè)。但是候選基因法只能檢索預(yù)先設(shè)定候選基因，而不能識(shí)別新基因；QTL定位的限制在于QTL區(qū)域一般跨度很大，很難做到精細(xì)定位。如今，全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide Association Study,GffAS)已成為識(shí)別與重要經(jīng)濟(jì)性質(zhì)有關(guān)的候選基因或特定地基因組區(qū)域的新策略。相對(duì)候選基因法和QTL定位，GWAS可以更準(zhǔn)確的定位和識(shí)別新基因。它在家畜育種中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，如提高奶牛產(chǎn)奶量等。隨著豬高密度的SNP(Single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態(tài)性)芯片的開發(fā)，以及豬基因組測(cè)序工作的完成(Groenen，Archibald et al.), GffAS為豬的分子育種開辟了一個(gè)新領(lǐng)域。[0007]目前為止，已經(jīng)確認(rèn)為豬肉質(zhì)性狀的主效基因有氟烷基因、酸肉基因和PRKAG3基因。[0008]氟烷基因(Halothane gene, Hal)是最早被發(fā)現(xiàn)的影響豬肉品質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)記基因。它位于豬6號(hào)染色體的蘭尼定受體I基因(RyanodinereceptorI, RYR1)的發(fā)生突變，其隱形基因?qū)ωi肉品質(zhì)造成了不利影響，導(dǎo)致白肌肉(pale, soft and exudative, PSE肉)的產(chǎn)生(Hradecky, Hruban et al.1980 ;Reik, Rempel et al.1983 !Hamilton, Ellis etal.2000)。酸肉(RN)基因位于15號(hào)染色體，其不利的突變RN最先在漢普夏豬中被發(fā)現(xiàn)，使豬屠宰后肌肉pH值偏低，影響豬肉品質(zhì)。PRKAG3(AMP — activatedProteinKinase3)基因主要影響豬肉的PH值、肉色及滴水損失。該基因中第R200Q發(fā)生突變是引起了 RN效應(yīng)，使豬屠宰后24小時(shí)肌肉pH值降低，滴水損失增加(Milan, Jeon et al.2000 ；Lindahl, Enf ?It et al.2004 ；Lindahl, Enf ? It et al.2004 ；Zamaratskaia, Madej et al.2005)。對(duì)于豬肉質(zhì)性狀的候選基因，目前已有多例報(bào)道，其中研究得較清楚的是H-FABP、MC4R、IGF2、MyoG, Myostatin, ACSL, PPAR y , AMPDU ADDl 和 CAST。
[0009]前人研究表明，DNAJC3 (P58IPK)基因編碼的蛋白在人和小鼠的所有組織中都有表達(dá)，尤其是在胰臟和肝臟中高表達(dá)(Korth，Lyons et al.1996)。胰島β細(xì)胞中有功能強(qiáng)大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和加工新合成的胰島素(Harding and Ron2002)。各種破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的刺激稱作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，會(huì)導(dǎo)致未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累(Schr ? der andKaufman2005)。DNAJC3是負(fù)反饋回路中的重要成分，可以抑制eIF_2 α信號(hào)通路，并減弱未折疊蛋白反應(yīng)(Schr? der and Kaufman2005)。在小鼠中敲除DNAJC3基因后小鼠體重降低，即使自由采食10~12個(gè)月，小鼠的體脂〈10%，進(jìn)而減少肥胖的產(chǎn)生。導(dǎo)致體脂減少的機(jī)制可能是β細(xì)胞的凋亡和可用胰島素的減少，進(jìn)而阻止葡萄糖向脂肪的轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)存(Ladiges, Knoblaugh et al.2005)。當(dāng)胰島β細(xì)胞不能補(bǔ)償適當(dāng)胰島素分泌時(shí)的胰島素抵抗，就產(chǎn)生二型糖尿病。
[0010]在人的二型糖 尿病人的胰臟中發(fā)現(xiàn)DNAJC3的蛋白水平上調(diào)。二型糖尿病的產(chǎn)生與胰島素信號(hào)通路的損傷有關(guān)。而胰島素控制著肝臟、肌肉和脂肪組織中葡萄糖和脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。在肝臟中，胰島素促進(jìn)葡萄糖和脂肪酸的合成。在肌肉和脂肪組織中，胰島素可以刺激葡萄糖的攝入(Stiles，Wang et al.2004)。在屠宰時(shí)肌肉中葡萄糖的含量和糖酵解決定了屠宰后24小時(shí)后豬肉pH值的高低(Fernandez and Tornbergl991)。
