一種豬腦心肌炎病毒hb10株感染性克隆質(zhì)粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬腦心肌炎病毒HB10株感染性克隆質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，提供人工合成5′UTR和3′UTR序列并在中間加入多克隆位點(MCS)的方法，得到中間質(zhì)粒pOK12-EMCV-5′UTR-MCS-3′UTR。本發(fā)明在合成EMCV5′UTR時，將polyC的堿基設(shè)定為15個。本發(fā)明利用設(shè)計的特異引物和特定的PCR反應(yīng)條件，快速擴增EMCV基因組F1片段(6699bp)，并成功地連接到pOK12-5′UTR-MCS-3′UTR質(zhì)粒，得到pOK12-rEMCV-H10B質(zhì)粒，該cDNA感染性克隆質(zhì)粒命名為pOK12-rEMCV-H10B。利用該質(zhì)粒成功拯救出病毒-rEMCV-HB10，該拯救毒與母本病毒相比毒力減弱。利用EMCV-HB10的cDNA感染性克隆可以研究EMCV病毒致弱機理及開發(fā)EMCV低毒力的減毒疫苗。利用該病毒的cDNA感染性克隆為載體插入不同病毒保護性抗原基因，構(gòu)建不同嵌合病毒，以及由此開發(fā)出雙價或多價疫苗及其他可能的應(yīng)用。
【專利說明】一種豬腦心肌炎病毒HB10株感染性克隆質(zhì)粒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種EMCV-HB10株cDNA感染性克隆質(zhì)粒 及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV)屬于小RNA病毒科，心病 毒屬，無囊膜單股正鏈RNA病毒。該病毒主要引起多種哺乳動物發(fā)生心肌炎和腦炎等疾病。 1958年，該病毒首次在巴拿馬分離。EMCV基因組長約為7. 8kb，編碼一個大的開放性閱讀 框（0RF)，該0RF共編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4)和8個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2B*、 2C、3A、3B、3C、3D)。
[0003] 已有報道證明EMCV的主要宿主是豬，對不同年齡的豬都能感染，通常引起仔豬突 然死亡以及母豬繁殖障礙。歐洲、亞洲、北美洲、南美和非洲均有豬感染EMCV的報道，該病 毒對歐洲（包括德國、意大利、比利時、希臘等國家）養(yǎng)豬業(yè)的危害最為嚴重。目前，已經(jīng)從 我國多個豬群中分離到EMCV，通過對我國部分地區(qū)規(guī)模豬場（2006?2007年）保留的血 清樣品的中和試驗分析，我國豬群EMCV血清抗體陽性率平均為52. 45% (35%?70. 81% ) 說明我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)已經(jīng)受到EMCV的威脅。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種EMCV-HB10株cDNA感染性克隆質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與 應(yīng)用，旨在通過研究EMCV病毒的致弱機制、復(fù)制機制及弱毒疫苗的研制和嵌合病毒的構(gòu)建 以實現(xiàn)在EMCV防控中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種EMCV-HB10株感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下 步驟：
[0006] ⑴根據(jù)EMCV HB10基因序列設(shè)計擴增引物：
[0007] EMCV-F1-F :GACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTC(含 Hind III 酶切位點）
[0008] EMCV-F1-R :TTAGCATTGAGGTCGCTGCACAAC (含 Afe I 酶切位點）；
[0009] (2)將合成的 EMCV5 ' UTR-MCS-3 ' UTR 片段用 EcoR I、BamH I 從 pGH-EMCV-5^ UTR-MCS-3^ UTR-質(zhì)粒上酶切，回收純化產(chǎn)物與p0K12載體進行連接，得到質(zhì) 粒 pOKU-EMCV-S' UTR-MCS-3，UTR;
[0010] (3)用特異引物EMCV-F1-F、EMCV-F1-R對EMCV基因的cDNA進行擴增，得到F1目 的片段，用出11(11114€6 1雙酶切？1片段和質(zhì)粒口01(124]\1〇^^1?-]\?^-3,^1?，回收、 連接，得到全長P〇K12-rEMCV-HB10克隆質(zhì)粒。
