產(chǎn)醛酮還原酶菌株、醛酮還原酶基因、載體、工程菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)醛酮還原酶菌株、醛酮還原酶基因、載體、工程菌構(gòu)建及應用方法，所述醛酮還原酶基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5中的一種，SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示醛酮還原酶基因來自菌株——乳酸克魯維酵母XP1461，SEQ ID No.5所示醛酮還原酶基因來自菌株——拜耳接合酵母XP1462；本發(fā)明公開的3條來自K.lactis、Z.bailii的醛酮還原酶首次報道用于6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯生物催化合成，制得的樣品6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯達到光學純，幾乎檢測不到6-氰基-(3S,5R)-二羥基己酸叔丁酯的存在；得益于公開的醛酮還原酶的高差向選擇性，產(chǎn)物提取收率高。
CCTCC NO：M 2014381
20140814

CCTCC NO：M 2014380
20140814
【專利說明】產(chǎn)醛酮還原酶菌株、醛酮還原酶基因、載體、工程菌及應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醛酮還原酶產(chǎn)酶微生物、酶基因和構(gòu)建這些基因的重組表達載 體以及酶醛酮還原酶重組菌，并開發(fā)醛酮還原酶重組菌在阿托伐他汀手性側(cè)鏈6-氰 基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯生物催化合成方面的應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 心腦血管疾病已經(jīng)成為危害人類健康的頭號殺手，預計到2020年，心血管疾病死 亡人數(shù)將占人類總死亡人數(shù)的36%。心腦血管疾病發(fā)病與人體內(nèi)高膽固醇水平有密切關 系。阿托伐他汀能競爭性抑制肝臟內(nèi)膽固醇合成的關鍵限速酶一3-羥基-3-甲基戊二酰 輔酶A還原酶的活性，降低內(nèi)源性膽固醇的合成，是治療高膽固醇血癥和混合型高脂血癥 的有效藥物，具有起效快、降脂能力強、作用時間長和毒副作用小等優(yōu)點，是全球首個年銷 售額超過百億美元的重鎊炸彈藥。
[0003] 6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯，是阿托伐他汀合成的重要手性中間體，也 是關鍵的藥效基團。由于各國藥監(jiān)部門對藥物手性純度設置嚴苛的限制（e.e.值>99. 5%， d. e.值>99% )，6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯的合成技術成為阿托伐他汀合成的 關鍵核心技術。傳統(tǒng)的6-氰基_(3R，5R)_二羥基己酸叔丁酯化學合成工藝從酮酸（酯） 出發(fā)，通過不對稱合成構(gòu)建手性中心，反應路線復雜，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基鋰 等及深冷等特殊條件，導致產(chǎn)物d.e.值低、得率低、能耗大。而且，反應產(chǎn)生的硼化物廢物 處理困難，需要經(jīng)過繁瑣的反復甲醇淬滅、真空蒸餾處理。酶催化反應具有優(yōu)異的選擇性、 反應條件溫和等優(yōu)點，一般在常溫、常壓及近中性條件下進行，把分解、異構(gòu)化、外消旋化、 重排等不利副反應降到最低限度，生物催化技術具備提高過程原子經(jīng)濟性、實現(xiàn)過程綠色 環(huán)境友好的基本條件。因此，開發(fā)生物不對稱還原6-氰基_(5R)_羥基-3-羰基己酸叔丁 酯合成6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯技術，具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供產(chǎn)立體選擇性醛酮還原酶微生物乳酸克魯維酵母 (Kluyvzzzeromyces Iactis)、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)，3 條來自 K. lactis、Z.bailii的醛酮還原酶基因和含有上述基因的重組載體及其轉(zhuǎn)化得到的重組 菌，開發(fā)其在6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯生物催化合成方面的應用。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種醛酮還原酶基因，所述醛酮還原酶基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 5 中的一種。其中 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3 所示醛酮還 原酶基因來自菌株一乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年8月14日，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2014380,保藏地 址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。SEQ ID No. 5所示醛酮還原酶基因來自菌株一拜 耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)XP1462,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 日期為2014年8月14日，保藏編號為CCTCC M 2014381，保藏地址為中國武漢，武漢大學， 郵編 430072。