[0011]目前，研究豬DNAJC3基因功能的報(bào)道很少， 申請(qǐng)人:運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法對(duì)這個(gè)基因的部分內(nèi)含子進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析和多態(tài)研究，并首次在豬DNAJC3基因的內(nèi)含子找到的肉質(zhì)性狀SNP分子標(biāo)記及其單倍型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供兩個(gè)與豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記和這兩個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型的鑒定及應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法尋找與豬肉PH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及單倍型，以此作為豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及單倍型在標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0014] 申請(qǐng)人:通過克隆得到一個(gè)與豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示:
[0015]AGACGTGGCTTGGACCTGGCGTTGCTCTATGTCTGTGGTGTAGACCGGTGGCTGCAGCTCCGGTTCAACCCCTGGCCTGG GATCCTCCATAGGCTGCAGGTGCAGTCCTAAAACAAAAACACTCTTTGTTTTAATTTAACAATCCTCTAAATTAAATTTT TGTTTGATTTT R GGGTAAATCAGCTCTGTGGCTACAAAAAATAAAAGATCGTTCTAGGGCTGCCACTGACTTGAGCTTG TTATTTTCTCTCTGTAAGTGCTCTAATGTGCTCAACAGAATCTATCCCAGTGTCCCAGCCC
[0016]上述序列172位的堿基R是C或T，導(dǎo)致多態(tài)性。
[0017]本發(fā)明通過克隆得到另一個(gè)與豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示:
[0018]AGAGAGGACCAGGGCCAGGAGCTGAGTCTCTACAGCCGTGGAAGGTTTGGGCTGGGAGTGTCATGACAGGTGGGCTTTGA GGGAAACAGGTAGACATTTAGAACGTTAGATAAGGAAAGATGCCATGACTGGAGAAGGGAGAAGGAAGAATTAAGTAAGA TGCCCA RGTTTTTGGAGTGTTCAAATTGGTATGTGTTCAAGCTGTTCCCTGAGAAATTATTTAGAGGAGAAGAAAGGGT ACAAAAAATACAGCTCTCATAAAGACTTCCTGATTCTCAGCAGTTTATTTAATAATTTCTA
[0019]上述序列的167位中的堿基R是A或G，導(dǎo)致多態(tài)性。
[0020]上述制備的分子標(biāo)記可以單獨(dú)或組合使用在豬肉pH性狀檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0021] 申請(qǐng)人:提供了一種與豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的制備方法，其在于下列步驟:
[0022]I)提取豬基因組DNA;
[0023]2)采集豬的背最長(zhǎng)肌，用pH計(jì)測(cè)量三次試驗(yàn)豬背最長(zhǎng)肌肉樣的pH值，取三次所測(cè)結(jié)果的平均值作為該肉樣的PH值；
[0024]3)將豬基因組DNA樣品在全基因組芯片上做基因分型；
[0025]4)采用PLINK軟件進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析；從中選取與屠宰后24小時(shí)的豬肉pH值顯著關(guān)聯(lián)的SNP,運(yùn)用Ensembl網(wǎng)站的Variant Effect Predictor工具，注釋該SNP ;然后利用生物信息學(xué)方法，對(duì)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋；通過QTLdb網(wǎng)站檢索該位點(diǎn)是否落在報(bào)道的與豬肉PH值性狀有關(guān)的QTLs中，進(jìn)一步確定與豬肉pH值性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs ;利用Haploview進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍型分析。
[0026]本發(fā)明通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的方法得到與豬的部分肉質(zhì)性狀特別是與豬肉PH值性狀相關(guān)聯(lián)的SNP分子標(biāo)記，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了兩個(gè)新的分子標(biāo)記和一個(gè)單倍型。
