降解酶的菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)菌 Sinomonas sp.HSD8及其應(yīng)用，該菌株的保藏編號為CCTCC NO：M2014109，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液中的黃曲霉毒素B1降解酶活力高，能有效解決飼料和食品中黃曲霉毒素污染問題，保障了動物飼料和食品的安全性。
CCTCC NO: M 2014109
20140328
【專利說明】
一種產(chǎn)黃曲霉毒素81降解酶的菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一株產(chǎn)黃曲霉毒素解毒酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌Sinomonas sp.HSD8及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]黃曲霉毒素(aflatoxin)是一種有強(qiáng)烈生物毒性的化合物，常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產(chǎn)生，如大米、豆類、花生等，是目前為止最強(qiáng)的致癌物質(zhì)，而且其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥的毒性。當(dāng)人攝入量大時，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。黃曲霉毒素主要有8132、61與62等4種，又以B1的毒性最強(qiáng)。一般在中性溶液中較穩(wěn)定,在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解,在PH9-10的強(qiáng)堿溶液中分解迅速。其純品為無色結(jié)晶、耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為268°C，所以一般的加熱不易破壞其結(jié)構(gòu)。另外紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。糧食儲存不當(dāng)，極容易發(fā)霉變黃，產(chǎn)生黃曲霉毒素。中國是一個農(nóng)業(yè)大國，預(yù)防和消除黃曲霉毒素對糧食及農(nóng)副產(chǎn)品的污染至關(guān)重要，對我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民健康將會起到重要作用。警惕黃曲霉毒素的危害，對我國而言已迫在眉睫。
[0003]隨著人們對于黃曲霉毒素對人類及動物健康造的巨大危害的逐步認(rèn)識，人們越來越大力尋找可以解除黃曲霉毒素毒性或減少其在食品和飼料中的污染的方法。作物收割前的污染可以通過好的收割作業(yè)等加以預(yù)防，而收獲后的污染情況可以通過正確的處理、干燥、分類和改善儲存條件，如降低溫度和減少濕度來加以控制。然而，與農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)的許多污染是很難避免的，這就需要一個合適的去除黃曲霉毒素的方法。除了將黃曲霉毒素降低到安全極限以下，同時也需要滿足下列基本準(zhǔn)則:
(I)不能造成其它毒性物質(zhì)的產(chǎn)生或者留有仍然會對食品安全性造成威脅有毒的殘基。
[0004](2)產(chǎn)品的營養(yǎng)成分不能被嚴(yán)重的破壞。
[0005](3)不能改變產(chǎn)品的物理和感官狀態(tài)成分。
[0006](4)必須是經(jīng)濟(jì)和技術(shù)可行的。
[0007](5)必須能夠破壞黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株的孢子和菌絲體，因為如果它們還殘存在產(chǎn)品中，在合適的條件下，可能會造成毒素的再生。
[0008]目前，通常使用的解毒方法都在于從食物中去除黃曲霉毒素或者在食品中將其破壞掉，主要可以分為物理、化學(xué)，生物學(xué)方法。其中生物法中的酶解法是最具潛力的方法。物理方法主要包括溶劑萃取、吸附、加熱，輻射、太陽照射等?；瘜W(xué)方法去毒主要是使用化學(xué)試劑除去毒素。使用的化學(xué)試劑有次氯酸鈉、臭氧、過氧化氫、氫氧化鈉、氨水以及氯氣等。生物學(xué)方法主要包括生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和微生物發(fā)酵產(chǎn)酶來進(jìn)行解毒。由于物理和化學(xué)方法對產(chǎn)品的色，香，味以及營養(yǎng)成分，如維生素、蛋白質(zhì)等均有不同程度的破壞和不良影響，降低了產(chǎn)品品質(zhì)，同時易產(chǎn)生副產(chǎn)物和處理劑殘留，且易被二次污染，對人和動物產(chǎn)生危害。此外，有些方法不適合大規(guī)模的生產(chǎn)，有些只適合一定物性的物料，去毒率不高、費(fèi)時、費(fèi)力且造成浪費(fèi)。由于這些問題的存在，人們一直在尋找一種高效，無危害的去除毒素的方法，于是生物脫毒的方法應(yīng)運(yùn)而生。黃曲霉毒素的生物脫毒主要是采用微生物或其產(chǎn)生的酶來進(jìn)行脫毒，生物脫毒的處理條件相對溫和，不會破壞產(chǎn)品的品質(zhì)，而且有些還能增加產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，此外生物酶具有作用專一性。應(yīng)用專門分解黃曲霉毒素而對所降解產(chǎn)品的其他成份沒有作用的酶，這無疑是一種最理想的方式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)黃曲霉毒素降解酶能力較強(qiáng)的菌株及其應(yīng)用，該酶可有效解決黃曲霉毒素污染的問題。