[0007] 本發(fā)明所述SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3所示的醛酮還原酶基因克隆自K. Iactis XP1461(保藏編號CCTCC M 2014380)，SEQ ID No. 5所示的醛酮還原酶基因克隆自 Z.bailii XP1462(保藏編號CCTCC M 2014381)。所述的醛酮還原酶基因可以從K. Iactis XP1461(CCTCC M 2014380)和Z.bailii XP1462(CCTCC M 2014381)基因組中分離獲得，也 可以從該醛酮還原酶基因的重組載體中或者重組表達組中分離獲得，也可以全人工合成獲 得。
[0008] 本發(fā)明所述的醛酮還原酶基因之一的堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 5所示，分別命名為kakr、kxr和zbakr，全長分別為930bp、990bp和 939bp。其中，其編碼序列（⑶S)分別為：從第一個堿基起至第930個堿基止，起始密碼子為 ATG，終止密碼子為TGA ;從第一個堿基起至第990個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼 子為TGA ;從第一個堿基起至第939個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。該3 條序列無內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)（即醛酮還原酶）氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 6 所示。
[0009] 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO :1、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5所示 多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。 所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的 變體可以是等位變異體或非天然發(fā)生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異 體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多個核苷酸的 取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的氨基酸的功能。
[0010] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO :2、SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6 所示氨基酸序列的多肽的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該 多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之 列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于突變體的 保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異 亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0011] 本發(fā)明還涉及所述醛酮還原酶基因構(gòu)建的重組表達載體。本發(fā)明所述的重組表 達載體可以通過本領域常規(guī)方法將本發(fā)明的醛酮還原酶基因連接于各種表達載體上構(gòu)建 而成。所述的載體可以為本領域常規(guī)的各種載體，如商品化質(zhì)粒（大腸桿菌中合適的載體 有 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pET20、pET32、pR印4、pHSl、pHS2、pMBL 等）、粘粒（PHZ132)、噬菌體或者病毒載體（反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體）等。所述質(zhì)粒 代表部分質(zhì)粒，其他質(zhì)粒為技術人員所熟知。本發(fā)明所述重組載體優(yōu)選pET28a質(zhì)粒。