[0027]更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《【具體實(shí)施方式】》。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]序列表SEQ ID NO:1是從NCBI網(wǎng)站下載的與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因DNAJC3內(nèi)含子I部分核苷酸序列，經(jīng)過檢測(cè)分析得到本發(fā)明的第一個(gè)分子標(biāo)記，序列長(zhǎng)度為300bp，在該序列的172bp處存在一個(gè)等位基因的突變，即由C突變?yōu)門。
[0029]序列表SEQ ID NO:2是從NCBI網(wǎng)站下載的與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因DNAJC3內(nèi)含子IV部分DNA序列。經(jīng)過檢測(cè) 分析得到本發(fā)明的第二個(gè)分子標(biāo)記，序列長(zhǎng)度為300bp，在該序列的167bp處存在一個(gè)等位基因的突變，即由A突變?yōu)镚。
[0030]圖1:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0031]圖2:本發(fā)明克隆的豬DNAJC3基因內(nèi)含子I的部分序列，其中位于豬11號(hào)染色體DNAJC3基因第I個(gè)內(nèi)含子第23633位堿基處(在本克隆的片段中的第172bp處)的即括號(hào)內(nèi)為等位基因的突變位點(diǎn)。
[0032]圖3:本發(fā)明克隆的豬DNAJC3基因內(nèi)含子IV的部分序列，其中位于豬11號(hào)染色體DNAJC3基因第4個(gè)內(nèi)含子第8181位堿基處(在本克隆的片段中的第167bp處)的即括號(hào)內(nèi)為等位基因的突變位點(diǎn)。
[0033]圖4:本發(fā)明分析得到的由多態(tài)性位點(diǎn)rs80855156和rs80882127構(gòu)成的一個(gè)單倍型。
【具體實(shí)施方式】
[0034]一、實(shí)驗(yàn)樣品采集
[0035]實(shí)驗(yàn)豬群來(lái)自湖北金林原種畜牧有限公司種豬場(chǎng)的233頭純種大白豬公豬(已閹害I]，體重為90kg左右)。豬群自由采食、飲水，整個(gè)飼喂方式、飼養(yǎng)條件等始終保持一致，為常規(guī)方法。[0036]在屠宰前，采集所有試驗(yàn)豬的耳組織樣品，放入75%乙醇中保存，為提取豬基因組DNA(具體方法參照北京天根生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒提供的說(shuō)明書)備用。屠宰完后，從胸、腰椎間砍斷脊柱與眼肌。然后切取左半胴體背最長(zhǎng)肌為肉樣，用于肌肉品質(zhì)測(cè)定。
[0037]二、背最長(zhǎng)肌pH值測(cè)定
[0038]試驗(yàn)豬死亡后24h，用手術(shù)刀在胴體上劃開一個(gè)小口，將電子溫度計(jì)插入樣品中測(cè)定溫度，并根據(jù)當(dāng)時(shí)室溫用pH = 4.0和pH = 7.0的標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)酸度計(jì)進(jìn)行標(biāo)定；于樣品最少Icm深處用手術(shù)刀或剪刀將肉樣搗碎；小心地將探頭插入搗碎的肉樣中，讓探頭與肉樣充分接觸；待酸度計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定時(shí)，記下PH值；然后在采樣部位另選兩處，按上述同樣的方法進(jìn)行測(cè)定；取三次檢測(cè)結(jié)果的平均值，作為該肉樣的PH值。
[0039]二、豬基因組DNA的提取與檢測(cè)
[0040]試驗(yàn)采用北京天根生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒(TIANamp GenomicDNA Kit)從豬耳組織中提取豬基因組DNA，具體操作步驟如下:
[0041]I)用眼科手術(shù)剪(用前酒精棉擦拭干凈)將取自大白豬耳樣剪成糊狀，加200 μ I緩沖
[0042]液GA (該試劑盒自帶)，振蕩至徹底懸浮。
[0043]2)加入20 μ I蛋白酶K溶液(該試劑盒自帶)，混勻，置于56°C水浴鍋消化過夜。
[0044]3)加入200 μ I緩沖液GB (該試劑盒自帶)，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶
液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0045]4)加入200 μ I無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0046]5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(~13，400Xg)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0047]6)向吸附柱CB3中加入500 μ I緩沖液⑶(該試劑盒自帶)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0048]7)向吸附柱CB3中加入600 μ I漂洗液PW(該試劑盒自帶)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0049]8)重復(fù)操作步驟7。
