一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法，該分子標記具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，該鑒定方法以大豆植物組織基因組DNA為模板，所述分子標記為目的基因，進行PCR擴增，獲得擴增片段，用以判斷大豆細胞核的育性；該方法提供了一種新的大豆細胞核雄性不育系的鑒定途徑，適合于大豆細胞核雄性不育系的早期鑒定，還提供了一對具有如SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列的特異性引物，該引物獲得的擴增片段長度適中，與降解的小片段序列差異明顯，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，同時電泳條帶清晰、亮度高，鑒定結(jié)果一目了然，大豆細胞核雄性不育系的檢出率高。
【專利說明】一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種大豆的分子標記【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]雄性不育系是作物雜種優(yōu)勢利用的極好材料，具有重要的理論價值和實際應(yīng)用價值，其研究成果可為應(yīng)用基因工程手段創(chuàng)新、改良不育系，解決育性穩(wěn)定等問題提供有理的理論依據(jù)。1993年吉林省農(nóng)科院孫寰等發(fā)現(xiàn)世界上第一個大豆細胞質(zhì)雄性不育系，目前，我國已實現(xiàn)了大豆的“三系”配套栽培，并對大豆的遺傳規(guī)律進行了深入的研究。大豆細胞質(zhì)雄性不育“三系”包括不育系、保持系和恢復(fù)系構(gòu)成，不育系做母本與恢復(fù)系父本雜交，可獲得雜交種。其中，保持系和恢復(fù)系由于自身可育，種子可由自交繁殖獲得，而不育系只能通過其作為母本，與同型的保持系父本雜交獲得種子。在田間繁殖過程中，常常由于田間種植、收獲脫粒等環(huán)節(jié)造成不育系中混雜保持系的后果，導致收獲的雜交種總因混入了不育系而導致純度下降，這樣的種子在生產(chǎn)上種植，必然導致減產(chǎn)，因此，大豆雄性不育系的早期鑒定顯得尤為重要。
[0003]中國專利文獻“一種分子標記鑒定大豆細胞質(zhì)雄性不育系種子純度的方法”(CN103160599A)提供了一種利用分子標記法鑒定大豆RN型細胞質(zhì)雄性不育系的方法，該方法以大豆RN型細胞質(zhì)雄性不育系種子的基因組DNA為模板進行PCR擴增，其中擴增后的不育系片段長度為200bp，保持系擴增后的片段長度為212bp，最終通過片段長度差異將不育系和保持系區(qū)分開，但該發(fā)明中，不育系和保持系擴增后的片段長度差異只有12bp，利用常規(guī)的凝膠電泳并不能非常準確地將兩者區(qū)分開來；此外，由于此方法針對的是大豆細胞質(zhì)不育系，目前尚無關(guān)于大豆細胞核雄性不育分子鑒定的有效方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法，以提供一種簡單精確的大豆細胞核雄性不育系的分子鑒定方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟:
[0006]一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記，所述分子標記具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
[0007]—種利用上述分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](I)提取大豆植物組織基因組DNA，以所述分子標記的核苷酸序列為模板設(shè)計引物，進行PCR擴增，獲得擴增片段；
[0009](2)若上述步驟(1)中能夠獲得所述分子標記的核苷酸序列，則上述步驟(1)的大豆為細胞核雄性不育系大豆；若不能，則為細胞核雄性可育系大豆。
[0010]優(yōu)選地，所述步驟(1)中，引物的核苷酸序列為:
[0011]上游引物:SEQID NO:2:5’ GTTAGGTGGGTAGGTGAG3’ ；
[0012]下游引物:SEQID NO:3:5，ACATAGTGTCGGAGTGG3，；
[0013]利用上述優(yōu)選的特異性引物，以大豆植物組織基因組DNA為模板，進行PCR擴增，若能夠獲得長度為1239bp的擴增片段，則所述大豆為細胞核雄性不育系大豆，若不能獲得長度為1239bp的擴增片段，則為細胞核雄性可育系大豆，所述長度為1239bp的擴增片段即為所述分子標記的核苷酸片段。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(1)的PCR擴增程序為:95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，起始退火溫度58°C，以后每循環(huán)降低0.3°C，退火時間為40s，72°C延伸90s，設(shè)38個循環(huán)，最后72 °C繼續(xù)延伸15min。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟(1)的大豆植物組織選自葉片、根尖、種子和種皮中的一種。
[0016]本發(fā)明的原理為:本發(fā)明首先利用QTL定位，將控制大豆細胞核雄性不育系育性的基因定位在一個很小的區(qū)間，根據(jù)QTL定位結(jié)果，該區(qū)間只有4個候選基因，通過對候選區(qū)間的4個候選基因進行遺傳多樣性的分析，最終開發(fā)出一條能夠用于鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記基因，并在該分子標記的基礎(chǔ)上開發(fā)出一條可以用于檢測大豆及其后代育性的早期鑒定的引物，利用該對引物可在大豆開花前的任何時期實現(xiàn)對育種材料的雄性不育性的判斷，且準確率100%，因此可在育種早期剔除可育個體，提高了大豆雜交制種的效率，本發(fā)明為大豆雜種優(yōu)勢的利用提供了一種高效的檢測方法。
[0017]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點:本發(fā)明提供了一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法，提供了一種新的大豆細胞核雄性不育系的鑒定途徑，適合于大豆細胞核雄性不育系的早期鑒定；本發(fā)明還提供了一對特異性引物，利用該引物能夠獲得長度為1239bp的擴增片段，即為所述的分子標記的核苷酸序列，其片段長度大小適中，與PCR過程中降解的小片段序列差異明顯，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，同時電泳條帶清晰、亮度高，鑒定結(jié)果一目了然，大豆雄性不育系的檢出率達100%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為實施例1的12種大豆細胞核雄性不育系的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中，1_6為可育株，7-12為不育株。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0020]實施例1