優(yōu)選 地，可以通過下述方法制得本發(fā)明的重組表達載體：分別將以K. Iactis基因組DNA為模板， 通過上游引物（引物 I) :5'-CATATGACTACTCAAAAGTTCTTTACTT-3'，下游引物(引物 2)5'-￡￡ GGCCGCTCACTTCTGGGATTCAGAAT-3'進行PCR擴增所得到的醛酮還原酶基因產(chǎn)物（核苷酸序 列為SEQ ID N0:1);以K. Iactis基因組DNA為模板，通過上游引物（引物3) :5'_ AGATCT ATGACGTACTTAGCAGAAACAG-3'，下游引物（引物 4)5'- CTCGAGGATGAAAGTTGGGAATTCGTTG-3' 進行PCR擴增所得到的醛酮還原酶基因產(chǎn)物（核苷酸序列為SEQ ID NO :3);以Z.bailii 基因組DNA為模板，通過上游引物（引物5) :5' - AGATCTATGTCTTTCCATCAAGAATTCT-3'，下 游引物（引物6)5'- CTCGAGAGGCTTCTGAGCTTCCTCATCG-3'講行PCR擴增所得到的醛酮還原 酶基因產(chǎn)物（核苷酸序列為SEQ ID N0:5)與pGEM-T Easy載體連接，所得重組載體pGEM-T Easy-kakr、pGEM_T Easy-kxr 和 pGEM-T Easy-zbakr 用限制性內(nèi)切酶 Nde I 和 Not I 雙酶 切，形成的醛酮還原酶基因粘性末端分別與表達載體pET28a經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切 反應形成的互補的粘性末端用T4 DNA連接酶連接，生成含有本發(fā)明的醛酮還原酶基因片 段的重組表達載體 pET28a_kakr、pET28a_kxr 和 pET28a_zbakr。
[0012] 本發(fā)明提供一種由所述重組表達載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。通過將本發(fā) 明的重組表達載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領域常規(guī)的各種 宿主微生物，只要能滿足重組表達載體可穩(wěn)定的自行復制，且所攜帶的醛酮還原酶能被有 效表達即可。本發(fā)明優(yōu)選E. coli BL21(DE3)。將本發(fā)明前述的表達質(zhì)粒pET28a-kakr、 pET28a-kxr和pET28a-zbakr通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化至Ε· co I i BL21 (DE3)中，g卩可得 本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即 E. Co I i BL21 (DE3) /pET28a-kakr、E. Co I i BL21 (DE3) / pET28a_kxr 和 Ε· coli BL21 (DE3)/pET28a_zbakr〇
[0013] 本發(fā)明涉及一種所述醛酮還原酶基因在制備重組醛酮還原酶中的應用，所述的應 用為：構(gòu)建含有所述醛酮還原酶基因的重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化至宿主中，優(yōu)選E. coli BL21 (DE3)，獲得的重組基因工程菌誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離，獲得含重組醛酮還原酶的菌體 細胞。所述的誘導培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基可為本領域任何可使菌體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的醛酮還 原酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶劑為水，pH 7.0。 培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，培養(yǎng)方法和條件可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因 素的不同按本領域普通知識進行適當?shù)倪x擇，只要能使轉(zhuǎn)化體能夠生長并產(chǎn)生本發(fā)明所述 的醛酮還原酶即可。其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體具體操作可按本領域常規(guī)操作進行，優(yōu)選下述方法： 將本發(fā)明涉及的重組菌接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當培養(yǎng)基光密度OD 6c?達到 0. 6?0. 8 (優(yōu)選0. 6)時，在終濃度為I. 0?15. Og/L (優(yōu)選9. Og/L)乳糖的誘導下，高效表 達本發(fā)明的重組醛酮還原酶。
[0014] 此外，本發(fā)明還提供一種所述醛酮還原酶在催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己 酸叔丁酯不對稱還原中的應用，具體所述的應用為：以攜帶醛酮還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā) 酵培養(yǎng)獲得的菌體細胞或菌體細胞經(jīng)超聲破碎后的破碎混合液離心獲得的上清液為催化 劑，以6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，以葡萄糖為輔助底物（以葡萄糖為 輔助底物時，在菌體葡萄糖脫氫酶催化作用下將菌體內(nèi)源性氧化型NAD (P) +還原成NAD (P) H，NAD (P) H作為氫供體參與還原反應）或者添加外源性還原型NADH作為底物，以pH7. 