[0050]9)將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0051]10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ 1洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0052]11)取2 μ L上一步所得溶液DNA溶液和I μ L加樣緩沖液混勻，上樣于1.2%的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳20分鐘左右，紫外燈下觀測(cè)電泳結(jié)果并拍照，以判斷DNA的完整性。用 NanoDrop2000 核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific,USA)對(duì)提取后的 DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，A260/A280的比值在1.7-2.1之間，A260/A230在1.8-2.2之間被判定為合格。對(duì)合格的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，然后將濃度統(tǒng)一稀釋至200ng/ μ L，放入_20°C的冰箱存放。不合格的DNA樣品則需要重新提取。
[0053]四、SNP芯片基因型判定及基因型數(shù)據(jù)的質(zhì)控
[0054]將233頭豬耳樣中提 取的基因組DNA樣品在Illumina公司研制的PorcineSNP60BeadChip全基因組芯片上雜交。該芯片中包含61177個(gè)SNP位點(diǎn)。
[0055]采用PLINK軟件對(duì)所有個(gè)體的原始基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控檢驗(yàn)，以SNP基因型檢出率(SNP call rate) >90%、最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF) >0.01、哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)檢驗(yàn)的P值〈10-6以及樣本檢出率(sample call rate) >90%等指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)。
[0056]五、數(shù)據(jù)整理與分析
[0057]I)表型數(shù)據(jù)分析
[0058]利用SAS9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)屠宰后24小時(shí)的pH測(cè)定值，進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，包括計(jì)算該性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值和最小值。
[0059]2)全基因組關(guān)聯(lián)分析
[0060]采用PLINK軟件，進(jìn)行GWAS分析。 申請(qǐng)人:運(yùn)用下述混合模型分析數(shù)據(jù)。模型為:
[0061]Yij = μ +Genotypei+ ε i j
[0062]其中，Yij為處理后的性狀值；μ為每個(gè)性狀的均值；genotypei為基因型效應(yīng)；ε ij為隨機(jī)效應(yīng)。
[0063]3)檢驗(yàn)SNP與性狀關(guān)聯(lián)的顯著性。
[0064]當(dāng)某個(gè)SNP符合P〈10_4條件時(shí)，我們就認(rèn)為這個(gè)SNP達(dá)到了全基因組的基因組水
平顯著。
[0065]4) SNP 注釋
[0066]根據(jù)芯片SNP 信息，在 Ensembl 網(wǎng)站(www.ensembl.0rg)的 Sus scrofa Buidl0.2數(shù)據(jù)庫(kù)中，運(yùn)用Variant Effect Predictor工具,注釋該SNP,即確定SNP位點(diǎn)所在染色體及其在染色體上的物理位置，并由此確定這些顯著SNPs在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因的內(nèi)部還是側(cè)翼區(qū)域內(nèi)。然后利用生物信息學(xué)方法，根據(jù)Ensembl、NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等網(wǎng)站提供的基因結(jié)構(gòu)、基因類型、基因功能和通路等信息，對(duì)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋。最后通過QTLdb (cn.animalgenome.0rg/cg1-bin/QTLdb/index)網(wǎng)站檢索該位點(diǎn)是否落在已報(bào)到的與肉質(zhì)性狀有關(guān)的QTLs中，進(jìn)一步確定與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs。
[0067]5)單倍型分析