[0010]為了實現(xiàn)本發(fā)明，發(fā)明人通過大量試驗反復(fù)進(jìn)行菌種篩選研究，并終于獲得了一株合成黃曲霉毒素降解酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌Sinomonas sp.HSD8已于2014年3月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地點為湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:M2014109。
[0011]本發(fā)明涉及的產(chǎn)黃曲霉毒素BI降解酶的細(xì)菌Sinomonas sp.HSD8具有如下生物學(xué)特征:
形態(tài)學(xué)特征:菌落黃色，有光澤，扁平，呈圓形，表面及邊緣光滑，邊緣整齊，濕潤粘膩，容易挑起；正反面，邊緣與中央部位顏色一致。
[0012]生理特性:不僅可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜等碳源，還可利用玉米漿作為氮源。
[0013]代謝特性:代謝過程能積累產(chǎn)生黃曲霉毒素解毒酶。
[0014]本發(fā)明涉及的高產(chǎn)黃曲霉毒素解毒酶的細(xì)菌Sinomonas sp.HSD8是按照如下方法獲得的:
產(chǎn)黃曲霉毒素降解酶菌株的初篩:
(I)富集培養(yǎng):取5g篩選樣本于50ml滅菌生理鹽水中，37°C下160r/min搖床振蕩2h后取5ml菌液接種于富集培養(yǎng)基(富集培養(yǎng)基配方(g/L):香豆素L(NH4)2SO4 5,NaCl 8.5，121°C滅菌20min)中，37°C、160r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h。富集培養(yǎng)3次。
[0015](2 )稀釋涂布:取富集培養(yǎng)液0.5ml于滅菌后的小試管內(nèi)，然后加入4.5ml無菌水，依次稀釋，分別得到?ο—1到10 _8等8個稀釋梯度。分別取10 _4到10 _8等5個梯度的稀釋菌液200 μ I于初篩平板(初篩平板培養(yǎng)基配方(g/L):香豆素I，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 2.5，MgSO4 1，NaH2PO4.12H20 0.5, FeSO4.7H 20 0.1，CaCl2 0.1，瓊月旨 20，121°C滅菌 20min)上，用滅菌的涂布玻棒涂布均勻，每個梯度做3次平行。30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。
[0016](3)平板劃線分純:取稀釋涂布平板上菌落直徑較大，長勢較好的菌落分別編號并在瓊脂平板(初篩平板培養(yǎng)基配方(g/L):香豆素1，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 2.5, MgSO4 I,NaH2PO4.12H 20 0.5, FeSO4.7H 20 0.1, CaCl2 0.1，瓊脂 20，12TC滅菌 20min)上劃線分純，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。劃線分純后挑選菌落直徑較大，生長較快的菌株轉(zhuǎn)接于瓊脂斜面(斜面培養(yǎng)基配方(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，121°C滅菌20min) 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后4°C冰箱保藏。初篩共計篩選到27株細(xì)菌。
[0017]產(chǎn)黃曲霉毒素降解酶菌株的復(fù)篩: (I)初篩菌種活化:斜面培養(yǎng)基(斜面培養(yǎng)基配方(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，121°C滅菌20min)配制好后滅菌擺試管斜面?zhèn)溆?，在超凈臺中用接種針挑取初篩菌株轉(zhuǎn)接于試管斜面，37 °C培養(yǎng)36h。
[0018](2)種子液制備:種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基配方(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，121°C滅菌20min )配制好后分裝(50mL/250mL搖瓶)滅菌備用，在超凈臺中用接種針挑取活化后的菌種轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中。37°C、160rpm/min搖床培養(yǎng)14h。
