一種組合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，將進(jìn)行脫淀粉處理的黃姜原料粉碎，得到黃姜?dú)堅?；以黃姜?dú)堅鼮槲ㄒ惶荚磁渲瓢l(fā)酵培養(yǎng)基；加入里氏木霉，綠色木霉和煙曲霉組合菌進(jìn)行發(fā)酵；將發(fā)酵產(chǎn)物過濾后烘干，用有機(jī)溶劑提取并得到結(jié)晶；即得到薯蕷皂素。本發(fā)明提供的制備方法處理簡單，污染少，并且可有效提高微生物發(fā)酵效率，產(chǎn)物的率高。
【專利說明】一種組合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種薯蕷皂素的生產(chǎn)方法，特別涉及一種組合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]薯蕷皂素，是合成留體激素藥物的重要中間體，廣泛應(yīng)用于消炎鎮(zhèn)痛，腦血管，避孕藥物的合成中。素有激素之母的美譽(yù)。世界上60%的留體激素類藥物都是以薯蕷皂素為原料進(jìn)行生產(chǎn)的，對其需求量非常大。中國是薯蕷皂素生產(chǎn)和出口的大國，主要是從薯蕷屬植物(盾葉薯蕷和穿龍薯蕷)中提取皂素的。其中盾葉薯蕷(俗名黃姜)是我國的特有品種，種植面積大，薯蕷皂素的含量高。
[0003]薯蕷皂素一般以薯蕷皂苷的形式存在于植物根莖中，既在薯蕷皂素配基的C-3和C-26位連接不同的糖基形成的。水解這兩個位置的糖基即可得到薯蕷皂素。工業(yè)中一般利用強(qiáng)酸(H2SO4或HCl)在高溫高壓的條件下水解黃姜根莖獲得薯蕷皂素，該過程稱為酸水解。酸水解產(chǎn)生大量高C0D，高鹽，高色度的強(qiáng)酸性廢水，非常難處理，嚴(yán)重污染當(dāng)?shù)丨h(huán)境。
[0004]與酸水解相比，生物催化反應(yīng)條件溫和，專一性強(qiáng)，是一種環(huán)境友好的方法。利用微生物或酶水解黃姜制備屬于皂素已有報道。但是現(xiàn)有技術(shù)中酶水解成本較高，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)，而微生物水解可以解決成本問題，但是效率不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供低成本，效率高的微生物法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種組合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，所述方法采用里氏木霉，綠色木霉和煙曲霉組合發(fā)酵黃姜得到薯蕷皂素。其中里氏木霉，綠色木霉和煙曲霉均購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，其中里氏木霉ACCC30597，綠色木霉ACCC30048和煙曲霉ACCC30556。
[0007]所述方法的具體步驟包括:
a.菌種的馴化:首先采用低濃度的黃姜乙醇提取物分別對前述三種菌種進(jìn)行馴化培養(yǎng)，循環(huán)馴化多次后取薯蕷皂素含量最高的霉菌孢子再次轉(zhuǎn)接至高濃度的黃姜乙醇提取物馴化培養(yǎng)液中繼續(xù)馴化，最后將菌種保存在50%的黃姜乙醇提取物中。
[0008]其中黃姜乙醇提取物為90%乙醇提取物，即為總皂苷。
[0009]b.黃姜的預(yù)處理:黃姜原料洗凈后烘干、粉碎、過篩，然后進(jìn)行脫淀粉處理，再次粉碎過篩后，得到黃姜?dú)堅?br> c.菌種活化培養(yǎng):從馴化后的菌種分別挑取孢子接種于活化培養(yǎng)基中，循環(huán)活化，活化后進(jìn)行種子培養(yǎng)；
d.組合發(fā)酵:首先接種步驟C中得到綠色木霉，發(fā)酵一段時間后接種步驟C中得到的里氏木霉，繼續(xù)發(fā)酵一段時間后，接種步驟C中得到的煙曲霉發(fā)酵一段時間，得到發(fā)酵產(chǎn)物；
e.產(chǎn)物處理:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾后烘干，用有機(jī)溶劑提取，結(jié)晶干燥后得到產(chǎn)物。
[0010]進(jìn)一步，所述步驟a中的菌種馴化的具體方法為:將里氏木霉，綠色木霉和煙曲霉分別接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，第一次馴化時，向培養(yǎng)基中加入1%黃姜乙醇提取物(即總皂苷濃度)，30 °C水浴振蕩培養(yǎng)7 d;循環(huán)馴化3次后，選擇薯蕷皂素含量最高搖瓶中的霉菌孢子轉(zhuǎn)接至5%黃姜乙醇提取物(總皂苷濃度)馴化培養(yǎng)液中；依前述方法馴化10%和15%濃度，最后保存于50%黃姜乙醇提取物(總皂苷濃度)中。