[0068]選定染色體上包含所有與pH值性狀相關(guān)的顯著SNPs的區(qū)域，并利用Haploview(Version4.2)進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍型分析。具體步驟如下:將待分析的SNP相應(yīng)的map文件和ped文件導(dǎo)入到Haploview軟件分析。其中，map文件有兩列，一列是SNP的ID號(hào)，一列是該SNP在染色體上的位置(參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)豬10.2版的基因組)；ped文件的前六列是固定的，依次為家系ID、個(gè)體ID、父本ID、母本ID、性別(“I”代表公畜；“2”代表母畜)、表型值，其次是基因型。
[0069]六、結(jié)果分析
[0070]對(duì)豬DNAJC3基因內(nèi)含子I多態(tài)性位點(diǎn)rs80855156 (ASGA0051428)基因型檢測(cè)結(jié)果表明在233個(gè)個(gè)體中AA(TT)基因型有7個(gè)，AB (TC)基因型有61個(gè)，BB (CC)基因型有165個(gè)。所分析的肉質(zhì)性狀是屠宰后24小時(shí)的pH。所得到的相關(guān)性狀是屠宰后24小時(shí)的pH。結(jié)果見表2。
[0071]表1DNAJC3基因內(nèi)含子I多態(tài)性位點(diǎn)rs80855156基因型與屠宰后24小時(shí)pH的關(guān)聯(lián)分析
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一個(gè)與豬肉PH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示:
AGACGTGGCTTGGACCTGGCGTTGCTCTATGTCTGTGGTGTAGACCGGTGGCTGCAGCTCCGGTTCAACCCCTGGCCTGG GATCCTCCATAGGCTGCAGGTGCAGTCCTAAAACAAAAACACTCTTTGTTTTAATTTAACAATCCTCTAAATTAAATTTT TGTTTGATTTT R GGGTAAATCAGCTCTGTGGCTACAAAAAATAAAAGATCGTTCTAGGGCTGCCACTGACTTGAGCTTG TTATTTTCTCTCTGTAAGTGCTCTAATGTGCTCAACAGAATCTATCCCAGTGTCCCAGCCC 上述序列172位的堿基R是C或T，導(dǎo)致多態(tài)性。
2.一個(gè)與豬肉pH值性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如下所示:
AGAGAGGACCAGGGCCAGGAGCTGAGTCTCTACAGCCGTGGAAGGTTTGGGCTGGGAGTGTCATGACAGGTGGGCTTTGA GGGAAACAGGTAGACATTTAGAACGTTAGATAAGGAAAGATGCCATGACTGGAGAAGGGAGAAGGAAGAATTAAGTAAGA TGCCCA RGTTTTTGGAGTGTTCAAATTGGTATGTGTTCAAGCTGTTCCCTGAGAAATTATTTAGAGGAGAAGAAAGGGT ACAAAAAATACAGCTCTCATAAAGACTTCCTGATTCTCAGCAGTTTATTTAATAATTTCTA 上述序列的167位中的堿基R是A或G，導(dǎo)致多態(tài)性。
3.權(quán)利要求1或2所述的SNP分子標(biāo)記構(gòu)成一個(gè)豬基因型的單倍型的標(biāo)記。
4.權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記單獨(dú)或組合使用在豬肉pH值性狀檢測(cè)中的應(yīng)用。
5.一種與豬肉pH值 性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備方法，其特征在于下列步驟: 1)提取豬基因組DNA； 2)采集豬的背最長(zhǎng)肌，用pH計(jì)測(cè)量三次試驗(yàn)豬背最長(zhǎng)肌肉樣的pH值，取三次所測(cè)結(jié)果的平均值作為該肉樣的PH值； 3)將豬基因組DNA樣品在全基因組芯片上作基因分型； 4)采用PLINK軟件進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，從中選取與屠宰后24小時(shí)的豬肉pH值顯著關(guān)聯(lián)的SNP,運(yùn)用Ensembl網(wǎng)站的Variant Effect Predictor工具，注釋該SNP,然后利用生物信息學(xué)方法，對(duì)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋，通過QTLdb網(wǎng)站檢索該位點(diǎn)是否落在報(bào)道的與豬肉PH值性狀有關(guān)的QTLs中，進(jìn)一步確定與豬肉pH值性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs ；利用Haploview進(jìn)行連鎖不平衡分析和基因型的單倍型分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103911377SQ201410176021
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】曹建華, 董謙, 趙書紅, 李新云 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)