[0019](3)接種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):牛肉膏3，蛋白胨 10，葡萄糖 4，NaCl 8.5，KH2PO4 2.5，K2HPO4.3H20 1，MgSO4 1，香豆素 I)配制好后分裝(50mL/250mL搖瓶)滅菌備用，在超凈臺中用5mL移液槍吸取5ml種子液(接種量10%(V/V))加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、160rpm/min搖床培養(yǎng)3天。
[0020](4)發(fā)酵上清液與黃曲霉毒素B1反應(yīng):發(fā)酵3天后取發(fā)酵液30mL于大離心管，8000rpm/min離心lOmin。離心完后取上清液(離心后檢測pH值,控制pH值不大于7.5)QSOPL+AFBi工作液50μ? (PBS毒素溶液濃度2(^g/mL)于滅菌的5mL離心管中，使AFBl終濃度為lKg/mL，然后在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24h。以滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基加等量PBS毒素溶液做空白對照。做3次平行。
[0021](5) HPLC法測定殘留黃曲霉毒素B1含量:(色譜條件:液相色譜:島津LC20AD，色譜柱:C18(0DS_3,150mmX4.6mm, 5mm),流動相:甲醇:乙腈:水=1:3:6，流速:lmL/min,檢測器:紫外檢測器，進(jìn)樣量:20μ L，柱溫:35°C，檢測波長:370nm)反應(yīng)混合液用等體積(ImL)的二氯甲烷旋渦振蕩萃取3次每次30秒，取下層二氯甲烷于另一 5mL離心管中，真空干燥箱65°C除去二氯甲烷層，用ImL甲醇(色譜純)溶解殘余物，有機(jī)相濾膜(0.22Mm)過濾，混勻進(jìn)樣。島津LCsolut1n計算殘余黃曲霉毒素B1含量。
[0022](6)黃曲霉毒素毒酶酶活計算:根據(jù)酶活定義:在溫度為37°C，pH 7.0的條件下，反應(yīng)24h降解Ing黃曲霉毒素&的酶量為一個酶活單位U。分別測算初篩菌株的酶活，酶活最高的即為降解黃曲霉毒素B1的最優(yōu)菌株。
[0023]經(jīng)過初篩和復(fù)篩，編號為HSD8的菌株產(chǎn)黃曲霉毒素解毒酶能力最高，經(jīng)鑒定，該菌株為Sinomorms sp.HSD8，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的專利保藏編號為CCTCC NO:M2014109。
[0024]利用本發(fā)明的菌株可以產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶，廣泛應(yīng)用于飼料及食品。例如，利用本發(fā)明的菌株制備黃曲霉毒素解毒酶的方法如下:
(I)將該菌株 Sinomorms sp.HSD8, CCTCC NO:M2014109 接種到種子培養(yǎng)基中，37-40°C培養(yǎng)12-14小時，搖床轉(zhuǎn)速160-180 rmp/min。
[0025](2) 2L搖瓶水平上發(fā)酵:將步驟I)的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量8%_10%(V/V), 37°C培養(yǎng)60-72小時，培養(yǎng)結(jié)束后，酶活為483.5U/mL。
[0026](3)放大到50L發(fā)酵罐:將步驟I)的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量8%_10%(V/V)，發(fā)酵溫度37°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200 rmp/min，通氣量10-20 L/min，在生物量達(dá)到一定時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，分階段控制發(fā)酵罐的溶氧水平。繼續(xù)發(fā)酵至60h-72h放罐。
[0027](4)富含黃曲霉毒素解毒酶添加劑的生產(chǎn):將3)中得到的發(fā)酵液，在5000 rmp/min條件下，離心lOmin，得到發(fā)酵上清液，在發(fā)酵上清液中添加10%麥芽糊精拌勻，在噴霧干燥塔中，控制進(jìn)風(fēng)溫度130-150°C，得到干物質(zhì)含量在90%-95%、酶活在2000_3000U/g的添加劑。
[0028]具體地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考以下具體發(fā)酵過程進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng):
Cl)菌株:
細(xì)菌 Sinomorms sp.HSD8, CCTCC NO:M2014109。
[0029](2)培養(yǎng)基:
每I L所述斜面培養(yǎng)基含有:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，pH自然；