0磷 酸鉀緩沖液為反應介質(zhì)構(gòu)成反應體系，在30°C、200轉(zhuǎn)/分鐘條件下進行轉(zhuǎn)化反應，反應完 全后，獲得含6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液經(jīng)固液分離后，將液 體用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯層減壓蒸餾，獲得油狀液體6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸 叔丁酯；所述底物的初始濃度為〇. 01?〇. lmol/L緩沖液（優(yōu)選0. 05mol/L)，所述催化劑 的的用量以菌體細胞濕重計為50?300g/L緩沖液（優(yōu)選200g/L)，所述葡萄糖的用量為 5?50g/L反應體系（優(yōu)選5g/L)，所述NADH的用量為0· 02?0· lmol/L反應體系（優(yōu)選 0. 022mol/L)。制備的樣品6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯d. e.值大于99. 5%，萃取 收率94. 5wt%。本發(fā)明所述反應體系包括下列兩種：（1)以攜帶醛酮還原酶基因的工程菌 經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌體細胞為催化劑，以6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物， 以葡萄糖為輔助底物，以pH7. O磷酸鉀緩沖液為反應介質(zhì)構(gòu)成反應體系；（2)以攜帶醛酮還 原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌體細胞經(jīng)超聲破碎后的破碎混合液離心獲得的上 清液為催化劑，以6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，以外源性還原型NADH 作為底物構(gòu)成反應體系。
[0015] 進一步，所述催化劑為菌體細胞經(jīng)超聲破碎后的破碎混合液離心獲得的上清液， 輔助底物為NADH時，所述底物的初始濃度為0. 02?0. lmol/L反應體系，所述催化劑的體 積用量以破碎前菌體細胞的濕重計為50?120g/L反應體系，所述NADH的用量為0. 02? 0. lmol/L反應體系；具體為：將含醛酮還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌體細胞 用200mm〇l/L，pH7. 0磷酸鉀緩沖液重懸，然后將重懸液超聲破碎，取破碎混合液離心，取 上清液作為催化劑，以6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，以NADH為氫供 體構(gòu)成反應體系，在30°C、200轉(zhuǎn)/分鐘條件下進行轉(zhuǎn)化反應，反應完全后，獲得含6-氰 基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液經(jīng)固液分離后，將液體用乙酸乙酯萃取、 取乙酸乙酯層減壓蒸餾，獲得油狀液體6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯；所述底物的 初始濃度為〇. 01?〇. lmol/L反應體系（優(yōu)選0. 022mol/L)，所述催化劑的體積用量以破碎 前菌體細胞濕重計為50?120g/L反應體系（優(yōu)選100g/L)，所述NADH的用量為0. 01? 0. lmol/L反應體系（優(yōu)選0. 022mol/L)。本發(fā)明所述以NADH為氫供體是指直接以NADH作 為第二底物參與6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯還原反應。
[0016] 本發(fā)明中催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對稱還原得到光學純的 6_氰基_(3R，5R)_二羥基己酸叔丁酯的生物催化劑，可以是將發(fā)酵液（培養(yǎng)物）固液分離 后得到的菌體細胞或者菌體裂解液（粗酶液），也可以是進一步純化得到的醛酮還原酶。
[0017] 本發(fā)明所述生物催化劑按如下方法制備：（1)菌體細胞的制備：將含醛酮還原酶 的重組基因工程菌接種至含有終濃度50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12 小時，獲得種子液；再將種子液以體積濃度1 %的接種量接種到新鮮的含有終濃度50 μ g/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至菌體濃度0D_0. 6?0. 8,然后加入終濃度為 9. 0g/L乳糖，28°C誘導培養(yǎng)12小時后，4°C、9000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，沉淀用生理 鹽水洗滌兩次，4°C、9000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體細胞；(2)超聲破碎：將步驟（1) 收集的菌體細胞與200mmol/L、pH7. 0磷酸鉀緩沖液混合，在功率400W條件下超聲破碎30 分鐘，獲得破碎混合液，將破碎混合液離心，取上清液即為催化劑；所述緩沖液的體積用量 以菌體細胞重量計為10mL/g。