[0011] 優(yōu)選地，在步驟（2)中，所述合成的5' UTR-MCS-3' UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0012] 優(yōu)選地，在步驟（3)中，所述F1目的片段為5'端和3'端分別加入Hind III、 Afe I酶切位點后的EMCV-HB10株基因組的F1片段，該基因在基因庫中的序列號為 GenBank:JQ864080. 1。
[0013] 本發(fā)明進一步提供了上述EMCV-HB10株cDNA感染性克隆質(zhì)粒在病毒拯救方面的 應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種EMCV-HB10株感染性克隆質(zhì)粒及其構(gòu)建方 法與應(yīng)用，通過人工合成的EMCV5' UTR和3' UTR，如序列表SEQIDN0. 1所示，人為減少 了 5' UTR中Poly C的長度，同時利用病毒粒子中提取的RNA和設(shè)計的特異引物，成功擴增 到了 EMCV基因組F1片段（6699bp)的開放閱讀框核苷酸，能夠?qū)崿F(xiàn)快速簡便的構(gòu)建EMCV 的cDNA感染性克隆，得到的感染性克隆也由于PolyC長度的改變，毒力得到減弱。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明實施例1中EMCV-HB10全基因組序列的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016] 圖2是本發(fā)明實施例1中p0K12-rEMCV-HB10全長質(zhì)粒的構(gòu)建過程示意圖；
[0017] 圖3是本發(fā)明中實施例1中EMCVHB10株基因組全長cDNA克隆到p0K12載體構(gòu)建 酶切圖；其中，圖A是人工合成的5' UTR-MCS-3' UTR構(gòu)建到p0K12載體酶切示意圖，圖A 泳道1為pGH-5^ UTR-MCS-3^ UTR質(zhì)粒EcoR I、BamH I雙酶切鑒定示意圖，其中1117bp 片段為人工合成的5' UTR-MCS-3' UTR;2916bp片段為酶切后的pGH載體，圖A泳道2為 P0K12-5' UTR-MCS-3^ UTR質(zhì)粒EcoRI、BamHI雙酶切鑒定示意圖，其中1117bp片段為 人工合成的5' UTR-MCS-3' UTR;2192bp片段為酶切后的p0K12載體。圖B是F1片段構(gòu) 建到P0K12-EMCV-5^ UTR-MCS-3' UTR載體酶切示意圖；圖B泳道1為PCR擴增6699bp的 F1片段；圖B泳道2為p0K12-rEMCV-HB10質(zhì)粒Hind III、Afe I雙酶切鑒定示意圖，其中 6699bp片段為F1片段，3170bp為載體片段。
[0018] 圖4是本發(fā)明實施例2中EMCV拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)感染BHK-21細胞的結(jié) 果圖；其中，圖A是親本毒HB10(EMCV-HB10-F5)感染BHK-21細胞引起病變示意圖；圖B是 本發(fā)明質(zhì)粒拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)感染BHK-21細胞引起病變示意圖；圖C為對照組正 常BHK-21細胞。
[0019] 圖5是本發(fā)明實施例2中拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)RT-PCR特異性鑒定結(jié)果 圖；其中，圖A是從親本毒（EMCV-HB10-F5)和本發(fā)明質(zhì)粒拯救病毒（rEMCV-HB10-F4)提取 RNA反轉(zhuǎn)錄擴增1D基因片段結(jié)果圖，圖B是本發(fā)明拯救病毒特異性分子標簽位置示意圖； p0K12-rEMCV-HB10質(zhì)粒測序序列中的編碼1D基因區(qū)域處存在兩個A1909G、G2059C核苷酸 突變；
[0020] 圖6是本發(fā)明實施例2中親本毒株（EMCV-HB10-F5)和拯救病毒（rEMCV-HB10-F4) 的VP1表達水平結(jié)果圖；
[0021] 圖7是本發(fā)明實施例2中拯救病毒的IFA檢測結(jié)果圖；其中，圖A為親本毒F5 代（EMCV-HB10-F5)感染BHK-21細胞的IFA示意圖，圖B為本發(fā)明質(zhì)粒拯救病毒F4代 (rEMCV-HBl-F4)感染BHK-21細胞的IFA示意圖；圖C為未感染EMCV的正常BHK-21細胞。
[0022] 圖8是本發(fā)明實施例2中拯救病毒株rEMCV-HB10-F4和親本株EMCV-HB10-F5的 生長曲線比較示意圖。

【具體實施方式】
[0023] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0024] 在以下實施例中，涉及的材料、試劑、引物合成如下所示，以下實施例中未提供具 體操作過程的，均為依照所購產(chǎn)品的使用說明進行操作，不再贅述。