[0011]進(jìn)一步，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基為NaNO3 0.3% ；K2HPO4 0.1% ；FeS04 0.001% ；KC1
0.05% ；MgS04.7H20 0.05% ； pH 值 6.6。
[0012]進(jìn)一步，所述菌種馴化后的保藏培養(yǎng)基為黃姜乙醇提取物(總皂苷濃度)50%;NaNO3 0.3% ；K2HPO4 0.1% ；FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgS04.7H20 0.05% ； pH 值 6.6。
[0013]進(jìn)一步，步驟b中黃姜的預(yù)處理兩次過篩均為60目篩。
[0014]進(jìn)一步，步驟c中菌種活化培養(yǎng)基為黃姜乙醇提取物(總皂苷濃度)5% ;NaN03
0.3% ；K2HPO4 0.1% ； FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgS04.7H20 0.05% ； pH 值 6.6。
[0015]進(jìn)一步，步驟c中菌種的種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。
[0016]進(jìn)一步，步驟d中組合發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基為黃姜?dú)堅?5-30%，Tween 80 1-1.2%,蛋白胨2.5-3%, K2HPO4 0.2-0.3%, pH 5.5-6 ;置于超聲發(fā)生器中，25_50KHz超聲15min ;超聲后的培養(yǎng)基121 ° C滅菌30min。
[0017]進(jìn)一步，步驟d中組合發(fā)酵的發(fā)酵條件為:固體淺盤發(fā)酵室，相對濕度75-80%，溫度30-35° C,通無菌空氣200 mL/min。首先接種里氏木霉,攪拌均勻，發(fā)酵I天后接種綠色木霉，攪拌均勻，發(fā)酵I天后接種煙曲霉攪拌均勻發(fā)酵5天。
[0018]進(jìn)一步，，所述固態(tài)淺盤發(fā)酵室外設(shè)有空氣壓縮泵，室外空氣從空氣壓縮泵出來后，通過0.45 μ m濾膜過濾后，進(jìn)入水浴鍋，從水浴鍋出來后變成無菌空氣，通過通氣管進(jìn)入發(fā)酵室，然后分別通過穿孔通氣管進(jìn)入每個固態(tài)發(fā)酵架中。
[0019]進(jìn)一步，所述發(fā)酵室的出氣口采用4層紗布過濾。
[0020]進(jìn)一步，步驟d中各菌種的接種濃度為:里氏木霉的接種濃度為16-1O7個孢子/g，所述綠色木霉的接種濃度為17-1O8個孢子/g。所述煙曲霉的接種濃度為17-1O8個孢子/g，其中g(shù)為黃姜?dú)堅亓俊?br> [0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明利用組合微生物發(fā)酵替代單一微生物發(fā)酵，解決了單一微生物發(fā)酵皂素得率低的問題。綠色木霉主要分泌纖維素酶，將皂苷從纖維素的包裹中釋放出來，里氏木霉主要分泌糖苷酶，水解皂苷糖鏈末端的葡萄糖和鼠李糖。煙曲霉主要分泌皂苷水解酶，水解皂苷C-3位的葡萄糖基生成皂素。三種菌按順序添加，協(xié)同作用，共同發(fā)酵可以顯著提高皂素得率。
[0022]進(jìn)一步,本發(fā)明利用固態(tài)發(fā)酵替代傳統(tǒng)的液態(tài)發(fā)酵,解決了液態(tài)發(fā)酵用水量大，生產(chǎn)效率低的問題，同時使用淺盤固態(tài)發(fā)酵，成本低，操作簡單，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中一種固態(tài)淺盤發(fā)酵室的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024]圖2是圖1中一個固態(tài)發(fā)酵架的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]I紫外燈管，2濕度控制器，3空調(diào)，4固態(tài)發(fā)酵架，5空氣壓縮泵，6穿孔通氣管，7固態(tài)發(fā)酵淺盤，8 0.45um濾膜，9水浴鍋，10 4層紗布，11出氣口，12攪拌耙。
[0026]

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0028]實(shí)施例1
一種組合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)黃姜中薯蕷皂素的方法，具體步驟如下:
黃姜的預(yù)處理步驟:1kg黃姜洗凈，60° C烘干，粉碎，過60目篩。置于1L反應(yīng)釜中，加入6L水。100 °(:水浴煮沸I h。冷卻后加入20g淀粉酶(2000IU/g) 70 °C，pH 6.5液化I h,再加入30 g糖化酶(10000 IU/g)，60 °C, pH 4糖化6 h。冷卻，板壓過濾，60° C烘干，粉碎，過60目篩，得到268g黃姜?dú)堅?br> [0029]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:200g黃姜?dú)堅?，Tween 80 12g，蛋白胨30g，K2HPO4 3g，pH 6.去離子水800mL，置于超聲發(fā)生器中，25-50KHz超聲15min。置于固體發(fā)酵淺盤中，蓋上四層紗布蓋，121 ° C滅菌30min。滅完菌的固態(tài)發(fā)酵淺盤，置于固態(tài)淺盤發(fā)酵器中，控制相對濕度75-80%，溫度30-35° C，通無菌空氣200 mL/min。
[0030]其中圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中一種固態(tài)淺盤發(fā)酵室的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2是圖1中一個固態(tài)發(fā)酵架的結(jié)構(gòu)示意圖。結(jié)合圖1和圖2可知，固態(tài)發(fā)酵室的頂部設(shè)有紫外燈1，用于室內(nèi)滅菌。室內(nèi)底部兩側(cè)邊分別設(shè)有溫度控制器2，配合空調(diào)3，用于控制室內(nèi)溫度。室內(nèi)并排放置多個固態(tài)發(fā)酵架4，每個發(fā)酵架4上設(shè)有多層固體發(fā)酵淺盤7，發(fā)酵架4的兩側(cè)和每層固態(tài)發(fā)酵淺盤7上均設(shè)置有穿孔通氣管6，用于無菌空氣的輸送，發(fā)酵架4上還設(shè)有攪拌耙12，用于固體發(fā)酵過程中的攪拌。其中在固體發(fā)酵室外部設(shè)有空氣壓縮泵5，從空氣壓縮泵5出來的壓縮空氣首先通過0.45 μ m的濾膜8，然后通過水浴鍋9，得到無菌空氣，輸送至穿孔通氣管6中，用于固態(tài)發(fā)酵。為了保證室內(nèi)空氣的無菌，出氣口 11處設(shè)置了 4層紗布10對空氣進(jìn)行過濾。
菌種保藏培養(yǎng)基:總皂苷 50% ；NaNO3 0.3% ；K2HPO4 0.1% ；FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgSO4.7H20 0.05% ； pH 6.6 121 0C 滅菌 30 min。
[0031]菌種活化培養(yǎng)基:總皂苷5% ；NaN03 0.3% ；K2HPO4 0.1% ；FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgSO4.7H20 0.05% ； pH 6.6，采用 500mL 搖瓶，裝液量 50mL。121 °C 滅菌 30 min。
[0032]菌種種子培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基，采用500mL搖瓶，裝液量100mL。
[0033]種子的活化:從菌種保藏平板上挑取霉菌孢子接種于活化培養(yǎng)基中，30 0C,150rpm震蕩培養(yǎng)2天后再靜止培養(yǎng)五天。循環(huán)活化3次。
[0034]種子的培養(yǎng):取Iml活化后的霉菌孢子，接種于活化培養(yǎng)基中，30 °C, 150rpm震蕩培養(yǎng)2天后再靜止培養(yǎng)五天。
[0035]發(fā)酵過程首先接種綠色木霉(17-1O8個孢子/g)，攪拌均勻，發(fā)酵I天后接種里氏木霉16-1O7個孢子/g，攪拌均勻，發(fā)酵I天后接種煙曲霉(17-1O8個孢子/g)攪拌均勻發(fā)酵5天。其中g(shù)為黃姜?dú)堅亓俊?br> [0036]所獲的產(chǎn)物板壓過濾，60 °C烘干。
[0037]發(fā)酵產(chǎn)物120#汽油索氏提取，結(jié)晶干燥后得產(chǎn)物，24.7g，其純度為98%，既薯蕷皂素得率為2.42%ο
[0038]本發(fā)明雖然已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并不是用來限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出可能的變動和修改，因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍 。
【權(quán)利要求】