[0021]本實施例的一種利用分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，包括以下步驟:
[0022]1、DNA 提取:
[0023]選取中品661的細胞核雄性不育系品種ANMS-Ol (該細胞核雄性不育系品種是利用鈷60輻照中品661篩選獲得的)與中黃13大豆品種雜交后代F2分離群體，其中可育個體6株，不育個體6株，每株分別取3粒外觀和飽滿度較好的大豆種子，用打孔器磨出豆粉10mg左右放入L5ml離心管中，加入0.7ml SDS提取緩沖液(配方為:NaC1288mmol/L, Tris-HC1200mmol/L, EDTA25mmol/L，質(zhì)量百分比為 0.5%的 SDS)，用 0.7ml 酚:氯仿--異戊醇(體積比為25: 24: I)抽提除去蛋白質(zhì)，重復(fù)一次，經(jīng)異丙醇和NaAc (pH5.2)沉淀，70%乙醇漂洗后，真空干燥。紫外分光光度檢測DNA濃度，-20°C保存?zhèn)溆茫@得12種大豆基因組DNA。
[0024]2、以上述提取的12種大豆基因組DNA為模板，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述序列為特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增片段；
[0025]上游引物:SEQID NO:2:5’ GTTAGGTGGGTAGGTGAG3’ ；
[0026]下游引物:SEQID NO:3:5，ACATAGTGTCGGAGTGG3，；
[0027]PCR擴增的反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系為20μ 1，含(ΜΗ2012.8μ 1，10XPCR ExBuffer2.0 μ 1,2.5mM dNTP2.0 μ 1，10 μ M如 SEQ ID N0.1 所示的引物序列 0.5 μ I, 10 μ M如SEQ ID N0.2 所示的引物序列 0.5 μ l,5U/y I 的 Takara Ex-Taq0.2 μ l，50ng/ul 大豆基因組 DNA2μ I。
[0028]PCR擴增的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，起始退火溫度58°C，以后每循環(huán)降低0.3°C，退火時間為40s，72°C延伸90s，設(shè)38個循環(huán)，最后72°C繼續(xù)延伸15min。
[0029]3、瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0030]將上述PCR擴增獲得的擴增片段用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳的緩沖體系為I倍的TAE溶液，在100V恒壓下，電泳50分鐘，紫外燈下拍照并保存；
[0031]若能夠獲得長度大小為1239bp的擴增片段，則上述大豆為細胞核雄性不育系大豆；若不能獲得長度大小為1239bp的擴增片段，則為細胞核雄性可育系大豆。
[0032]4、結(jié)果
[0033]附圖1為本實施例1瓊脂糖凝膠電泳的具體實驗結(jié)果圖，其中M為Marker5000，泳道1-6為6株中黃13與ANMS-Ol雜交后代的F2分離群體中雄性不育個體PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，泳道7-12為相同分離群體中6株雄性可育個體PCR獲得的片段的凝膠電泳結(jié)果，由圖1的檢測結(jié)果可以看出，該分子標記對大豆雄性不育的檢出率達100%。
[0034]實施例2
[0035]本實施例的一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記的方法，包括以下步驟:
[0036](I)選取ANMS-Ol與中黃13大豆品種雜交后代F2分離群體的種子和種皮組織，待該分離群體播種出苗后，采集葉片和根尖組織，分別提取上述4種組織的基因組DNA，然后以上述4種組織的DNA為模板，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述序列為特異性引物，分別進行PCR擴增，獲得擴增片段。
[0037](2)鑒定結(jié)果:4種組織的DNA均擴增獲得了長度為1239bp的片段，判定該4種組織對應(yīng)的大豆品種均為細胞核雄性不育系大豆。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記，其特征在于，所述分子標記具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述的分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取大豆植物組織基因組DNA，以所述分子標記的核苷酸序列為模板設(shè)計引物，進行PCR擴增，獲得擴增片段； (2)若上述步驟(1)中能夠獲得所述分子標記的核苷酸序列，則上述步驟(1)的大豆為細胞核雄性不育系大豆；若不能，則為細胞核雄性可育系大豆。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，引物的核苷酸序列為:
上游引物:SEQ ID NO:2:5’ GTTAGGTGGGTAGGTGAG3’ ；
下游引物:SEQ ID NO:3:5’ ACATAGTGTCGGAGTGG3’ ； 所述步驟(2)中，若能夠獲得長度為1239bp的擴增片段，則所述大豆為雄性不育系大豆，若不能獲得長度為1239bp的擴增片段，則為雄性可育系大豆。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，其特征在于，所述步驟(1)的PCR擴增程序為:95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，起始退火溫度58°C，以后每循環(huán)降低0.3°C，退火時間為40s，72°C延伸90s，設(shè)38個循環(huán)，最后72°C繼續(xù)延伸15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，其特征在于，所述步驟(1)的大豆植物組織選自葉片、根尖、種子和種皮中的一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131012SQ201410328901
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】王曉波, 張浩偉, 高雅麗, 張文明 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學