[0018] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明公開的3條來自 K. lactis、Z. bailii的醛酮還原酶首次報道用于6-氰基_(3R, 5R)-二輕基己酸叔丁醋生 物催化合成，制得的樣品6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯達到光學純，幾乎檢測不到 6_氰基_(3S，5R)-二羥基己酸叔丁酯的存在；得益于公開的醛酮還原酶的高差向選擇性， 產(chǎn)物提取收率高。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為PCR擴增電泳圖譜，其中，⑴為kakr基因 PCR擴增后電泳圖；（II)為kxr 基因 PCR擴增后電泳圖；（III)為zbakr基因 PCR擴增后電泳圖。
[0020] 圖2為pGEM-T Easy重組質(zhì)粒物理圖譜，其中，（I)為重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-kakr 物理圖譜；（II)為重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-kxr物理圖譜；（III)為重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-zbakr物理圖譜。
[0021] 圖3為pET28a重組表達質(zhì)粒物理圖譜，其中，（I)為重組質(zhì)粒pET28a-kakr物理 圖譜；（II)為重組質(zhì)粒pET28a-kxr物理圖譜；（III)為重組質(zhì)粒pET28a-zbakr物理圖譜。
[0022] 圖4為重組pGEM-T Easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子PCR鑒定圖，其中，（a)為重組菌KAKR的PCR 電泳圖；(b)為重組菌KXR的PCR電泳圖；（c)為重組菌ZBAKR的PCR電泳圖。
[0023] 圖5為重組pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子PCR鑒定圖，其中，（I)為重組菌KAKR的PCR電泳 圖；（II)為重組菌KXR的PCR電泳圖；（III)為重組轉(zhuǎn)菌ZBAKR的PCR電泳圖。
[0024] 圖6為重組工程菌醛酮還原酶SDS-PAGE電泳圖，其中，⑴為BL21 (DE3) / pET28a-kakr 醛酮還原酶 SDS-PAGE 電泳圖；（II)為 BL21(DE3)//pET28a-kxr 醛酮還原酶 SDS-PAGE 電泳圖；（III)為 BL21 (DE3)//pET28a-zbakr 醛酮還原酶 SDS-PAGE 電泳圖;1 :標 準蛋白質(zhì)分子；2 :未誘導醛酮還原酶工程菌細胞破碎液；3 :乳糖誘導醛酮還原酶工程菌細 胞破碎液；4 :乳糖誘導醛酮還原酶工程菌細胞破碎液上清。 (五）【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0026] 實施例1產(chǎn)醛酮還原酶微生物篩選
[0027] 富集培養(yǎng)基（豆芽汁培養(yǎng)基）：新鮮豆芽汁（新鮮黃豆芽，按100g/L加水煮沸30 分鐘，過濾取豆芽汁，補水至初始體積）100mL/L，葡萄糖50g/L，自然pH，250mL搖瓶分裝，裝 液量50mL，115°C滅菌30分鐘。添加無菌6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯2g/L。 固體培養(yǎng)基：豆芽汁培養(yǎng)基，添加20g/L瓊脂，自然pH。
[0028] 將采集于全國各地的土樣用生理鹽水按一定的比例分散后接種至富集培養(yǎng)基中， 在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24小時。富集培養(yǎng)液逐級稀釋、涂布到固體平 板培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)至形成可觀察到的單菌落。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至無菌斜面，30°C培養(yǎng)2 天，斜面置于4°C冰箱保藏。
[0029] 將保藏在試管斜面中的菌株逐一接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、150轉(zhuǎn)/分鐘條件 下培養(yǎng)48小時。分別移取20mL培養(yǎng)物，離心，收集菌體，并用50mM磷酸鉀緩沖液（pH8. 0) 洗滌菌體2次。將菌體分散于10. OmL上述緩沖液中，添加6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸 叔丁酯，使其終濃度達到5. Og/L，添加葡萄糖，使其終濃度達到5. Og/L，35°C，200轉(zhuǎn)/分鐘 轉(zhuǎn)化12小時，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心、0. 22 μ m微孔濾膜過濾，液相色譜分析醛酮還原酶活性和選擇 性，最終篩選到兩株菌，在上述反應條件下，產(chǎn)物得率和d.e.值分別為25. 6%和89. 7%， 以及30. 4%和92. 5%，記為菌株XP1461和菌株XP1462。
[0030] 檢測方法：高效液相色譜法層頂?shù)孜锱c產(chǎn)物的濃度，檢測條件：0DS-2C18柱 (4. 6X250mm，5 μπι)，流動相乙腈：水=1:3 (v/v)，柱溫40°C，流速lmL/min，紫外檢測波長 210_，進樣量20以匕6-氰基-(35,51〇-二羥基己酸叔丁酯、6-氰基-(31?，51〇-二羥基己 酸叔丁酯、6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯保留時間分別為7. 4分鐘、8. 1分鐘、 12. 5分鐘。