[0025] 1、生物材料
[0026] EMCV HB10病毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室提供，其 第5代病毒（EMCV-HB10-F5)用于本發(fā)明；低拷貝載體p0K12由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī) 研究所國家重點實驗室提供；菌株E. coli DH5a感受態(tài)細胞、細胞株和BHK-21細胞以及 PGH載體均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室保存。
[0027] 2、主要試劑
[0028] RiboMAX? Large ScaleRNA Production Systems_SP6andT7 購自 Promega 公 司；RNA 提取試劑 TRIzol Reagent、Superscript III First-Strand Synthesis System、 lipofectamine2000均購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司 產(chǎn)品；抗EMCV VP1蛋白的抗體由哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室提供。羊抗鼠 FITC-IgG 購自中山金橋公司。5' -UTR-MCS-3' UTR序列由博仕公司進行全基因合成于pGH載體上， 5' UTR-MCS-3^ UTR5' UTR序列如序列表SEQIDN0:1所示，其中PolyC的設(shè)計長 度為15nt，在上游中預(yù)先加入T7RNA聚合酶啟動子核心序列。
[0029] 3、引物的設(shè)計及合成
[0030] 根據(jù)EMCV HB10全基因序列，用Primer5軟件設(shè)計了 5條引物，引物由上海英俊合 成，如下表1所示：
[0031] 表1本研究所用的擴增和鑒定引物
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬腦心肌炎病毒HB10株cDNA感染性克隆質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1)根據(jù)EMCVHB10基因序列設(shè)計特異性的PCR引物： EMCV-F1-F :GACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTC(含 Hind III 酶切位點） EMCV-F1-R :TTAGCATTGAGGTCGCTGCACAAC (含 Afe I 酶切位點）； ⑵將合成的 EMCV5 ' UTR-MCS-3 ' UTR 片段用 EcoR I、BamH I 從 PGH-EMCV5' UTR-MCS-3' UTRR質(zhì)粒上酶切，回收純化產(chǎn)物與pOK12載體進行連接，得到質(zhì) 粒 pOKU-EMCV-S' UTR-MCS-3，UTR; (3)用特異引物EMCV-F1-F、EMCV-F1-R對EMCV基因的cDNA進行擴增，得到EMCV基因 組的 F1 片段，用 Hindlll、Afel 雙酶切 F1 片段和質(zhì)粒 P0K12-EMCV-5' UTR-MCS-3' UTR， 回收、連接，得到全長P〇K12-rEMCV-HB10克隆質(zhì)粒。
2. 如權(quán)利要求1所述的EMCV-HB10株感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟 (2) 中，所述合成的5' UTR-MCS-3' UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的EMCV-HB10株感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟 (3) 中，所述F1目的片段是EMCV-HB10株（序列號為GenBank:JQ864080.1)。
4. 權(quán)利要求1?3任一項所述的EMCV-HB10株cDNA感染性克隆質(zhì)粒在病毒拯救、病毒 致弱機理及利用該病毒的cDNA感染性克隆為載體插入不同病毒保護抗原基因，構(gòu)建不同 病毒的嵌合病毒來表達外源蛋白，以及由此開發(fā)出雙價或多價疫苗及其他可能的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK104232668SQ201410330789
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】翁長江, 崔尚金, 黃麗, 李江南 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所