每I L所述種子培養(yǎng)基含有:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH自然；
每I L所述搖瓶水平上發(fā)酵培養(yǎng)基含有:玉米漿13g，葡萄糖2g，NaCl 8.5g，KH2PO42.5g，K2HPO4.3H20 lg，MgSO4 lg，香豆素 lg，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 4.5-5.0 ；
每I L所述發(fā)酵罐水平上發(fā)酵培養(yǎng)基含有:玉米漿13g，葡萄糖2g，NaCl 8.5g, KH2PO4
2.5g，K2HPO4.3H20 lg, MgSO4 lg，香豆素 lg，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 4.5-5.0 ；
(3)種子擴(kuò)大培養(yǎng):
斜面種子活化24-36小時后接入到裝液量50 mL/250mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)12-14小時即得一級種子；之后再按5-10% (V:V)的接種量將一級種子接入到裝液量500mL/2L相同種子培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)12-14小時制備二級種子，培養(yǎng)溫度37_40°C，轉(zhuǎn)速 160_180rpm/min ；
(4)發(fā)酵具體包括以下步驟:
將二級種子按5-10% (V:V)的接種量接入50L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度37°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rmp，通氣量10_20L/min，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，分階段控制發(fā)酵罐的溶氧水平。繼續(xù)發(fā)酵至60h-72h放罐，發(fā)酵液酶活為562.6U/mL。
[0030]本發(fā)明涉及的細(xì)菌Sifloff1aas sp.HSD8,CCTCC NO:M2014109具有如下優(yōu)點和顯著的進(jìn)步:
(I)篩選到了一株產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶的高產(chǎn)菌株。
[0031](2)發(fā)酵液中黃曲霉毒素B1降解酶酶活為483.5_562.6U/mL，可有效解決飼料及食品中黃曲霉毒素污染的問題。
[0032](3)在搖瓶水平上發(fā)酵培養(yǎng)后的黃曲霉毒素B1降解酶酶活483.5 U/mL，在50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)后的黃曲霉毒素B1解毒酶酶活為562.6U/mL。

【具體實施方式】
[0033]以下通過實施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0034]實施例一:在搖瓶水平上發(fā)酵培養(yǎng) Cl)菌株
細(xì)菌 Sinomorms sp.HSD8, CCTCC NO:M2014109。
[0035](2)培養(yǎng)基
每I L所述斜面培養(yǎng)基含有:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，pH自然；
每I L所述種子培養(yǎng)基含有:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH自然；
每I L所述搖瓶水平上發(fā)酵培養(yǎng)基含有:玉米漿13g，葡萄糖2g，NaCl 8.5g，KH2PO42.5g，K2HPO4.3H20 lg, MgSO4 lg，香豆素 lg，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 4.5-5.0o
[0036](3)種子培養(yǎng)
斜面種子活化24-36小時后，接入裝入50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中培養(yǎng)12-14小時，轉(zhuǎn)速160rpm即得一級種子。
[0037](4)發(fā)酵培養(yǎng)
將一級種子接入50mL/250mL搖瓶中，在37°C、轉(zhuǎn)速160rmp的條件下培養(yǎng)72h。
[0038](5)發(fā)酵上清液與黃曲霉毒素B1反應(yīng)
取發(fā)酵液30mL于大離心管,8000rpm/min離心lOmin。離心完后取上清液950ul和AFBi工作液50μ? (PBS毒素溶液濃度2(^g/mL)于滅菌的5mL離心管中，使AFBjS濃度為Wg/mL，然后在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24h。以滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基加等量PBS毒素溶液做空白對照。做3次平行。
[0039](6) HPLC法測定殘留黃曲霉毒素B1含量