[0031] 表1:利用Vitek 2微生物自動鑒定系統(tǒng)分析菌種XP1461結(jié)果
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種醛酮還原酶基因，其特征在于所述醛酮還原酶基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 5 中的一種。
2. -種權(quán)利要求1所述醛酮還原酶基因編碼的醛酮還原酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 6 中的一種。
4. 一種權(quán)利要求1所述醛酮還原酶基因構(gòu)建的重組表達載體。
5. -種由權(quán)利要求4所述重組表達載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6. -種權(quán)利要求2所述醛酮還原酶在催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯 不對稱還原中的應用，其特征在于所述的應用為：以含醛酮還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)獲得的菌體細胞或菌體細胞經(jīng)超聲破碎后的破碎混合液離心獲得的上清液為催化劑，以 6_氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，以葡萄糖或NADH為輔助底物，以pH7. 0磷 酸鉀緩沖液為反應介質(zhì)構(gòu)成反應體系，在30°C、200轉(zhuǎn)/分鐘條件下進行轉(zhuǎn)化反應，反應完 全后，獲得含6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液經(jīng)固液分離后，將液體 用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯層減壓蒸餾，獲得油狀液體6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔 丁酯；所述底物的初始濃度為〇. 01?〇. lmol/L反應體系，所述催化劑的用量以菌體細胞濕 重計為50?300g/L反應體系，所述葡萄糖的用量為5?50g/L反應體系，所述NADH用量 為0. 02?0. lmol/L反應體系。
7. 如權(quán)利要求6所述醛酮還原酶在催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對 稱還原中的應用，其特征在于所述催化劑為菌體細胞經(jīng)超聲破碎后的破碎混合液離心獲得 的上清液，輔助底物為NADH時，所述底物的初始濃度為0. 02?0. lmol/L反應體系，所述催 化劑的體積用量以破碎前菌體細胞的濕重計為50?120g/L反應體系，所述NADH的用量為 0. 02?0. lmol/L反應體系。
8. 如權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于催化劑按如下方法制備：（1)菌體細胞的制 備：將含醛酮還原酶的重組基因工程菌接種至含有終濃度50 yg/mL卡那霉素的LB液體培 養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12小時，獲得種子液；再將種子液以體積濃度1 %的接種量接種到新鮮的含 有終濃度50 y g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體濃度0D6J). 6?0. 8,然 后加入終濃度為9. 0g/L乳糖，28°C誘導培養(yǎng)12小時后，4°C、9000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘， 棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌兩次，收集濕菌體；（2)超聲破碎：將步驟（1)收集的濕菌體 與200mmol/L、pH7. 0磷酸鉀緩沖液混合，在功率400W條件下超聲破碎30分鐘，獲得破碎混 合液，將破碎混合液離心，取上清液即為催化劑；所述緩沖液的體積用量以濕菌體重量計為 10mL/g〇
9. 一種提供權(quán)利要求1所述SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3所示醛酮還原酶基因的菌株， 所述菌株為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏日期為2014年8月14日，保藏編號為CCTCC NO :M 2014380,保藏地址為中國武 漢武漢大學，郵編430072。
10. -種提供權(quán)利要求1所述SEQ ID No. 5所示醛酮還原酶基因的菌株，所述菌株為拜 耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)XP1462,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 日期為2014年8月14日，保藏編號為CCTCC NO :M 2014381，保藏地址為中國武漢武漢大 學，郵編430072。
【文檔編號】C12P13/00GK104498510SQ201410641987
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】鄭裕國, 王亞軍, 羅希, 劉小青 申請人:浙江工業(yè)大學