1.一種組合微生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，其特征在于，所述方法采用里氏木霉，綠色木霉和煙曲霉組合發(fā)酵黃姜得到薯蕷皂素，具體步驟包括: a.菌種的馴化:首先采用低濃度的黃姜乙醇提取物分別對前述三種菌種進(jìn)行馴化培養(yǎng)，循環(huán)馴化多次后取薯蕷皂素含量最高的霉菌孢子再次轉(zhuǎn)接至高濃度的黃姜乙醇提取物馴化培養(yǎng)液中繼續(xù)馴化，最后將菌種保存在50%的黃姜乙醇提取物中； b.黃姜的預(yù)處理:黃姜原料洗凈后烘干、粉碎、過篩，然后進(jìn)行脫淀粉處理，再次粉碎過篩后，得到黃姜?dú)堅? c.菌種活化培養(yǎng):從馴化后的菌種分別挑取孢子接種于活化培養(yǎng)基中，循環(huán)活化，活化后進(jìn)行種子培養(yǎng)； d.組合發(fā)酵:首先接種步驟C中得到綠色木霉，發(fā)酵一段時間后接種步驟C中得到的里氏木霉，繼續(xù)發(fā)酵一段時間后，接種步驟C中得到的煙曲霉發(fā)酵一段時間，得到發(fā)酵產(chǎn)物； e.產(chǎn)物處理:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾后烘干，用有機(jī)溶劑提取，結(jié)晶干燥后得到產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟a中的菌種馴化的具體方法為:將里氏木霉，綠色木霉和煙曲霉分別接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，第一次馴化時，向培養(yǎng)基中加入1%黃姜乙醇提取物，30 °C水浴振蕩培養(yǎng)7 d;循環(huán)馴化3次后，選擇薯蕷皂素含量最高搖瓶中的霉菌孢子轉(zhuǎn)接至5%黃姜乙醇提取物馴化培養(yǎng)液中；依前述方法馴化10%和15%濃度，最后保存于50%黃姜乙醇提取物中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基為NaNO30.3% ；K2HPO40.1% ；FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgS04.7H20 0.05% ； pH 值 6.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌種馴化后的保藏培養(yǎng)基為黃姜乙醇提取物 50% ；NaN03 0.3% ；Κ2ΗΡ04 0.1% ；FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgS04.7H20 0.05% ；pH 值 6.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中菌種活化培養(yǎng)基為黃姜乙醇提取物 5% ；NaNO3 0.3% ；K2HPO4 0.1% ；FeS04 0.001% ；KC1 0.05% ；MgS04.7H20 0.05% ； pH 值6.6ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d中組合發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基為黃姜?dú)堅?25-30%, Tween 80 1-1.2%，蛋白胨 2.5-3%, K2HPO4 0.2-0.3%, pH 5.5-6 ;置于超聲發(fā)生器中，25-50KHz超聲15min ;超聲后的培養(yǎng)基121。C滅菌30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d中組合發(fā)酵的發(fā)酵條件為:固體淺盤發(fā)酵室，相對濕度80-90%，溫度30-35° C，通無菌風(fēng)1-1.5vvm ;首先接種里氏木霉，攪拌均勻，發(fā)酵I天后接種綠色木霉，攪拌均勻，發(fā)酵I天后接種煙曲霉攪拌均勻發(fā)酵5天。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述固態(tài)淺盤發(fā)酵室外設(shè)有空氣壓縮泵，室外空氣從空氣壓縮泵出來后，通過0.45 μ m濾膜過濾后，進(jìn)入水浴鍋，從水浴鍋出來后變成無菌空氣，通過通氣管進(jìn)入發(fā)酵室，然后分別通過穿孔通氣管進(jìn)入每個固態(tài)發(fā)酵架中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵室的出氣口采用4層紗布過濾。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d中各菌種的接種濃度為:里氏木霉的接種濃度為16-1O7個孢子/g，所述綠色木霉的接種濃度為17-1O8個孢子/g;所述煙曲霉的接種濃度為17-1O8個孢子/g，其中g(shù)為黃姜?dú)堅亓俊?br> 【文檔編號】C12R1/885GK104073542SQ201410284977
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】朱余玲 申請人:紹興文理學(xué)院