反應(yīng)混合液用等體積(ImL)的二氯甲烷旋渦振蕩萃取3次每次30秒，取下層二氯甲烷于另一 5mL離心管中，真空干燥箱65°C除去二氯甲烷層，用ImL甲醇(色譜純)溶解殘余物，有機(jī)相濾膜(0.22Mm)過濾，混勻進(jìn)樣。采用高效液相色譜檢測殘余黃曲霉毒素B1含量。
[0040](7)黃曲霉毒素毒酶酶活計算
根據(jù)酶活定義:在溫度為37°C，pH 7.0的條件下，反應(yīng)24h降解Ing黃曲霉毒素&的酶量為一個酶活單位U。計算酶活。
[0041](8)結(jié)果:
發(fā)酵時間-J2小時；酶活:483.5 U/mL ；
實施例二:在50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng) Cl)菌株
細(xì)菌 Sinomorms sp.HSD8, CCTCC NO:M2014109。
[0042](2)培養(yǎng)基
每I L所述斜面培養(yǎng)基含有:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，pH自然；
每I L所述種子培養(yǎng)基含有:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH自然；
每I L所述發(fā)酵罐水平上發(fā)酵培養(yǎng)基含有:玉米漿13g，葡萄糖2g，NaCl 8.5g, KH2PO42.5g，K2HPO4.3H20 lg, MgSO4 lg，香豆素 lg，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 4.5-5.0 ；
(3)種子培養(yǎng)
斜面種子活化24-36小時后，接入裝入50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)12-14小時即得一級種子；之后再按10% (V/V)的接種量將一級種子接入相同發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)12-14小時制備二級種子，培養(yǎng)溫度37-40 V，恒溫振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm/min ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)
將二級種子按5-10% (V/V)的接種量接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度37 °C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rmp,通氣量10_20L/min，在生物量達(dá)到一定時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，分階段控制發(fā)酵罐的溶氧水平。繼續(xù)發(fā)酵至60h-72h放罐。
[0043](5)發(fā)酵上清液與黃曲霉毒素B1反應(yīng)
取發(fā)酵液30mL于大離心管,8000rpm/min離心lOmin。離心完后取上清液950ul和AFBi工作液50μ? (PBS毒素溶液濃度2(^g/mL)于滅菌的5mL離心管中，使AFBjS濃度為Wg/mL，然后在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24h。以滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基加等量PBS毒素溶液做空白對照。做3次平行。
[0044](6) HPLC法測定殘留黃曲霉毒素B1含量
反應(yīng)混合液用等體積(ImL)的二氯甲烷旋渦振蕩萃取3次每次30秒，取下層二氯甲烷于另一 5mL離心管中，真空干燥箱65°C除去二氯甲烷層，用ImL甲醇(色譜純)溶解殘余物，有機(jī)相濾膜(0.22Mm)過濾，混勻進(jìn)樣。采用高效液相色譜檢測殘余黃曲霉毒素B1含量。
[0045](7)黃曲霉毒素毒酶酶活計算
根據(jù)酶活定義:在溫度為37°C，pH 7.0的條件下，反應(yīng)24h降解Ing黃曲霉毒素&的酶量為一個酶活單位U。計算酶活。
[0046](8)結(jié)果:
發(fā)酵時間:60-72小時；酶活:562.6U/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)黃曲霉毒素BI降解酶的細(xì)菌Sinomorms sp.HSD8，它的保藏編號為CCTCCNO:M2014109o
2.利用權(quán)利要求1所述的細(xì)菌Sinomonassp.HSD8發(fā)酵生產(chǎn)黃曲霉毒素&降解酶的方法。
3.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌Sinomonassp.HSD8在發(fā)酵生產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/01GK104498378SQ201410281386
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】蔡俊, 戴軍, 王常高, 杜馨, 林建國, 周安盛 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)